鄭新妹

(龍巖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 福建 龍巖 364000)

靈芝Ganodermalucidum隸屬于真菌門Eumycota擔(dān)子菌綱Basidiomycetes多孔菌目Polyporals多孔菌科Polyporaceae靈芝屬Ganoderma[1]。現(xiàn)代藥理活性研究表明，靈芝具有抗腫瘤[2]、調(diào)節(jié)免疫力[3]、鎮(zhèn)靜安神[4-5]、扶正固本[6]等療效。近年來，隨著人們養(yǎng)生觀念的增強(qiáng)，靈芝的需求量不斷增加。林下仿野生段木栽培靈芝的品質(zhì)與野生靈芝相當(dāng)，優(yōu)于大棚栽培的靈芝[7]，而深受消費(fèi)者喜愛。

龍巖市位于福建省西部，屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全年氣候溫和，雨量充沛，夏秋季溫暖潮濕，森林覆蓋率達(dá)79.3%，適宜發(fā)展林下靈芝仿野生段木栽培。2021年全市紫芝栽培面積為10.8 km2，成為中國最大的紫芝林下栽培基地，主栽品種為武芝2號，栽培品種較為單一，且存在菌種退化[8]等問題。本研究通過對龍巖上杭黃崔巍山1株野生靈芝子實(shí)體進(jìn)行組織分離純化菌種、形態(tài)學(xué)及ITS測序鑒定、林下栽培出芝試驗(yàn)和有效活性成分檢測，旨在選育出適宜閩西地區(qū)氣候生長的優(yōu)質(zhì)靈芝品種，為當(dāng)?shù)匾吧`芝種質(zhì)資源的馴化開發(fā)和基礎(chǔ)研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從上杭縣蛟洋鎮(zhèn)黃崔巍山(東經(jīng)116°40′9″，北緯25°15′1″，海拔900.6 m)采集到野生靈芝子實(shí)體(圖1)，經(jīng)組織分離獲得菌株QS21-4。對照菌株武芝2號由武平縣食用菌技術(shù)推廣服務(wù)站提供。

圖1 野生靈芝生長環(huán)境及子實(shí)體Fig.1 Growth environment and the fruiting body of wild Ganoderma lucidum

1.2 儀器與試劑

主要儀器：恒溫培養(yǎng)搖床(QYC-2112)，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；臺式離心機(jī)(TGL-16E)，濟(jì)南鑫馳醫(yī)療科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-2802)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

主要試劑：葡萄糖、齊墩果酸對照品購自上海生工生物工程股份有限公司；香草醛、冰醋酸、蒽酮、濃硫酸和無水乙醇等均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑集團(tuán)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g。土豆切絲，加蒸餾水煮沸后用紗布過濾再加入葡萄糖、瓊脂定容至1 L。培養(yǎng)基用121℃高壓滅菌15 min，用于菌種分離純化及活化菌株。

PDB培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基不加入瓊脂，培養(yǎng)基用250 mL的三角瓶分裝，用121℃高壓滅菌15 min，用于收集菌絲。

原種、栽培種配方A：闊葉雜木屑78%、谷殼15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%；配方B[9]：闊葉雜木屑78%、麥麩15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%；配方C：闊葉雜木屑78%、棉籽殼15%、玉米碎5%、蔗糖1%、石膏粉1%。干料含量40%，水含量60%，pH 6.5。原種培養(yǎng)料用650 mL菌種瓶裝料滅菌，栽培種培養(yǎng)基用規(guī)格為17 cm×33 cm×0.05 cm的聚丙烯袋分裝、壓實(shí)，每個(gè)菌袋約重900 g，袋口清理干凈后蓋上菌種蓋，采用121℃高壓滅菌2 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1菌株QS21-4子實(shí)體形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)參考文獻(xiàn)趙繼鼎等[10]、陳體強(qiáng)等[11]、吳興亮等[12]、林志彬[13]對取樣的野生靈芝子實(shí)體形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.4.2菌株QS21-4分離純化及培養(yǎng) 采用組織分離法，將取回的野生靈芝子實(shí)體樣品用75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙將野生靈芝樣品表面水分吸干，將其置于無菌托盤上用無菌解剖刀將其切成長3～5 mm塊狀，接種到裝有PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，封口，做好標(biāo)記，放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，26℃、暗培養(yǎng)5～7 d。培養(yǎng)期間注意觀察菌絲生長情況，發(fā)現(xiàn)雜菌污染應(yīng)及時(shí)處理。待菌絲長出，采用菌絲尖端分離的方法，用無菌接種針選取生長前沿的少量菌絲塊置于新鮮PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，觀察菌絲形態(tài)，獲得純培養(yǎng)物[14]。將得到的純化菌株接種到試管斜面PDA培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)，待斜面長滿后加入無菌液體石蠟，保藏于4℃冰箱中[15]。

1.4.3菌株QS21-4ITS測序與分析 選取真菌核糖體基因間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增[16]，委托上海生工生物公司進(jìn)行擴(kuò)增和ITS雙向測序。采用Lasergene中的SeqMan軟件進(jìn)行拼接，所得ITS序列在NCBI在線BLAST檢索，與GenBank中的ITS基因序列進(jìn)行同源性比對分析。采用MEGA11的ClustalW做多序列聯(lián)配，Neighbor Joining(鄰接法)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值(Bootstrap)設(shè)置為1000，確定本試驗(yàn)分離菌株的進(jìn)化分類地位[17]。

1.4.4液體發(fā)酵菌株QS21-4菌絲體有效活性成分的測定 將PDA培養(yǎng)基上活化好的的菌株QS21-4，用直徑3 mm的打孔器延菌落邊緣打取10個(gè)菌圈，接入裝有100 mL的PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，26℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床暗培養(yǎng)5 d，勻漿30 s，取5 mL的菌液接入新的PDB培養(yǎng)基，26℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床暗培養(yǎng)4 d，轉(zhuǎn)入靜置暗培養(yǎng)12 d[18]，過濾菌絲，55℃烘干至恒重后提取和測定其有效活性成分。菌絲體多糖和三萜的測定方法均參照參考文獻(xiàn)滕李銘等[19]。

1.4.5菌株QS21-4原種培養(yǎng)基的篩選與栽培菌包的制備 培養(yǎng)基配方A、配方B、配方C各接種10瓶，26℃、暗培養(yǎng)，觀察記錄菌絲生長情況，篩選最適原種培養(yǎng)基。

將菌株QS21-4接種到篩選出的栽培種培養(yǎng)基上，保持溫度26℃，空氣濕度65%，恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，期間查看污染情況，若有則及時(shí)清理[20]。待菌絲長滿菌袋內(nèi)培養(yǎng)基，打開菌種蓋煉苗3～5 d，以滿足菌絲對氧氣的需求，同時(shí)讓菌絲提前接觸外部環(huán)境，適應(yīng)外部環(huán)境，減少栽培后污染。煉苗期間注意溫度控制在26℃，空氣濕度85%。

1.4.6菌株QS21-4林下栽培及農(nóng)藝性狀測定 將栽培場地設(shè)置在上杭縣蛟洋鎮(zhèn)黃崔巍山天然次生林下，林地以栲櫟樹等闊葉樹種為主，土質(zhì)疏松，偏酸性沙質(zhì)土，林分郁閉度為0.7左右。選取陰涼平坦處，挖約15 cm深的洞穴略深于菌棒，提前用生石灰對洞穴進(jìn)行土壤消毒[21]，菌袋略傾斜放于洞穴，覆上厚度1～2 cm的土，蓋上薄膜拱棚，自然出芝。待子實(shí)體成熟后，測量靈芝菌柄的長度、菌蓋的直徑、每袋靈芝鮮重，各測10袋。

1.4.7林下栽培菌株QS21-4子實(shí)體有效活性成分檢測 對菌株QS21-4和對照菌株武芝2號，采收開始噴孢子粉1周內(nèi)的成熟子實(shí)體，經(jīng)烘干后委托廣東省微生物分析檢測中心對有效活性成分多糖、三萜含量檢測(參照中國藥典2020年版一部靈芝檢測方法)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件和SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株QS21-4子實(shí)體形態(tài)學(xué)鑒定

由圖1可知，QS21-4子實(shí)體幼芝菌蓋邊緣黃褐色，中央紫黑色，近圓形。由圖2可知，QS21-4子實(shí)體成熟后直徑約38 cm，中間厚，邊緣薄，菌蓋和菌柄均為紫黑色，有光澤，中生，菌柄較短，菌肉黃褐色，木栓質(zhì)，孢子黃褐色，形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株QS21-4為紫芝Ganodermasinense。

圖2 野生靈芝子實(shí)體Fig.2 Fruiting body of wild Ganoderma lucidum

2.2 菌株QS21-4分離純化及培養(yǎng)

野生靈芝經(jīng)消毒純化后生物學(xué)菌落特征見圖3。由圖3A 可知，經(jīng)分離獲得的野生靈芝菌株QS21-4在PDA 培養(yǎng)基上菌落以接種點(diǎn)為中心呈近圓形[22]，菌絲白色，交織生長，菌落的邊緣如纖毛狀，菌落緊貼平板。由圖3B可知，菌絲生長到后期菌落中心部位菌絲微發(fā)黃，分泌出黃褐色液體，打開培養(yǎng)皿蓋可聞到菌香味，且在培養(yǎng)基表面形成一層菌皮。

圖3 菌株QS21-4菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of the strain QS21-4

2.3 菌株QS21-4 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析

使用SeqMan進(jìn)行拼接獲得ITS序列(序列長605 bp)，與GenBank中的10個(gè)相似性高的靈芝以及靈芝屬其他種ITS基因序列進(jìn)行同源性比較。由圖4可知，菌株QS21-4在此系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的為Ganodermasinense(MK345453)，即紫芝。與其野生菌株子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果一致。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Fig.4 NJ phylogenetic tree established based on ITS sequence

2.4 液體發(fā)酵菌株QS21-4菌絲體有效活性成分測定

由表1可知，液體發(fā)酵菌株QS21-4菌絲體多糖含量14.54 mg·g-1，三萜含量6.23 mg·g-1，均高于對照菌株武芝2號。

表1 菌絲體多糖、三萜含量比較Table 1 Comparison of the contents of polysaccharides and triterpenoids in the mycelia

2.5 菌株QS21-4最適原種培養(yǎng)基與栽培菌包的制備

由表2可知，菌株QS21-4菌絲在配方B培養(yǎng)基上萌發(fā)最快，比在配方A、C培養(yǎng)基上長勢較好。配方B培養(yǎng)基的上菌絲濃密、粗壯、潔白，滿瓶時(shí)間也最短，綜上特征配方B培養(yǎng)基為菌株QS21-4最適培養(yǎng)基。

表2 菌株QS21-4在不同原種培養(yǎng)基上菌絲的生長情況Table 2 Mycelial growth of the strain QS21-4 on different pathogen culture media

將菌株QS21-4接種到配方B栽培種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲長滿菌袋后即可打開菌種蓋煉苗3～5 d，菌絲微泛黃，且在袋口形成靈芝原基及芝蕾后即可栽種(圖5)。

圖5 靈芝栽培菌包Fig.5 Fungus pack for the cultivation of Ganoderma lucidum

2.6 林下栽培菌株QS21-4出芝管理及農(nóng)藝性狀的測定

菌株QS21-4林下栽培子實(shí)體見圖6，菌株QS21-4子實(shí)體菌蓋黑褐色，呈如意狀，菌柄紫黑色，與對照菌株農(nóng)藝性狀見表3。由表3可知，菌株QS21-4子實(shí)體菌柄比對照武芝2號菌株短，菌蓋直徑和每袋靈芝鮮重則與對照菌株相當(dāng)。

圖6 栽培出芝試驗(yàn)子實(shí)體Fig.6 The tested fruiting body of Ganoderma lucidum cultivated

表3 靈芝菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of the fruiting body of Ganoderma lucidum strains

2.7 林下栽培菌株QS21-4子實(shí)體有效活性成分含量檢測

從表4可知，菌株QS21-4干燥子實(shí)體多糖含量1.66%，三萜含量1.25%，其有效活性成分多糖和三萜含量均比對照菌株武芝2號高。

表4 菌株QS21-4與武芝2號子實(shí)體有效活性成分含量Table 4 Contents of the effective active ingredients in the fruiting bodies of the strain QS21-4 and Wuzhi No.2

3 結(jié)論與討論

紫芝Ganodermasinense是我國特有的靈芝科真菌[23]，紫芝沒有赤芝的苦味，味道甘甜，適口性較好，易于服用，在國外一些對抗腫瘤和抗放射性實(shí)際應(yīng)用中效果也鼓舞人心[24]，紫芝不同于赤芝的獨(dú)特風(fēng)味和其藥用價(jià)值，使其深受廣大消費(fèi)者歡迎[25]。近年來，紫芝在閩西、粵東、贛南等部分縣區(qū)的林下仿野生栽培規(guī)模逐漸擴(kuò)大，靈芝栽培優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵是選用適宜本地優(yōu)良的菌種，當(dāng)?shù)赝辽灵L的靈芝品種具有適應(yīng)性較強(qiáng)，有生長粗放、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。

本研究從上杭黃崔巍山中分離1株野生靈芝菌株，通過靈芝子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征和其 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，確定菌株為紫芝Ganodermasinense。通過林下栽培試驗(yàn)表明，在農(nóng)藝性狀上，菌株QS21-4子實(shí)體的菌柄比對照武芝2號菌株短，菌蓋直徑、每袋靈芝鮮重與對照菌株武芝2號相當(dāng)；在有效活性成分含量上，液體發(fā)酵菌絲體與林下栽培子實(shí)體檢測結(jié)果顯示，試驗(yàn)菌株QS21-4的多糖和三萜含量均高于對照菌株武芝2號。靈芝作為一種藥用真菌，活性成分含量是育種的關(guān)鍵性指標(biāo)，本研究將為當(dāng)?shù)匾吧`芝資源的開發(fā)選育和生產(chǎn)推廣提供了一定參考依據(jù)。