王 磊，白玉勤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；3.赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099)

膀胱尿路上皮癌(Bladder transition cell carcinoma，BTCC)是泌尿科常見(jiàn)的惡性腫瘤，與吸煙、化學(xué)品接觸史等因素有關(guān)，早期臨床表現(xiàn)為排尿困難、無(wú)痛性間歇肉眼血尿，可伴有膀胱刺激癥狀等，因其早期癥狀常為間歇發(fā)作，少有人關(guān)注，入院診療時(shí)多為惡性轉(zhuǎn)移，生存率較低[1-2]。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖及擴(kuò)散等生理活動(dòng)與其外周血管的生成有著極大的聯(lián)系，近年來(lái)，有不少學(xué)者認(rèn)為抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)有利于控制腫瘤的生理活動(dòng)，從而延緩腫瘤患者的生命[3-4]。內(nèi)皮細(xì)胞的分化是血管生成的重要機(jī)制[5]，ERG是ETS家族的一員，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，屬于內(nèi)皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物[6]。EGR的表達(dá)在血管源性腫瘤以及前列腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，在臨床已引起關(guān)注，但在BTCC中的關(guān)注較少[7]。微血管密度(Microvessel density，MVD)是臨床公認(rèn)可評(píng)估腫瘤細(xì)胞血管生成程度的指標(biāo)[8]。因此，本研究檢測(cè)了BTCC組織中的EGR蛋白以及MVD表達(dá)水平，并與其癌旁組織做對(duì)比，分析BTCC中ERG蛋白表達(dá)水平與MVD和腫瘤分期的相關(guān)性，旨在為臨床診療BTCC提供新方向。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)，取得患者及其家屬知情同意，選取2019年3月至2021年3月于本院確診的62例BTCC患者的癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本，標(biāo)本均為我院病理科存檔標(biāo)本，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床確診為BTCC。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理及臨床資料缺損者。其中男46例，女16例，年齡42～68歲，平均(54.96±6.02)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集：自制信息調(diào)查表，通過(guò)查閱病歷的方式整理入組患者的臨床相關(guān)資料：性別、病理類型、腫瘤分期、數(shù)目等。

1.2.2 切片染色：將石蠟包埋組織切片，厚度為5 μm，進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理(二甲苯溶液，5 min)后在常溫下用梯度酒精進(jìn)行脫苯和水化，使用蘇木素進(jìn)行染色(2 min)后進(jìn)行清洗，采用1%鹽酸酒精進(jìn)行浸泡(1 min)，清洗后使用伊紅染色處理(3～5 min)，清洗后再次進(jìn)行梯度酒精脫水處理，待染色成功后行蓋玻片封層固定，在光鏡下進(jìn)行切片觀察。

1.2.3 ERG、PD-L1表達(dá)水平檢測(cè)：人ERG以及程序性死亡受體配體1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)多克隆抗體試劑采自武漢益普生物科技有限公司。免疫組化采用Envision法，采用3% H2O2對(duì)切片內(nèi)源性生物酶素進(jìn)行滅活后進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)(修復(fù)液：檸檬酸鹽緩沖液)，滴入一抗，在4 ℃的條件下進(jìn)行過(guò)夜培育后清洗進(jìn)行二抗緩慢滴入，在37 ℃的條件下進(jìn)行30 min培育，采用DAB顯色處理后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，再次脫水，完成后進(jìn)行切片封閉，在光鏡下進(jìn)行切片觀察。陰性對(duì)照一抗采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)，陽(yáng)性對(duì)照為自身對(duì)照，與同一切片檢驗(yàn)?zāi)康奈飳?duì)照。

1.2.4 MVD計(jì)數(shù)：在100倍光鏡下尋找切片中MVD最密處，調(diào)高光鏡倍速至200倍，在選定的視野中進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)。一張切片選定3個(gè)視野，以最終平均數(shù)作為評(píng)估數(shù)據(jù)。

1.2.5 結(jié)果判讀：由2名資深檢驗(yàn)技師同時(shí)進(jìn)行結(jié)果判讀，在有歧義時(shí)邀請(qǐng)另一名資深技師參與結(jié)果的判斷，共同談?wù)撁鞔_結(jié)果。PD-L1表達(dá)于細(xì)胞膜，EGR表達(dá)于細(xì)胞核。PD-L1蛋白表達(dá)≥1%為陽(yáng)性，反之為陰性。EGR蛋白表達(dá)參照Axiotis病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]，以染色強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評(píng)估，陽(yáng)性細(xì)胞為棕褐色。染色強(qiáng)度：0分，無(wú)染色；1分，淺黃色；2分，棕黃色，3分，黃褐色。陽(yáng)性率=陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%。0分，無(wú)表達(dá)；1分，>25%；2分，25%～50%；3分，>50%。評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度評(píng)分+陽(yáng)性率評(píng)分。0分為陰性，反之均為陽(yáng)性；1～3分為陽(yáng)性低表達(dá)；4～6分為陽(yáng)性高表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) 記錄各指標(biāo)的表達(dá)水平，分析各指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系，以及ERG、PD-L1蛋白與MVD的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 BTCC癌組織和癌旁組織中ERG、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較 BTCC癌組織中ERG陽(yáng)性表達(dá)39例(62.90%)，明顯高于癌旁組織中的ERG陽(yáng)性表達(dá)12例(23.08%)(P<0.001)；BTCC癌組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)26例(41.94%)，明顯高于癌旁組織中的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)5例(8.06%)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 BTCC癌組織和癌旁組織中ERG、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較[例(%)]

2.2 BTCC癌組織和癌旁組織中MVD表達(dá)水平比較 BTCC癌組織的MVD水平明顯高于BTCC癌旁組織(P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 BTCC癌組織和癌旁組織中MVD表達(dá)水平比較

2.3 不同臨床特征BTCC癌組織中ERG、PD-L1蛋白表達(dá)情況 ERG與PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在病理類型、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在浸潤(rùn)性癌、腫瘤高分期、多發(fā)性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率增高(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同臨床特征BTCC癌組織中ERG、PD-L1蛋白表達(dá)[例(%)]

2.4 不同臨床特征BTCC癌組織中 MVD表達(dá)水平比較 MVD水平表達(dá)在病理類型、腫瘤分期、腫瘤數(shù)目中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在浸潤(rùn)性癌、腫瘤高分期、多發(fā)性腫瘤中水平增高(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同臨床特征BTCC癌組織中MVD表達(dá)水平比較(個(gè)/mm2)

2.5 ERG、PD-L1蛋白表達(dá)與MVD相關(guān)性分析 以ERG、PD-L1蛋白表達(dá)水平為自變量，MVD為因變量，Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示ERG、PD-L1蛋白表達(dá)與MVD水平均呈正相關(guān)(r=0.426，0.357，P<0.05)。以ERG為自變量，PD-L1為因變量，Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示ERG蛋白表達(dá)與PD-L1呈正相關(guān)(r=0.512，P<0.05)。

3 討 論

膀胱癌是臨床泌尿系統(tǒng)腫瘤最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其病死率在所有泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中處于第一位，尿路上皮癌是膀胱癌中最多見(jiàn)的一種，占比高達(dá)90%。 BCTT具有多發(fā)性、復(fù)發(fā)性、擴(kuò)散性高等特點(diǎn)，因而如何控制其復(fù)發(fā)、擴(kuò)散，以改善患者預(yù)后是臨床?？紤]的重點(diǎn)課題。目前臨床常根據(jù)患者的腫瘤組織分期來(lái)進(jìn)行對(duì)應(yīng)治療，但傳統(tǒng)的病理組織學(xué)檢測(cè)對(duì)于預(yù)判病情的發(fā)展和惡化存在缺陷。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，在腫瘤組織發(fā)展和惡化的生物過(guò)程中也尋找了一些具有標(biāo)志性的蛋白因子，如纖維蛋白原、膀胱腫瘤抗原等，具有較高的敏感性，在預(yù)判腫瘤組織的發(fā)展和惡化中具有一定的價(jià)值，但其特異性較低，存在誤診的現(xiàn)象[10]。因而尋找一類敏感性和特異性均較高的標(biāo)志物對(duì)BCTT患者的臨床診療具有重要意義。

在查找相關(guān)文獻(xiàn)過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)有諸多研究表示血管內(nèi)生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和發(fā)展中有著重要地位。VEGF可促進(jìn)腫瘤外周血管的新生，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了有利的條件，其水平的變化可反映腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，可為預(yù)判患者病情的走向及預(yù)后提供有利證據(jù)[11]。MVD是評(píng)估血管活性的指標(biāo)，與VEGF的水平變化具有密切關(guān)系[12-13]。研究顯示，BTCC癌組織細(xì)胞中的MVD水平明顯高于BTCC癌旁組織，提示BTCC癌組織的血管相對(duì)豐富。ERG是ETS家族中的一員，既往研究[14]顯示，其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)異常，在正常腺體中未見(jiàn)異常表達(dá)狀態(tài)，因而認(rèn)為ERG蛋白表達(dá)在前列腺癌患者中具有重要意義。曹麗娟等[15]研究顯示在血管瘤中也有陽(yáng)性表達(dá)，提示ERG蛋白表達(dá)可能在腫瘤細(xì)胞中具有特異性表達(dá)。本研究顯示，ERG蛋白在BTCC癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，說(shuō)明ERG蛋白的異常表達(dá)可診斷BTCC。ERG蛋白表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞核中，且本研究顯示，ERG蛋白表達(dá)與MVD水平具有相關(guān)性，說(shuō)明ERG蛋白表達(dá)可能有促進(jìn)腫瘤血管的生成的作用。

本研究顯示，PD-L1在BTCC癌細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，說(shuō)明PD-L1在癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。免疫系統(tǒng)是阻止病菌侵入和發(fā)展的第一道防線，但一旦發(fā)生腫瘤，腫瘤釋放的一類因子可阻斷免疫系統(tǒng)的正常生理過(guò)程，程序性死亡受體1(Program cell death 1，PD-1)是人體免疫抑制分子，在細(xì)胞的分化和調(diào)亡中發(fā)揮著作用[16]。樊劍等[17]研究顯示，以PD-1作為靶點(diǎn)，進(jìn)行抗腫瘤和抗自身免疫性疾病中具有重要意義。PD-L1蛋白是PD-1的配體，有報(bào)道[18-19]稱，腫瘤細(xì)胞中均有PD-L1蛋白的表達(dá)，其表達(dá)水平的升高可誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞調(diào)亡，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展提供能量，促進(jìn)其惡化。本研究顯示，ERG與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，PD-L1與MVD呈正相關(guān)，提示ERG與PD-L1在腫瘤細(xì)胞的生理過(guò)程存在協(xié)同關(guān)系，PD-L1可能對(duì)腫瘤血管的形成有影響。研究顯示，ERG、PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、MVD水平在浸潤(rùn)性癌、腫瘤高分期、多發(fā)性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平增高，與吳林林等[20]研究部分一致，說(shuō)明ERG、PD-L1和MVD均參與著腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)和發(fā)展。

綜上所述，ERG蛋白在BTCC癌細(xì)胞中存在特異性表現(xiàn)，可能與PD-L1蛋白、MVD共同參與腫瘤血管的生成和惡性進(jìn)展，臨床可聯(lián)合ERG、PD-L1和MVD評(píng)估患者預(yù)后。本研究未探討ERG蛋白參與腫瘤發(fā)展的機(jī)制，今后應(yīng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行深入研究。