葛子靖，王莘智，徐豫湘，范伏元，田 英，劉 丹

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一類自身免疫性疾病，具有極高的致殘率[1]。主流觀點(diǎn)認(rèn)為，免疫細(xì)胞、因子都對RA的發(fā)展有決定性的影響[2]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)無疑是RA基礎(chǔ)研究及防治的關(guān)鍵核心[3]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。自噬可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的存活及分化，并在T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。PTPN22是維持T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，且可調(diào)節(jié)自噬依賴性的免疫因子的釋放[3]。研究發(fā)現(xiàn)，TRAF3可通過PTPN22調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號通路[4]。根據(jù)上述研究成果進(jìn)行合理地推測，RA的發(fā)病機(jī)制可能是TRAF3/PTPN22信號通路表達(dá)異常，影響B(tài)eclin1介導(dǎo)的T細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而誘發(fā)RA的發(fā)生。通痹顆粒對“氣血虧虛、寒濕痹阻”型RA患者療效顯著；實(shí)驗研究表明其能改善患者中醫(yī)證候，并能減少血清血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平[5-7]。本研究試從T細(xì)胞自噬角度闡明通痹顆粒治療RA的作用機(jī)制，為中藥防治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物：Wistar大鼠：雄性，平均體重(1000±20) g，鼠齡 8～10周，清潔級。從上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司購買。

1.1.2 實(shí)驗藥物：受試中藥為通痹顆粒，由當(dāng)歸、全蝎、沒藥、白芍、乳香、川芎、桂枝、黃芪、僵蠶、黃柏等組成，來源于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，屬院內(nèi)制劑。制備方法：取通痹顆粒6 g，用10 ml無菌0.9%氯化鈉溶液溶解，搖勻，制成0.6 g/ml藥液，放至4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

西藥陽性藥：雷公藤多苷片(濃度1 mg/ml)，灌胃，劑量8.75 ml/kg，1次/d，連續(xù)16 d。

1.1.3 主要試劑：完全弗氏佐劑 (CFA) ，購于 Sigma公司(批號:SLBQ1106 V)。Beclin1自噬信號Vps34的阻斷劑3-MA，可購于Sigma公司。TNF-α、TGF-β、IL-1試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。TRAF3、PTPN22和Beclin1抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 造模與分組：采用CFA的方法復(fù)制RA大鼠模型。除正常組外，其余大鼠均向右后足墊部皮內(nèi)注射CFA 0.15 ml。24 h后大鼠右足踝部出現(xiàn)急性炎性腫脹，48 h后大鼠足致炎側(cè)、非致炎側(cè)或雙側(cè)前肢關(guān)節(jié)有腫脹，有的大鼠甚至耳、尾部出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)，在致炎7 d后注射第2次，8～12 d則制成佐劑性關(guān)節(jié)炎模型[8],致炎后淘汰造模不成功大鼠，選取病變明顯大鼠 48只適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，根據(jù)體重隨機(jī)分為五組，即：RA模型組(灌胃0.9%氯化鈉溶液)、雷公藤多苷組(灌胃雷公藤多苷藥液)、通痹顆粒組(灌胃通痹顆粒藥液)、3-MA組(灌胃Beclin1自噬信號Vps34的阻斷劑3-MA)、聯(lián)合組(同時灌胃Beclin1自噬信號Vps34的阻斷劑3-MA和通痹顆粒藥液)，另設(shè)正常對照組。治療組大鼠采用成人劑量的3倍用藥，2次/d，連續(xù)16 d。正常對照組以等容積的蒸餾水代替。16 d后處死各組大鼠，按要求留取血樣及組織作相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 樣本采集與指標(biāo)檢測：①大鼠整體指標(biāo)評價采用千分卡尺測量每組后足跖厚度，每3 d檢查大鼠并記錄和分析數(shù)據(jù)，全面評估大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和后爪關(guān)節(jié)腫脹度。②血液學(xué)檢測：治療16 d后所有大鼠斷頭取血分離血清備測，采用懸液芯片檢測大鼠血清中細(xì)胞因子IL-1、TGF-β、TNF-α的含量。檢測流程嚴(yán)格按照懸液芯片檢測操作流程進(jìn)行。③信號通路相關(guān)蛋白和基因的檢測：取關(guān)節(jié)滑膜組織30 mg，加入200 μl 蛋白裂解液徹底混勻。冰上組織裂解 15 min，勻漿后離心 10 min。取上清，用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，將各樣本蛋白濃度調(diào)整至相同，將定量好的各樣本按1∶1比例加入上樣緩沖液混勻，煮沸變性 5 min 后保存于-20 ℃ 備用。采用Western blot技術(shù)檢測TRAF3基因和PTPN22、Beclin1蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗和組間方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠右足跖厚度比較 見表1。治療后各治療組大鼠右足跖厚度均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較大鼠右足跖厚度均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。聯(lián)合組大鼠右足跖厚度明顯低于其他治療組(P<0.05)。

2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較 見表2。治療后各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異，聯(lián)合組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于其他治療組(P<0.05)。

2.3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比較 見表3。治療后各治療組血清IL-1、TNF-α水平均低于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較，大鼠血清IL-1、TNF-α水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，聯(lián)合組血清IL-1、TNF-α水平均明顯低于其他治療組。治療后各治療組血清TGF-β水平均高于RA模型組(P<0.05)。雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組三組之間比較,大鼠血清TGF-β水平均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05) ，聯(lián)合組血清TGF-β水平均明顯高于其他治療組(P<0.05)。

表3 大鼠血清IL-1、TNF-α、TGF-β水平比較

2.4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和Beclin1蛋白表達(dá)比較 見表4。與正常對照組比較，RA模型組TRAF3基因表達(dá)水平下調(diào)，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)。與RA模型組相比，雷公藤多苷組、3-MA組、通痹顆粒組TRAF3基因表達(dá)水平上調(diào)，PTPN22蛋白Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)，三組之間比較，各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)。聯(lián)合組滑膜組織TRAF3蛋白表達(dá)水平與其他治療組相比上調(diào)，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。

表4 大鼠TRAF3基因、PTPN22和

3 討 論

T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)是RA基礎(chǔ)研究及防治的關(guān)鍵核心。T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是指外周T 細(xì)胞通過細(xì)胞存活及增殖等來維持自身數(shù)目平衡，從而行使正常的免疫功能，當(dāng)T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化可影響RA的發(fā)生和發(fā)展[9-10]。T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)對免疫系統(tǒng)發(fā)揮正常功能、抵制病原體至關(guān)重要。機(jī)體通過調(diào)控T細(xì)胞的增殖與凋亡調(diào)節(jié)外周T細(xì)胞數(shù)目，以便T細(xì)胞群迅速響應(yīng)，識別并清除病原體[11-12]。RA患者T細(xì)胞免疫耐受降低并伴隨著其凋亡程度的減少[13]。

越來越多的研究提示自噬在T 細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。自噬可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的存活及分化，且與T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。自噬的增多或者降低可打破T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PTPN22基因是引發(fā)RA的關(guān)鍵原因[15-16]。PTPN22能夠編碼磷酸酶，通過將T細(xì)胞信號通路中的關(guān)鍵分子去磷酸化而抑制TCR的信號活性。PTPN22的降低導(dǎo)致NLRP3介導(dǎo)的 IL-1β分泌缺失，而PTPN22基因增加可以促進(jìn)炎性系統(tǒng)的激活[17]，同時，PTPN22以自噬依賴的方式調(diào)節(jié)NLRP3介導(dǎo)的IL-1β分泌。最新研究發(fā)現(xiàn)， TRAF3 可控制PTPN22 從胞質(zhì)向胞膜的轉(zhuǎn)移，并抑制PTPN22 在TCR復(fù)合物亞基中的去磷酸化[17-19]。Beclin1可與Vps34共同調(diào)節(jié)自噬體膜的合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。綜上所述， RA的發(fā)病機(jī)制可能是TRAF3/PTPN22信號通路表達(dá)異常，影響B(tài)eclin1介導(dǎo)的T細(xì)胞自噬，從而導(dǎo)致其穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)RA的發(fā)生。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”的范疇，《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，此言其外因。故《素問·評熱病論》指出：“風(fēng)雨寒熱，不得虛，不能獨(dú)傷人”，又指出：“不與風(fēng)寒濕氣合，故不為痹”。說明外因只是發(fā)病的條件，內(nèi)因才是發(fā)病的根本原因[21]。因此，RA乃本虛標(biāo)實(shí)之證，內(nèi)因主要為患者病久肝腎氣血營衛(wèi)內(nèi)虛；外因是風(fēng)寒濕熱侵襲。其病機(jī)主要表現(xiàn)為氣血虧虛、寒濕痹阻、營衛(wèi)不和、陰陽失調(diào)等，治當(dāng)以益氣養(yǎng)血，祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛為法[22]。

通痹顆粒是本課題組研發(fā)治療RA的中藥復(fù)方，由當(dāng)歸、白芍、黃芪、川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒藥、桂枝、黃柏等組成，具有益氣養(yǎng)血、祛風(fēng)除濕之效，可有效緩解RA的癥狀并降低RA患者血清中的炎癥因子[23]。方中以當(dāng)歸為君，白芍、黃芪為臣，川芎、全蝎、僵蠶、乳香、沒藥、桂枝、黃柏為佐藥。當(dāng)歸養(yǎng)血活血；白芍與川芎共用活血調(diào)氣，助君藥活血化瘀，養(yǎng)血健脾；黃芪大補(bǔ)氣血；乳香、沒藥活血生肌，散瘀止痛；全蝎、僵蠶通絡(luò)止痛；桂枝通經(jīng)散寒;黃柏清熱解毒；甘草調(diào)和諸藥，共奏活血調(diào)氣、通絡(luò)止痛、清熱利濕的功效。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，RA模型組IL-1、TNF-α血清水平顯著增加，關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及足跖腫脹明顯上調(diào)。再次證實(shí)了RA模型組大鼠炎性指標(biāo)的異常表達(dá)與關(guān)節(jié)損傷有密切聯(lián)系。通痹顆粒組以及聯(lián)合組的IL-1、TNF-α血清水平顯著降低，關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及足跖腫脹明顯下降，說明通痹顆粒組能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)RA患者關(guān)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，RA模型組TRAF3基因表達(dá)水平下調(diào)，PTPN22蛋白Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，提示RA模型組大鼠滑膜免疫炎性損傷與TRAF3低表達(dá)和PTPN22蛋白以及Beclin1蛋白高表達(dá)相關(guān)。與RA模型組比較，通痹顆粒組以及聯(lián)合組滑膜組織TRAF3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，PTPN22蛋白和Beclin1蛋白低表達(dá)，表明通痹顆粒組抑制RA模型大鼠滑膜炎癥反應(yīng)可能與其上調(diào)免疫炎性抑制蛋白 TRAF3，下調(diào)PTPN22和Beclin1蛋白的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，通痹顆粒方治療RA模型大鼠的機(jī)制可能與上調(diào)TRAF3基因，下調(diào)PTPN22和Beclin1的表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞自噬，使T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)，減少炎癥細(xì)胞因子釋放，緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)炎狀態(tài)，起到治療RA的作用。