陳亞軍 孫梓軒 王文莉

以定西漿水為研究材料，用GB4789系列微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢測漿水中的微生物，并采用稀釋涂布法分離篩選漿水中的乳酸菌群，利用生理生化反應(yīng)初步鑒定其種屬。結(jié)果在定西漿水中共檢測出蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和2種致病微生物，并從定西漿水中初步鑒定乳酸菌分屬于乳桿菌屬Lactobacillus、明串珠菌屬Leuconostoc和片球菌屬Pediococcus，說明定西漿水的應(yīng)用潛力巨大，但致病菌的檢出說明漿水有受微生物污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

漿水是用糧食、蔬菜等混合后發(fā)酵而成的酸味地方特色食品，是西北的一道獨(dú)特傳統(tǒng)美食，因其制作簡單、原料親民、成本低廉而深受北方尤其是山西、陜西、甘肅、寧夏等地人民的喜歡。已有研究表明，漿水中含有大量微生物，乳酸菌、醋酸菌和酵母菌是漿水發(fā)酵過程中的主要菌群，其中尤以兼性厭氧乳酸菌為主要優(yōu)勢菌群，且大部分乳酸菌具有一定的益生活性，但是由于消費(fèi)區(qū)域性限制以及漿水制作和存儲的不確定性因素較多，使得目前漿水主要以家庭制作為主，發(fā)酵質(zhì)量和衛(wèi)生狀況無法得到有效保障，這也是阻礙漿水向規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的主要因素。目前研究較多的甘肅漿水是天水漿水和蘭州漿水，且研究內(nèi)容大多集中在對其中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定和特性研究，很少從食品安全角度出發(fā)，檢測漿水中的微生物污染狀況。本研究將以定西市不同縣區(qū)的市售漿水為研究對象，以GB4789食品微生物檢驗(yàn)系列標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)，分析漿水的食品衛(wèi)生狀況，并對其發(fā)酵過程中的乳酸菌進(jìn)行初步分離，為定西漿水的規(guī)范化生產(chǎn)加工提供技術(shù)支持，并為定西漿水中乳酸菌的進(jìn)一步分析研究提供理論基礎(chǔ)。

1. 材料和方法

1.1 樣品與試劑

1.1.1 樣品采集

從甘肅省定西市各縣區(qū)的不同場所取樣已經(jīng)發(fā)酵完好、正常銷售的漿水樣品，無菌采集至無菌袋后低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行益生菌的分離篩選，共采集樣品40份。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

NaCl、Na2HPO4、KH2PO4（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MRS （Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基、MC（ModifiedChalmers）培養(yǎng)基：北京陸橋生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-350B智能型生化培養(yǎng)箱：上?，樤囼?yàn)設(shè)備有限公司;MLS-3781L-P立式高壓滅菌器：松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司;EX-30顯微鏡：寧波舜宇;C-1厭氧培養(yǎng)罐、厭氧產(chǎn)氣袋：日本三菱。

1.3 方法

1.3.1 漿水中微生物的檢測項(xiàng)目、檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)

定西漿水中微生物的檢測項(xiàng)目見表1，檢測方法按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)（GB 4789）標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.3.2 漿水中乳酸菌的初步分離

用生理鹽水稀釋漿水樣品，并選取適宜稀釋度的樣品菌液涂布于MRS和MC培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)72h，其中MRS進(jìn)行厭氧和好氧培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并記錄培養(yǎng)基上不同菌落的形狀、大小、顏色、光滑度、邊緣形狀等形態(tài)特征，挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)和染色鏡檢。

1.3.3 菌株的生理生化鑒定

將菌株純化培養(yǎng)后，進(jìn)行常規(guī)的生理生化鑒定，生理生化項(xiàng)目有：硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、酪蛋白分解實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)、MR-VP實(shí)驗(yàn)、觸酶實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖、核糖、果糖、木糖），記錄各生理生化結(jié)果。

2. 結(jié)果與分析

2.1定西漿水中大腸菌群和食源性致病菌檢測結(jié)果

本次共抽取定西地區(qū)漿水樣本40份，共檢出食源性致病菌10株，包括9株蠟樣芽孢桿菌，檢出率為22.5%;1株金黃色葡萄球菌，檢出率為2.50%;大腸菌群、沙門氏菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌均未檢出，檢測結(jié)果見表2。

本次檢測中的蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，其為條件致病菌，主要通過產(chǎn)生毒素、溶血素等物質(zhì)從而有引起食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。目前認(rèn)為該菌含量高于105CFU/g（mL）是引起食物中毒的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本次蠟樣芽孢桿菌的檢出值均小于103CFU/mL，低于引起食物中毒的限量要求，但是也有相關(guān)報(bào)道，蠟樣芽孢桿菌在103CFU/g（mL）的含菌量下依然有引發(fā)感染的可能性，因此不能忽視由該菌污染導(dǎo)致的食品安全問題。金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌，其產(chǎn)生的腸毒素具有對熱穩(wěn)定（耐高溫）的特性，即使高溫處理依然不能破壞其毒性，在菌體死亡后毒素依然可能存在于食物中對人體造成危害。本次檢出的1株金黃色葡萄球菌數(shù)量為670CFU/mL，腸毒素檢測結(jié)果為陰性，說明定西漿水倍金黃色葡萄球菌污染的風(fēng)險(xiǎn)較小。

2.2 漿水中乳酸菌的初步分離

根據(jù)菌落表型特征，本研究從MRS和MC培養(yǎng)基中共分離出菌株18株。菌落形態(tài)、分離培養(yǎng)基和革蘭氏染色結(jié)果見表3。菌落形態(tài)觀察結(jié)果顯示，在MC培養(yǎng)基中所分離菌落大部分為圓形、粉紅色較小菌落;MRS培養(yǎng)中主要分離到圓形、乳白色不透明較大菌落，革蘭氏染色結(jié)果顯示所分離菌株大部分為G+桿狀細(xì)菌、少數(shù)為球形。

2.3 菌株生理生化特性及初步鑒定

結(jié)合菌株生長特性、菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果和生理生化反應(yīng)。查詢《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》以及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》，對所分離菌種的初步鑒定。其中，J3、J13和JR12硝酸鹽反應(yīng)陽性，不符合乳酸菌反應(yīng)特征;J10、J11、JR2生理生化反應(yīng)一致，但和乳桿菌屬Lactobacillus的生化反應(yīng)相差較大，所以以上菌株初步鑒定為非乳酸菌;J7和JR10為球菌，根據(jù)生化反應(yīng)，初步鑒定為明串珠菌屬Leuconostoc和片球菌屬Pediococcus;其余菌株初步鑒定為乳桿菌屬Lactobacillus，其中J14和JR16生化反應(yīng)一致，初步鑒定為Lactobacillus plantarum;JR6、JR8初步鑒定為Lactobacillus delbrueckii;R7、JR9、JR13初步鑒定為Lactobacillus fermentum;JR14初步鑒定為Lactobacillus amylolyticus;JR15初步鑒定為Lactobacillus paracasei;JR11無法鑒定到種。本次定西漿水中乳酸菌的初步鑒定結(jié)果，和現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致。

3. 討論和結(jié)論

由于漿水的制作和儲存過程受不同因素，如發(fā)酵時(shí)間、原材料、溫度等的影響較大，而且現(xiàn)階段漿水的制作一直停留在家庭自制或小作坊式的制作階段，加工過程粗放，環(huán)境和人員衛(wèi)生無法有效控制，因此，定西漿水目前還無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)，導(dǎo)致漿水的衛(wèi)生質(zhì)量得不到有效保障，而且近幾年從食品衛(wèi)生方面研究漿水的報(bào)道幾乎沒有。通過本次研究，我們從定西漿水中檢測出了蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌2種致病菌，且蠟樣芽孢桿菌檢出率較高，達(dá)到了22.50%，說明漿水在制作和加工過程中存在被有害菌污染的可能，是漿水大規(guī)模規(guī)范化生產(chǎn)需要解決的首要問題。

本研究對定西漿水中的乳酸菌進(jìn)行了分離和初步鑒定，主要是乳桿菌、片球菌和明珠串菌，以乳桿菌數(shù)量最多。已有研究表明，漿水發(fā)酵過程分為三個(gè)時(shí)期，前期（第1-3天）的優(yōu)勢菌群為酵母菌、醋酸菌、小片球菌和明串珠菌，中期（第4-6天）主要以植物乳桿菌和短乳桿菌為主，后期（7-9天）以酵母菌數(shù)量最多。其中發(fā)酵第5-7天是漿水食用的最佳日期，這和本次鑒定結(jié)果基本一致。已有研究表明，乳酸菌的功能性主要包括維持腸道菌群平衡，提高免疫力;降解膽固醇、亞硝酸鹽和重金屬;產(chǎn)生細(xì)菌素用于病原微生物的拮抗，如植物乳桿菌產(chǎn)生的桿菌素可作為天然生物防腐劑使用;提升食品營養(yǎng)價(jià)值和改善食品風(fēng)味等作用。

本研究結(jié)果說明，定西漿水中存在大量具有特征功能性的乳酸菌，表明定西漿水具有巨大的開發(fā)應(yīng)用前景，但通過檢測同時(shí)發(fā)現(xiàn)漿水中還存在著一定數(shù)量的致病菌，表明現(xiàn)階段定西漿水的制作過程存在較大問題，制約著定西漿水的大規(guī)模規(guī)范化應(yīng)用。

基金項(xiàng)目：

甘肅省市場監(jiān)督管理局科技計(jì)劃資助（SSCJG-SP-201917）。