孫萬霞潘曉芳韋繼光楊來安

(1．廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2．廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

板栗Castanea mollissima屬于殼斗科Fagaceae栗屬Castanea多年生落葉喬木，被稱為世界四大干果之一[1]，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前我國板栗的栽培面積排在世界首位，品種約有300多個(gè)，且栽培歷史悠久。目前，廣西隆安縣板栗總面積達(dá)1．07萬hm2，年產(chǎn)板栗2 250 t，面積和產(chǎn)量均位于廣西首位，具有“板栗之鄉(xiāng)”的美稱，主要在喬建、古潭、城廂、那桐和南圩等全縣10個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植，分別有“九家種”“處署紅”“隆安26號(hào)”“油栗”和“大毛栗”等5個(gè)主栽品種[2]，近幾年新引進(jìn)“日本8號(hào)”早熟品種等。隨著雙季板栗種植面積擴(kuò)大，雙季板栗果實(shí)病害發(fā)生也日益嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致雙季板栗采前果實(shí)腐爛脫落，嚴(yán)重影響雙季板栗產(chǎn)量，因此，對雙季板栗果實(shí)病害進(jìn)行深入調(diào)查及防治方法研究迫在眉睫[3]。侯保林 等研究板栗種仁斑點(diǎn)類病害發(fā)現(xiàn)，主要病原菌是盤長孢狀刺盤孢Colletotrichum gloeosporioidesPenz、鏈格孢Alteruaria alternata、腐皮鐮孢菌Fusarium solani、串珠鐮孢菌Fusarium moniliforme、三線鐮孢菌Fusarium tricinctum和擴(kuò)展青霉Penicillium expansum[4]；殷莉研究發(fā)現(xiàn)，板栗貯藏期間病害的病原有很多種，均屬于半知菌類，叢梗孢目[5]。

目前雙季板栗已報(bào)道的研究多為種植或栽培等方面，病害方面也只是對其葉、枝方面發(fā)生病害的研究，對其果實(shí)病害方面研究報(bào)道較少，缺乏針對其病害調(diào)查及防治等方面的研究。為明確廣西隆安縣雙季板栗果實(shí)病害的發(fā)生情況，在隆安縣定軍村種植區(qū)開展雙季板栗病害種類調(diào)查，對其病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，及致病性驗(yàn)證，并對雙季板栗果實(shí)病害進(jìn)行藥劑防治室內(nèi)篩選及毒力測定，以期為雙季板栗果實(shí)病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 雙季板栗林地概況

廣西隆安縣，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫21．7℃，最熱月和最冷月平均氣溫分別為28．2℃和12．9℃；年平均降水量1 310．1 mm，年均蒸發(fā)量1 652．5 mm，空氣相對濕度80%，其中4—10月降水量占全年的87．5%。該縣日照充足，四季差異較小，按平均溫度統(tǒng)計(jì)，該地區(qū)屬于春秋相連，夏長無冬或基本無冬，四季皆適宜耕作。調(diào)查地在隆安縣定軍村雙季板栗種植區(qū)。

1．2 試驗(yàn)儀器

恒溫光照培養(yǎng)箱DHP－9162，太倉市科教器材廠；干燥自動(dòng)排氣立式高壓蒸汽滅菌鍋LDZF－75KB，上海申安器械廠；生物光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CX21，日本東京奧林巴斯公司；DNA電泳槽DYCP－31DN、穩(wěn)壓電泳儀DYY－5，北京六一儀器廠；電熱恒溫水槽DK－8D，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司；PCR 儀2720 thermal cycler、測序儀3730XL，Applied Biosystems；冷凍高速離心機(jī)HC－2518R，BBI生物科學(xué)；Surf系列精密單道可調(diào)移液器SP10－1000，生工生物(上海)有限公司。

1．3 病害田間調(diào)查方法

2016年5月—2018年9月，采用線路踏查法對雙季板栗種植區(qū)進(jìn)行果實(shí)病害種類調(diào)查。在同一林分行間逐一觀察植株，記錄病害發(fā)生的種類、癥狀、嚴(yán)重程度，分析癥狀類型、發(fā)生規(guī)律，觀察記錄病果數(shù)量，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。病果采集應(yīng)在晴天中午進(jìn)行，采集帶有典型癥狀的病果樣本，分別按類型裝袋、掛好標(biāo)簽，將樣本帶回實(shí)驗(yàn)室，待分離純化和鑒定。雙季板栗病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照方中達(dá)所著的?植病研究方法(第三版)?[6]，病害分級(jí)如表1所示，果實(shí)、葉部及枝條類病害都按此分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分類。

表1 病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Grading standards of different disease severity

1．4 病原菌分離純化及鑒定

1．4．1 分離純化

對病果各危害部位組織分離[7]。將漂洗過的病果置于提前放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸去表面水分后，用高壓滅菌手術(shù)刀切取果實(shí)病部塊狀組織長寬各約5 mm，接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)放置組織塊4～5個(gè)，每個(gè)果實(shí)病部重復(fù)做5～6個(gè)培養(yǎng)皿，編號(hào)后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察記錄。

待菌絲長出后，用滅菌接種針從菌落邊緣挑取新鮮菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)培養(yǎng)，直至得到單一菌株。對所得菌株編號(hào)，將純化后菌株接種至PDA培養(yǎng)基試管中，置于4℃冰箱備用。

1．4．2 致病性測定

接種前，挑取菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化。5 d后將已活化的病原菌，在平展邊緣處取長寬各為5 mm大小一致的菌絲塊，分別進(jìn)行活體接種和離體接種。設(shè)置針刺傷法和無傷接種法2種處理，每處理接種果苞數(shù)量30個(gè)，并以同等大小空白PDA培養(yǎng)基處理作為空白對照。每處理設(shè)3次重復(fù)。對于雙季板栗果實(shí)的離體接種，根據(jù)其組織面積大小接種不同數(shù)量菌絲塊，使用吸滿無菌水的濾紙放入一定大小的無菌培養(yǎng)皿中，并定期噴灑無菌水保濕；野外活體接種，使用無菌保鮮袋進(jìn)行保濕，保濕時(shí)間為3～5 d，并用芭蕉葉覆蓋防止曬傷。此后每天觀察并記錄發(fā)病情況，待出現(xiàn)病狀后，對發(fā)病部位再分離，若仍能得到相同菌株，即確定為病原菌。

1．4．3 病原菌鑒定

1．4．3．1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化好的病原菌菌種在適宜溫度條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)并逐日觀察記錄病原菌的培養(yǎng)性狀，如菌落大小、顏色、形狀和致病程度等。采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀測病原菌的菌絲、產(chǎn)孢梗和孢子的大小及形態(tài)特征[8]。光學(xué)顯微鏡下，觀察病原菌孢子形態(tài)特征[9]。

1．4．3．2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 提取活化后的病原菌菌絲，通過ITS－PCR方法對雙季板栗果實(shí)壞死病病菌進(jìn)行鑒定。PCR反應(yīng)總體積25 μL，內(nèi)含 10 × Buffer 2．5 μL， Template 0．5 μL， dNTP 1 μL，Taq 酶 0．2 μL，引物 (10 μmol/L)各0．5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物的純化和序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。對測定結(jié)果，在美國國立生物信息中心NCBI網(wǎng)頁上進(jìn)行Blast比對分析，利用MAGA7．0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析并與真菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征相互驗(yàn)證。

1．5 病原菌生物學(xué)特性研究

取出4℃斜面保存的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)6 d后備用。

1．5．1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

將活化后的菌株于菌落邊緣處取新鮮菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中，按菌株類型編號(hào)，并放置于10，16，22，25，28，34，40 ℃等 7 個(gè)不同溫度環(huán)境培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個(gè)溫度處理重復(fù)3次。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

1．5．2 pH對病原菌菌絲生長影響

PDA培養(yǎng)基降至50℃以下時(shí)，在無菌操作臺(tái)加入配制好的1 mol/L HCL與1 mol/L NaOH溶液，混合均勻，將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)至 2，3，4，5，6，7，8，9，10。在菌落邊緣平展處取長寬各5 mm菌絲塊，接種至不同pH值培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)，設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

1．5．3 不同光照對病原菌菌絲生長影響

在邊緣平展處取長寬各5 mm菌絲塊，接種至PDA培養(yǎng)基中央。接種后分別放置于全黑暗(6 d)、全光照(6 d)、光暗交替培養(yǎng)(先光照3 d，再黑暗3 d)的28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2．1 雙季板栗果實(shí)病害癥狀

通過對果頂變黑、果頂開裂并感染和其他部位變黑3種果實(shí)病害類型(圖1)的病果部位進(jìn)行分離培養(yǎng)、純化及致病性試驗(yàn)，根據(jù)菌落顏色、形狀、疏密程度、生長速度和生長狀況等，獲得3種菌株，分別編號(hào) ZH －1，Hei－2，F(xiàn)en－3。

圖1 果實(shí)病害癥狀Fig.1 Symptom of fruit necrosis

2．2 病原菌致病性試驗(yàn)

接種病原菌3～4 d后，刺傷果實(shí)接種的雙季板栗果實(shí)表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，果苞表面產(chǎn)生一層白色菌絲，不斷向外擴(kuò)張。接種7 d后，刺傷接種果實(shí)周圍產(chǎn)生大量菌絲，近傷口處呈灰黑色，果實(shí)外部果苞果刺變黃、開裂，直至果實(shí)脫落。各個(gè)處理平均發(fā)病率為29．97%，其中 ZH －1，Hei－2，F(xiàn)en－3 菌株發(fā)病率分別為 34．08%，29．17%，37．87%，為優(yōu)勢菌株，多以2種或3種同時(shí)侵染雙季板栗。

2．3 果實(shí)病原菌形態(tài)學(xué)特征

菌株ZH－1菌落生長速度慢，培養(yǎng)10 d可長滿培養(yǎng)皿，氣生菌絲體為白色至淡紫色。菌落突起絮狀，稀疏或濃密，高3～5 mm，背面呈白色、米黃色或紅紫色。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，小型分生孢子為長橢圓形或紡錘形，無色透明，少數(shù)為1隔，多數(shù)為2個(gè)隔膜，大小約為7．2 μm ×3．6 μm；大型分生孢子為鐮刀形或紡錘形，有足孢，1～4個(gè)隔膜，多為3個(gè)隔膜，大小約為38．20 μm ×4．66 μm(圖2)。

圖2 菌株ZH-1菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.2 Colony and spore morphology of ZH-1 strain

菌株Hei－2菌落生長速度很快，培養(yǎng)2 d后即長出菌絲，4 d后長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，日生長量約4 cm。菌落整齊而平坦，氣生菌絲體絨狀或棉絮狀。菌落初期為灰白色，生長中期中間出現(xiàn)灰黑色，后期漸變?yōu)榛液稚梁谏趁娉屎谏?。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，未成熟的小型分生孢子為單孢，呈卵圓形或橢圓形，無色透明，大小約為18．29 μm ×8．82 μm(圖3)。

圖3 菌株Hei-2菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.3 Colony and spore morphology of Hei-2 strain

菌株Fen－3菌落生長速度較慢，培養(yǎng)7 d后可長滿培養(yǎng)皿。菌落生長初期為淡粉色，后期為白色棉絮狀，稀疏或濃密，背面為粉紫色。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，小型分生孢子呈卵圓形，有時(shí)無隔或1隔膜，大小約 2．4 μm ×1．2 μm；大型分生孢子為卵圓形或橢圓形，無色透明，約1～3個(gè)隔膜，多為2隔，大小約 19．95 μm × 5．71 μm(圖4)。

圖4 菌株Fen-3菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.4 Colony and spore morphology of Fen-3 strain

2．4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

菌株ZH－1與供試菌株MF629741．1Fusarium oxysporumstrain在同一分支上，同源性達(dá)到100%；菌株Fen－3與供試菌株KJ767073．1Fusarium pro-liferatumisolate在同一分支上，同源性達(dá)到100%，并且2種菌株的遺傳距離最近，同源性達(dá)到100%，因此可以確定菌株ZH－1和菌株Fen－3是隸屬于Fusarium屬。其中，菌株ZH－1為尖孢鐮刀菌Fu-sarium oxysporum，菌株Fen－3為層出鐮刀菌Fusarium proliferatum(圖5)。

圖5 三種病原菌的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of ITS sequences of three pathogens

菌株 Hei－2 與 MG386642．1Lasiodiplodia theobromae、MH062942．1Lasiodiplodia pseudotheobromaestrain、MF952733．2Lasiodiplodia brasiliensisisolate和 MH454031．1Lasiodiplodia theobromaestrain 在同一個(gè)分支上，其同源性達(dá)到100%，因此可以確定菌株Hei－2是隸屬于Botryodiplodia屬，為可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae(圖5)。

2．5 病原菌生物學(xué)特性

2．5．1 不同溫度對菌絲生長的影響

3種菌種菌絲生長在不同溫度下具有明顯差異性。在10～34℃均可以生長，在16～34℃生長良好。培養(yǎng)6 d后，菌絲最適生長的溫度為25～28℃(表2)。

在34℃下，菌絲生長緩慢；低于10℃或高于34℃，菌絲生長明顯受到抑制。不同溫度下，同一菌株差異較大(表2)，菌絲顏色未完全變黑成型，表現(xiàn)為中間變黑，周圍新長菌絲為白色，但25℃條件下菌落全部變黑。當(dāng)達(dá)到40℃時(shí)，3種菌株菌絲均不能萌發(fā)生長(表2)。

表2 不同溫度處理對菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different temperature treatments on mycelium growth

2．5．2 不同光照對菌絲生長影響

供試菌株在全黑暗(6 d)、全光照(6 d)和光暗交替(光照3 d，黑暗3 d)等3種光照條件下，3種菌株菌絲均能生長(表3)。其中，最利于3種菌株菌絲生長的光照條件為全黑暗(6 d)，菌落直徑最大。光暗交替(光照3 d、黑暗3 d)處理最不利于3種菌株菌絲生長。

表3 不同光照處理對菌絲生長的差異性分析Tab.3 Difference analysis of mycelium growth under different light treatment

2．5．3 不同pH值對菌絲生長的影響

3種菌株的菌絲生長速度在不同pH條件下有差異。菌絲生長的酸堿范圍pH 2～10。其中，菌株Fen－3耐酸性最大，在pH值為2條件下仍能生長，菌絲長度為0．13 cm。3種菌株均為耐堿菌株，在pH值為10條件下仍能生長。其中，Hei－2耐堿性最大，在pH值為10條件下，菌絲長度為8．93 cm。3種菌株菌絲生長的最適pH值均為7，菌落直徑分別為 4．57，9．00，7．03 cm，隨著 pH 值的增大或減小，菌落直徑減小。(表4)

3 結(jié)論與討論

通過致病性試驗(yàn)、病害癥狀識(shí)別、形態(tài)學(xué)鑒定以及基于rDNA－ITS片段DNA序列的分子生物學(xué)鑒定，認(rèn)為危害廣西隆安縣雙季板栗采前果實(shí)壞死病害的病原菌共有尖孢鐮刀菌，可可球毛色二孢，層出鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌為最新發(fā)現(xiàn)。25～28℃，全黑暗條件，pH值為7是3種菌株最適生長條件。陶怡采集未成熟期和成熟期果實(shí)上分離得到層出鐮刀菌Fusarium proliferatum、可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae，認(rèn)為研究對象可能是貯藏前果實(shí)已經(jīng)感染[10]，梅汝鴻 等對采后板栗果實(shí)病害研究中發(fā)現(xiàn)病原菌有10多種，其中干枯病是一種影響采后板栗果實(shí)的重要真菌性病害，其病原菌為鐮刀菌Fusariumsp．[11]；但以上研究均未得出具體菌種，但是可以肯定的是危害板栗果實(shí)的鐮刀菌屬從南到北均有危害。

趙學(xué)平等通過對板栗貯藏期病害鑒定，得出危害板栗果實(shí)貯藏期間的病原不是一種，也是2～3種病原菌共同危害[12]，Turchetti[13]和梅汝鴻 等[11]在研究板栗貯藏期間的病害時(shí)也得出相同的結(jié)論。以上研究與本研究結(jié)果一致，可以認(rèn)為雙季板栗果實(shí)病害不論在采前或者采后，貯藏期間均為多種病原共同危害的結(jié)果。趙相超[14]的研究結(jié)果顯示，菌絲生長的pH值范圍為5～12、溫度為15～35℃，與本研究所設(shè)范圍有所差異，雖然研究地點(diǎn)和品種不同，但其適宜范圍相同，也證明了層出鐮刀菌、可可球毛色二孢在生物學(xué)特性方面不因地域上的差異而有較大差別。