景 鑫，王德琴 繆嫻靜

糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是最常見的糖尿病血管病變相關(guān)并發(fā)癥，是導(dǎo)致2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者發(fā)生腎功能衰竭，殘疾甚至死亡的常見原因[1-2]。有效辨別早期DN 患者，是盡早采取干預(yù)措施，保護患者腎功能，改善其預(yù)后的必要前提。但早期DN 發(fā)病隱匿，常見的腎功能損傷指標(biāo)在診斷早期DN 中的靈敏度不高，尋找可靠的指標(biāo)，有效診斷早期DN，在臨床中具有重要價值[3]。視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein,RBP)是一種由肝臟分泌的低分子量蛋白，正常情況下，RBP 排泄量較小，但當(dāng)腎小管受損，尿排泄量增多，其在反映DN 中具有一定價值[4]。隨著分子學(xué)的不斷進展，有研究發(fā)現(xiàn)，不少微小RNA(miRNA)參與DN 腎小管間質(zhì)纖維化以及腎小管損傷，在診斷早期DN 中也具有良好潛能[5]。為研究尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平聯(lián)合檢測在診斷早期DN 中的價值，我們開展了該研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 將醫(yī)院2019.01-2021.01 間收治的133 例T2DM 患者納為研究對象，并將同期50 例健康體檢合格者納為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡≥60 歲；②符合中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)會所制定的T2DM 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，口服葡萄糖耐量試驗中2 h血糖≥11.1mmol/L；③入組前3～6 個月內(nèi)連續(xù)進行3次尿白蛋白排出率（urinary albumin excretion rate,UAER）檢測；④對照組為健康體檢合格，未合并任何代謝性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)疾病者；②合并惡性腫瘤及感染性疾病者；③合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者。根據(jù)T2DM 患者24 h 尿蛋白排泄率(UAER)將其分為單純糖尿病組(T2DM 組，UAER≤30 mg/24 h，n=38)與早期DN 組(30 mg/24 h＜UAER≤300 mg/24 h，n=46)及臨床DN組（UAER＞300 mg/24 h，n=49），50例健康體檢合格者納為對照組，4 組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（HKL2022165），所有患者均簽署知情同意書。

表1 四組一般資料比較

1.2 方法

（1）采集被研究者24 h 尿，日立7600 檢測尿RBP水平，所有操作均嚴(yán)格遵照試劑盒相關(guān)步驟進行，尿RBP參考范圍：0～0.7 mg/mL。

（2）采集被研究者外周靜脈血2 mL，3000 r/min離心15 min，取上清液，檢測血清microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平。提取RNA 及逆轉(zhuǎn)錄：取200 μL 血清，按照德國GiaGen 公司生產(chǎn)的miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑盒相關(guān)說明進行總RNA 提取，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit cDNA 合成試劑盒(ABI 公司生產(chǎn))相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)合成cDNA，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待用。采用ABI 公司生產(chǎn)的TaqMan-PCR 檢測試劑盒TaqMan Universal Master Mix Ⅱ檢測血清microRNA-183 及microRNA-93-5p水平。microRNA-183引物上游序列：5’-CCTTCACTTTCAGGGTCGAG-3’，下游序列：5’-CAGTTTGGGACCCCTTTACA-3’。microRNA-93-5p 引物上游序列：5’-AGTCTCTGGCTGACTACATCACAG-3’，下游序列：5’-CTACTCACAAAACAGGAGTGGAATC-3’。內(nèi)參U6 上游序列：5’-CACGGCAAATTCAACGGCACAG-3’，下游引物序列為：5’-AGACACCAGTAGCATCCACGAC-3’。引物均由上海生物工程有限公司合成。

PCR 反應(yīng)總體5 μL，包括1×TaqMan Universal Master Mix Ⅱ、1×TaqMan 探針與引物以及15 ng cDNA，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃15 s，60 ℃1 min，50 個循環(huán)，每個樣本PCR 反應(yīng)重復(fù)3次，設(shè)立陽性、陰性以及空白對照，監(jiān)控檢測質(zhì)量，U6 作為內(nèi)參，分析血清microRNA-183 及microRNA-93-5p相對表達水平。

1.3 觀察指標(biāo)（1）比較四組腎功能相關(guān)指標(biāo)；（2）比較四組尿RBP、血清microRNA-183及microRNA-93-5p水平；（3）分析血清microRNA-183及microRNA-93-5p 水平與腎功能指標(biāo)之間的相關(guān)性；（4）繪制受試者工作特征曲線(receiver operatingchara cteristic,ROC)，分析尿RBP、血清microRNA-183 及microRNA-93-5p在診斷早期DN中的價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較使用單方差分析，檢驗有意義者，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析，繪制ROC，并使用約登指數(shù)公式計算最佳臨界值，評價UACR、尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 診斷早期DN 的性能，采用二元logistic 回歸分析得出聯(lián)合預(yù)測因子，分析各指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用在診斷早期DN中的價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組一般資料比較 四組性別、年齡、血壓、體質(zhì)量指數(shù)等基線資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 四組尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比較 與對照組、T2DM 組、早期DN 組比較，臨床DN 組患者UACR水平顯著升高（P＜0.05）。與對照組、T2DM組比較，早期DN組患者UACR水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 四組研究對象尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比較()

表2 四組研究對象尿白蛋白/尿肌酐（UACR）水平比較()

與對照組比較，aP＜0.05；與T2DM 組比較，bP＜0.05；與早期DN 組比較，cP＜0.05。

2.3 四組尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p水平比較

對照組和T2DM 組尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組尿RBP 水平均低于早期DN 組及臨床DN 組，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平均高于早期DN 組及臨床DN 組，且早期DN 組尿RBP水平均低于臨床DN 組，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平均高于臨床DN 組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 四組尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p水平比較()

表3 四組尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p水平比較()

與對照組比較，aP＜0.05，與T2DM 組比較，bP＜0.05，與早期DN 組比較，cP＜0.05

2.4 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平與UACR 間的關(guān)系分析 相關(guān)性分析提示，尿RBP 與UACR 水平之間呈正相關(guān)（P＜0.05），血microRNA-183 及microRNA-93-5p 水平與UACR之間呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

表4 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平與UACR的關(guān)系分析

2.5 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平在診斷早期DN 中的價值分析 將對照組、早期DN 患者和單純糖尿病患者的數(shù)據(jù)進行研究，繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，尿RBP、血microRNA-183及microRNA-93-5p 在診斷早期DN 中的AUC 均超過0.75，且尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 三者聯(lián)合應(yīng)用可有效提高各指標(biāo)單獨應(yīng)用時的效能，提高早期DN診斷效果。見表5。

表5 尿RBP、血microRNA-183、microRNA-93-5p水平在診斷早期DN中的價值分析

3 討論

早期DN 對腎臟的損傷是可逆的，但一旦錯過早期可逆的治療機會，腎功能將不斷惡化，故早期DN 的診斷在改善患者預(yù)后中具有重要的意義。UACR 是目前診斷DN 的常見指標(biāo)，但其準(zhǔn)確率不高[7]。此外，隨機尿的白蛋白/肌酐比值UACR 是診斷糖早期尿病腎病的相對較為通用的指標(biāo)，但是在診斷腎功能損傷中的價值有限[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，早期DN 組患者UACR 水平與對照組及T2DM 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而臨床DN 組患者UACR 水平明顯高于早期DN 組患者。然而，根據(jù)繪制的ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，UACR 指標(biāo)在診斷早期DN中的效能反而不高。

尋找新型、靈敏，可用于診斷早期DN的指標(biāo)已成為目前研究的重點。RBP主要由肝細胞合成，主要負責(zé)將視黃醇從肝細胞轉(zhuǎn)移至上皮細胞，血漿內(nèi)RBP主要以與甲狀腺素結(jié)合蛋白結(jié)合為高分子蛋白質(zhì)復(fù)合物形式存在，其排泄量微小，但當(dāng)腎小管受損后，其排泄量將劇增[12-13]。本文中，T2DM 組及對照組RBP水平相似，但早期DN及臨床DN患者尿RBP水平明顯升高，且臨床DN患者尿RBP水平更高，提示尿RBP 在反映患者腎臟損傷，診斷早期DN 中具有重要意義[14]。繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，尿RBP在診斷早期DN中的AUC=0.786，診斷效能較高。

miRNA是一種小分子非編碼RNA，參與多種生理及病理過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-133b、miR-342等在早期預(yù)測腎功能損傷中的價值優(yōu)于MAU。且不少miRNA參與腎小球及腎小管損傷[15-16]。microRNA-183 屬于miR-183 家族，由7 號染色體轉(zhuǎn)錄而來，與多種惡性腫瘤間存在密切聯(lián)系。Qi等[17]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-183 可抑制狼瘡性腎炎小鼠腎纖維化及炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腎功能保護功效。Yang等[18]研究表示，microRNA-93-5p 表達增加可降低CDKN1A，抑制DN 小鼠腎間質(zhì)纖維化，提示microRNA-93-5p表達上調(diào)在保護腎臟中具有價值。本研究發(fā)現(xiàn)，早期DN 以及臨床DN 患者血microRNA-183 及microRNA-93-5p 及水平明顯低于對照組以及單純T2MD 患者，且DN 患者血microRNA-183 及血microRNA-93-5p水平與UACR 水平均呈負相關(guān)，繪制ROC 曲線提示，血microRNA-183 及microRNA-93-5p 在診斷早期DN 中的效能較高，其AUC 均超過0.75，分別為0.790與0.818，且尿RBP、血microRNA-183、血microRNA-93-5p聯(lián)合應(yīng)用在診斷早期DN中的AUC最大，為0.939，95%CI為(0.877～1.000)。

綜上所述，尿RBP、血microRNA-183 及microRNA-93-5p 在診斷早期DN 中的效能均高于UACR，可成為診斷早期DN的潛在指標(biāo)。