王 丹，吳丹心，杜金鳳

(湖北省十堰市太和醫(yī)院腫瘤科 442000)

結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在全部惡性腫瘤中分別位居第3位和第5位[1]。 化療是結(jié)直腸癌的常用治療方法，但目前結(jié)直腸癌細(xì)胞易對(duì)化療藥物如奧沙利鉑(L-OHP)產(chǎn)生耐藥性，常導(dǎo)致化療失敗[2]。因此，探究影響結(jié)直腸癌耐藥性的分子機(jī)制對(duì)逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥性進(jìn)而提高治療療效、改善患者預(yù)后具有重大意義。瞬時(shí)受體電位通道M2反義RNA(TRPM2-AS)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)，其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)與TAF15直接相互作用增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力[3]，但其對(duì)耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性表型的影響及機(jī)制尚未可知。Starbase靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件顯示，TRPM2-AS可能靶向結(jié)合miR-22-3p。上調(diào)miR-22-3p可明顯阻礙結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。本研究通過(guò)構(gòu)建耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-8/L-OHP，旨在觀察TRPM2-AS對(duì)HCT-8/L-OHP增殖和凋亡的影響及其能否靶向miR-22-3p發(fā)揮作用，以期為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對(duì)L-OHP的耐藥性提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-8購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；PCR引物、TRPM2-AS小干擾RNA(si-TRPM2-AS)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、miR-22-3p 模擬物(mimics)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)、miR-22-3p抑制劑(anti-miR-22-3p)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(cleaved-caspases-3)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建HCT-8/L-OHP細(xì)胞

參照文獻(xiàn)[5]方法，復(fù)蘇HCT-8細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期HCT-8細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，用含2 μmol/L L-OHP培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，傳代。再次用含2 μmol/L L-OHP培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，傳代。重復(fù)上述步驟，1個(gè)濃度反復(fù)3～4次，逐步將L-OHP濃度提高至20 μmol/L，最終獲得能耐受20 μmol/L L-OHP的細(xì)胞株，并將其維持培養(yǎng)在含10 μmol/L L-OHP的完全培養(yǎng)液中，得到能夠在含10 μmol/L L-OHP的完全培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)的人結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株HCT-8/L-OHP。

1.2.2RT-qPCR法檢測(cè)TRPM2-AS和miR-22-3p表達(dá)

將HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2次，RNA抽提試劑提取細(xì)胞中總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：TRPM2-AS上游引物5′-CGTGACCAGGTTCAGACACA-3′，下游引物5′-TGGGCAGTTTGGTTCTGGTT-3′；GAPDH上游引物5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，下游引物5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′；miR-22-3p上游引物5′-AAGCTGCCAGTTGAA GAACTGTA-3′，下游引物5′-GCTGTCAACGATA CGCTACGTAAC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中TRPM2-AS、miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3HCT-8/L-OHP細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HCT-8/L-OHP細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×105/孔。培養(yǎng)12 h后，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC(si-NC組)、si-TRPM2-AS(si-TRPM2-AS組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-22-3p mimics(miR-22-3p組)、anti-miR-22-3p(anti-miR-22-3p組)、共轉(zhuǎn)染si-TRPM2-AS與anti-miR-22-3p(si-TRPM2-AS+anti-miR-22-3p組)。轉(zhuǎn)染24 h后，換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h后，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中TRPM2-AS或miR-22-3p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.2，并收集細(xì)胞備用。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(con組)，細(xì)胞不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞接種至96孔板中，2.5×104/孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，在各孔中加10 μL CCK-8。孵育2 h后，酶標(biāo)儀(λ=450 nm)檢測(cè)光密度(OD)值。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×104/孔，每2天更換1次新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)14 d后棄培養(yǎng)液。4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。PBS清洗，顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。將各組細(xì)胞PBS清洗2次，1 000 r/min離心5 min后，棄上清液。加500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加5 μL PI，混合均勻，室溫避光孵育5 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7Western blot檢測(cè)細(xì)胞中cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

將各組細(xì)胞接種至6孔板中，1.0×105/孔，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA法檢測(cè)蛋白含量后，對(duì)其定量。然后行10% SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用cleaved-caspase3(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗孵育液在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗在37 ℃搖床中孵育1 h。再次洗膜后，加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析cleaved-caspase3相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

利用Starbase網(wǎng)站對(duì)TRPM2-AS和miR-22-3p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)將其結(jié)合位點(diǎn)突變，分別構(gòu)建含有結(jié)合位點(diǎn)、突變位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告基因載體 (Wt-TRPM2-AS)與突變型載體(Mut-TRPM2-AS)，該過(guò)程由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將HCT-8/L-OHP細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染miR-22-3p mimics與Wt-TRPM2-AS、miR-NC與Wt-TRPM2-AS，轉(zhuǎn)染12 h后，換為含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并裂解。經(jīng)3 500 r/min離心5 min后，取上清液，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HCT-8/L-OHP細(xì)胞中TRPM2-AS和miR-22-3p表達(dá)

HCT-8/L-OHP細(xì)胞中TRPM2-AS表達(dá)明顯高于HCT-8細(xì)胞(P<0.05)，而miR-22-3p表達(dá)明顯低于HCT-8細(xì)胞(P<0.05)。

2.2 沉默TRPM2-AS對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

si-TRPM2-AS組細(xì)胞中TRPM2-AS表達(dá)明顯低于si-NC組及con組(P<0.05)，沉默TRPM2-AS的HCT-8/L-OHP細(xì)胞構(gòu)建成功。con組、si-NC組和si-TRPM2-AS組細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)、OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)、細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與con組和si-NC組比較，si-TRPM2-AS組細(xì)胞中OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)降低(P<0.05)，而miR-22-3p表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：si-TRPM2-AS轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證；B：各組細(xì)胞miR-22-3p表達(dá)；C：各組細(xì)胞cleaved-caspase3蛋白表達(dá)；D：各組細(xì)胞凋亡情況；E：各組細(xì)胞增殖活性；F：各組細(xì)胞克隆形成情況；*:P<0.05,與con組比較;#：P<0.05，與si-NC組比較。圖1 沉默TRPM2-AS后HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡情況

2.3 過(guò)表達(dá)miR-22-3p對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

miR-22-3p組細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)明顯高于miR-NC組及con組(P<0.05)，過(guò)表達(dá)miR-22-3p的HCT-8/L-OHP細(xì)胞構(gòu)建成功。con組、miR-NC組和miR-22-3p組細(xì)胞OD48 h/72 h值、克隆形成數(shù)、細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與con組和miR-NC組比較，miR-22-3p組細(xì)胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)降低(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A：miR-22-3p mimics轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證；B：各組細(xì)胞增殖活性；C：各組cleaved-caspase3蛋白表達(dá)；D：各組細(xì)胞凋亡情況；E：各組細(xì)胞克隆形成情況；*：P<0.05，與con組比較;#：P<0.05，與miR-NC組比較。圖2 過(guò)表達(dá)miR-22-3p對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.4 TRPM2-AS和miR-22-3p靶向關(guān)系驗(yàn)證

Starbase靶基因在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件顯示，TRPM2-AS和miR-22-3p的核苷酸序列存在連續(xù)結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3A。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-22-3p與Wt-TRPM2-AS共轉(zhuǎn)染后HCT-8/L-OHP細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與Mut-TRPM2-AS共轉(zhuǎn)染后HCT-8/L-OHP細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，TRPM2-AS可與miR-22-3p靶向結(jié)合，見(jiàn)圖3B。

A：TRPM2-AS和miR-22-3p的互補(bǔ)序列；B：熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果。圖3 TRPM2-AS靶向結(jié)合miR-22-3p

2.5 抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)沉默TRPM2-AS對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

anti-miR-22-3p組細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)明顯低于con組(P<0.05)，抑制miR-22-3p表達(dá)的HCT-8/L-OHP細(xì)胞構(gòu)建成功。與con組比較，anti-miR-22-3p組細(xì)胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與si-TRPM2-AS組比較，si-TRPM2-AS+anti-miR-22-3p組細(xì)胞OD48 h/72 h值和克隆形成數(shù)升高(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：anti-miR-22-3p轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證；B：各組細(xì)胞增殖活性；C：各組cleaved-caspase3蛋白表達(dá)；D：各組細(xì)胞凋亡情況；E：各組細(xì)胞克隆形成情況；*：P<0.05，與con組比較;#：P<0.05，與si-TRPM2-AS組比較。圖4 抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)沉默TRPM2-AS對(duì)HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討 論

化療是結(jié)直腸癌臨床治療的常用方法，但由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生降低了化療療效，最終導(dǎo)致化療失敗。L-OHP是結(jié)直腸癌化療的一線(xiàn)藥物，降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的化療抗性對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。lncRNA在真核生物中廣泛存在，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞化療抗性。研究表明，lncRNA MIR600HG、lncRNA PVT1-214等多種lncRNA參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞L-OHP耐藥性，為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞L-OHP耐藥性提供了分子靶點(diǎn)[6-7]。

瞬時(shí)受體電位通道M2(TRPM2)是瞬時(shí)受體電位通道M型的一個(gè)亞型，在神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、免疫細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛表達(dá)。研究顯示，TRPM2是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激感受器，參與調(diào)控活性氧生成、炎癥因子的產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞功能[8]。TRPM2-AS是TRPM2的反義RNA，屬于lncRNA家族成員，其對(duì)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程具有重要調(diào)控作用。研究顯示，TRPM2-AS可促進(jìn)胃癌[9]、肝癌[10]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[11]、乳腺癌[12]、非小細(xì)胞肺癌[13]等腫瘤細(xì)胞的惡性表型，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。此外，TRPM2-AS在肺癌順鉑耐藥細(xì)胞A549/DDP中表達(dá)升高，敲低其表達(dá)可增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為肺癌提供了新的治療靶點(diǎn)[14]。然而，還未見(jiàn)TRPM2-AS影響結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP耐藥性的相關(guān)報(bào)道。

本研究主要探究了TRPM2-AS對(duì)耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示，TRPM2-AS在耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默其表達(dá)阻礙了耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)加劇其細(xì)胞凋亡，提示TRPM2-AS可作為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對(duì)L-OHP耐藥性的分子靶點(diǎn)。caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其中caspase3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其在受到上游凋亡信號(hào)刺激后被活化，生成cleaved-caspase3，進(jìn)而執(zhí)行細(xì)胞凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，沉默TRPM2-AS促進(jìn)了耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞中cleaved-caspase3蛋白表達(dá)，提示TRPM2-AS可能通過(guò)直接或間接調(diào)控caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)影響耐L-OHP結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探究TRPM2-AS影響耐L-OHP結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制，本研究證實(shí)了TRPM2-AS可靶向結(jié)合miR-22-3p，且沉默TRPM2-AS促進(jìn)細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)，說(shuō)明TRPM2-AS靶向負(fù)調(diào)控miR-22-3p。研究顯示，miR-22-3p可分別通過(guò)抑制YWHAZ、NFIB和YAP1的表達(dá)來(lái)減弱結(jié)直腸癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性表型，對(duì)腫瘤發(fā)展起抑制作用[17-19]；miR-22-3p在耐L-OHP的胃癌組織和細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，上調(diào)miR-22-3p可降低胃癌細(xì)胞L-OHP的耐藥性，miR-22-3p可作為逆轉(zhuǎn)胃癌對(duì)L-OHP耐藥性的分子靶點(diǎn)[20]。本研究結(jié)果顯示，耐L-OHP結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-22-3p降低了細(xì)胞的增殖能力，并加劇了其凋亡，而抑制miR-22-3p具有相反作用，這提示miR-22-3p也參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性，其也可能成為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對(duì)L-OHP耐藥性的分子靶點(diǎn)。本研究還顯示，抑制miR-22-3p逆轉(zhuǎn)了沉默TRPM2-AS對(duì)L-OHP結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步提示TRPM2-AS可能通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控miR-22-3p來(lái)調(diào)控耐L-OHP結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，TRPM2-AS在耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)升高，而miR-22-3p表達(dá)降低；沉默TRPM2-AS可阻礙耐L-OHP的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-22-3p有關(guān)，TRPM2-AS/miR-22-3p軸可能為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌對(duì)L-OHP的耐藥性提供了分子靶點(diǎn)。但本研究尚存在不足之處，尚需對(duì)miR-22-3p下游靶基因及信號(hào)通路進(jìn)行探究，且需要進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證TRPM2-AS/miR-22-3p軸對(duì)結(jié)直腸癌L-OHP耐藥性的影響。