劉 瑋，李 琳，劉佳妮，石 晶，洪 畋，陳秀娟，葛小金

(湖北省武漢市中心醫(yī)院老年科 430014)

Klotho基因是KURO-O等[1]在1997年新發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的基因，Klotho的基因敲除小鼠可出現(xiàn)類似人類衰老的各種表現(xiàn)，比如壽命縮短、骨質(zhì)疏松、動脈硬化、皮膚萎縮等。Klotho基因位于第13號染色體上，根據(jù)基因結(jié)構(gòu)的差異，可以表達(dá)分泌型Klotho及膜型Klotho兩種蛋白;膜型Klotho蛋白是由全部Klotho基因編碼生成的，定位于細(xì)胞膜上的一種單鏈跨膜蛋白，其胞外區(qū)部分可以被水解脫落從而生成分泌型Klotho蛋白。除此之外，分泌型Klotho蛋白也可由Klotho信使RNA的可變修飾來生成[2]。分泌型Klotho能與多種信號通路相互作用[3-4]，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的代謝及細(xì)胞活性等過程。研究表明，Klotho基因與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)密切相關(guān)，具有一定的抗AS作用[5-9]。筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)，可溶性Klotho蛋白能夠抑制THP-1泡沫細(xì)胞形成[10]，但信號通路尚不明確。

激活的Wnt信號通路參與心臟發(fā)育、AS、心力衰竭、心肌肥厚和血管發(fā)育與再生等[11-12]。早在2007年國外的研究就發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白的胞外部分可結(jié)合多種Wnt配基，抑制Wnt信號通路的激活[13]。最近CHEN等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，Klotho基因可能部分通過抑制Wnt/β-catenin信號通路減少血管平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)的鈣化，從而發(fā)揮抗AS作用。本文探討Wnt/β-catenin信號通路在可溶性Klotho蛋白抑制THP-1泡沫細(xì)胞過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1單核細(xì)胞株購自美國ATCC公司；佛波酯(PMA)購自美國Gene Operation公司；油紅O、β-甘油磷酸二鈉鹽水合物購自美國Sigma公司；細(xì)胞膽固醇檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自美國Ambion公司；β-catenin、c-myc與cyclinD1 抗體購自美國Abcam公司；β-actin 抗體購自美國CST公司；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗、FITC標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

THP-1單核細(xì)胞株按說明書進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，加入含160 nmol/L PMA的低血清培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞是否貼壁，確定THP-1單核細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為THP-1巨噬細(xì)胞。然后加入80 mg/L ox-LDL的低血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察THP-1泡沫細(xì)胞形成[15]。將細(xì)胞分為陰性對照組(THP-1巨噬細(xì)胞組)、陽性對照組(THP-1泡沫細(xì)胞組)、Klotho蛋白組(THP-1巨噬細(xì)胞加入100 ng/L的可溶性Klotho蛋白預(yù)處理后2 h后，再按照陽性對照組程序操作)、β-甘油磷酸組(THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)20 mmol/L的β-甘油磷酸作用24 h后，按照陽性對照組程序操作)、Klotho蛋白+β-甘油磷酸組(THP-1巨噬細(xì)胞經(jīng)20 mmol/L的β-甘油磷酸作用24 h后，按照Klotho蛋白組程序操作)。

1.2.2油紅O染色

各組細(xì)胞分別用4%多聚甲醛固定10～15 min，油紅O染色液染色10 min后，用蘇木素染液復(fù)染2～3 min，雙蒸水沖洗并封片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈紅色，而細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)水平的測定

離心法收集各組細(xì)胞，PBS漂洗3次，超聲破碎細(xì)胞，采用酶熒光學(xué)法分別測定細(xì)胞內(nèi)TC和FC水平。CE即為TC與FC的差值。CE與TC的比值達(dá)到50%以上的細(xì)胞可被認(rèn)為已轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。

1.2.4Western blot法檢測β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白表達(dá)

離心法收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定各組細(xì)胞總蛋白的濃度，9%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，每孔的上樣量為20 μg，轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入Ⅰ抗及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，滴入ECL顯影液進(jìn)行熒光顯色，將膜置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測。實驗結(jié)果采用TANON GIS軟件進(jìn)行分析并讀取條帶灰度值；將各組的β-catenin、c-myc和cyclinD1分別與相應(yīng)β-actin的面積灰度值進(jìn)行比較，二者的比值代表β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平。

1.2.5免疫熒光法檢測β-catenin表達(dá)及分布

細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定15 min，PBS充分沖洗，Triton-X 100透膜20 min，5% BSA，37 ℃封閉1 h，加Ⅰ抗稀釋液，4 ℃過夜，加Ⅱ抗稀釋液，37 ℃孵育1 h，4′6-二脒基-2-苯 基 吲 哚(DAPI) 孵育5 min，抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察。通過Nikon C2激光共聚焦顯微鏡拍照，NIS Elements AR圖像系統(tǒng)采集分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組THP-1泡沫細(xì)胞形成情況

油紅O染色觀察到，陰性對照組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴較少，而陽性對照組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可觀察到較多的紅色脂滴，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。與陽性對照組相比，Klotho蛋白組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴數(shù)量明顯減少；β-甘油磷酸組細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色脂滴蓄積，細(xì)胞泡沫化程度超過陽性對照組；Klotho蛋白+β-甘油磷酸組與β-甘油磷酸組細(xì)胞相比，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴明顯減少，見圖1。

A：陰性對照組；B：陽性對照組；C： Klotho蛋白組；D：β-甘油磷酸組；E：Klotho蛋白+β-甘油磷酸組。圖1 各組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴的變化(×400)

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)TC、FC和CE水平

陰性對照組細(xì)胞內(nèi)CE/TC<50%，而在陽性對照組中CE/TC>50%，符合泡沫細(xì)胞的生化特征。與陽性對照組相比，Klotho蛋白組細(xì)胞內(nèi)TC、CE的水平均明顯降低，β-甘油磷酸組細(xì)胞內(nèi)TC、CE水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與β-甘油磷酸組相比，Klotho蛋白+β-甘油磷酸組細(xì)胞內(nèi)TC、CE水平明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組TC、FC和CE水平

2.3 各組β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)

與陰性對照組相比，陽性對照組的β-catenin、c-myc與cyclinD1的蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05)。與陽性對照組相比，Klotho蛋白組β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯減少，β-甘油磷酸組β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)水平明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Klotho蛋白+β-甘油磷酸組與β-甘油磷酸組細(xì)胞相比，β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)水平均明顯減少(P<0.05),見表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)

A：陰性對照組；B：陽性對照組；C： Klotho蛋白組；D：β-甘油磷酸組；E：Klotho蛋白+β-甘油磷酸組。圖2 各組細(xì)胞β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白印跡圖

2.4 各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)及分布情況

與陰性對照組相比，陽性對照組細(xì)胞內(nèi)的β-catenin表達(dá)和分布明顯增加(P<0.05)。與陽性對照組相比，Klotho蛋白組細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)和分布明顯減少，β-甘油磷酸組β-catenin表達(dá)和分布明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Klotho蛋白+β-甘油磷酸組與β-甘油磷酸組細(xì)胞相比，β-catenin的表達(dá)和分布明顯減少(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)和分布(×400)

3 討 論

近年來的研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路參與了AS的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。在BEDEL等[16]對人類頸動脈AS斑塊的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵分子β-catenin在破裂斑塊中的表達(dá)水平明顯高于穩(wěn)定斑塊；而在另一個頸動脈AS斑塊相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因產(chǎn)物Dickkopf相關(guān)蛋白1(DKK1)在其中的表達(dá)也是增高的[17]。證實了在人類AS病變中，Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子的表達(dá)增高。而且，有研究表明DKK1是冠狀動脈AS的新型生物標(biāo)志物之一[18]。氧化應(yīng)激在AS發(fā)生、發(fā)展過程中扮演了重要的角色，研究表明，氧化應(yīng)激能激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)血管鈣化，而阻斷該通路可抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[19]。Wnt/β-catenin信號通路還參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，其下游的轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子β-catenin/TCF能抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起內(nèi)膜增厚，在血管重塑方面發(fā)揮重要作用[20]。上述研究表明，Wnt/β-catenin信號通路從多方面多角度深入?yún)⑴c了AS形成的病理生理過程。

在對衰老小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，Klotho基因缺失引起Wnt信號通路的激活并觸發(fā)了細(xì)胞老化，說明Klotho基因?qū)nt信號通路具有一定的調(diào)節(jié)作用[13]。體外實驗也證實，可溶性Klotho蛋白對心肌細(xì)胞和RTC細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號通路具有抑制作用[21-22]。在阿霉素誘導(dǎo)腎損傷模型中，隨著腎損傷時間的延長，腎組織可溶性Klotho蛋白表達(dá)逐漸減少，而β-catenin的表達(dá)卻逐漸增多，且二者呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，可溶性Klotho蛋白一方面能與免疫標(biāo)記的Wnt1、Wnt4或Wnt7a等結(jié)合形成復(fù)合物;另一方面Klotho基因也直接抑制了β-catenin的核內(nèi)移位[23]，說明Klotho基因可能通過干擾Wnt和β-catenin的作用使經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路失活。

筆者前期的研究表明，外源性可溶性Klotho蛋白可能通過調(diào)控THP-1巨噬細(xì)胞內(nèi)ACAT1及ABCA1的表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)CE的蓄積，增加膽固醇的流出，從而抑制THP-1泡沫細(xì)胞形成[10]，但其中的信號通路并不清楚。本研究顯示：可溶性Klotho蛋白能下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵分子β-catenin、c-myc與cyclinD1蛋白表達(dá)，而Wnt/β-catenin信號特異性激動劑β-甘油磷酸能阻斷或部分阻斷可溶性Klotho蛋白對THP-1泡沫細(xì)胞形成的抑制。而且，細(xì)胞免疫熒光染色觀察到，可溶性Klotho蛋白能抑制THP-1泡沫細(xì)胞內(nèi)β-catenin的分布和表達(dá)。說明可溶性Klotho蛋白能抑制泡沫細(xì)胞形成過程中Wnt/β-catenin信號通路的活化。

綜上所述，可溶性Klotho蛋白可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，減少細(xì)胞內(nèi)CE的蓄積，從而抑制泡沫細(xì)胞的形成。