謝 勇，鄭佳穎，孫 昕，林 瑾

(閩江師范高等專科學校， 福建 福州 350108)

茉莉花茶是我國的一種特種茶。現(xiàn)代藥理學研究表明，茉莉花茶香可改善人的情緒、能使人集中精神、降壓提神、提高工作效率[1]。茶多酚是茉莉花茶中一種主要的活性物質[2]，它具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抑制癌細胞活性等多種活性[3]。從茉莉花茶中高效提取茶多酚已成為花茶產業(yè)急需解決的問題。高含量茶多酚提取物可用于加工花茶飲品或固體飲料。然而，現(xiàn)有提取茶多酚的方法主要有高溫提取法、低溫萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法、酶解法等。高溫法提取導致茶葉中的有效成分損失較大，能耗大，生產效率低，而低溫浸提的提取時間長，水浸提取率低，且茶湯后續(xù)需要進行濃縮處理[4]。超臨界液體萃取和超聲輔助萃取具有較高的活性成分浸出率，速度較快，但設備費用昂貴，投資成本較高[5-6]。生物酶提取法已成為茶葉提取技術的一種新技術手段[7]，可一定程度彌補高溫或低溫浸提法的不足之處。

茶葉屬雙子葉植物，其細胞壁由果膠、纖維素、半纖維素和木質素等物質構成，細胞壁強度主要取決于初生及次生壁層[8]。如果水解細胞壁的初生和次生壁層中的纖維素，能使植物的細胞壁分解，從而細胞內活性成分可以有效釋放出來[9-10]。外源生物酶可以使茶葉中的有效成分得到更好的擴散和浸出，進而提高浸出物得率。同時，外源生物酶具有酶解條件溫和，無環(huán)境污染，催化效率高的優(yōu)點[11]。本試驗以茉莉花茶為試材，采用纖維素酶，考察料液比、提取溫度、提取時間、茶湯的pH等因素對茉莉花茶茶多酚提取率的影響，并利用響應面法優(yōu)化茉莉花茶酶解工藝，以得到茉莉花茶多酚提取的最佳參數(shù)條件，為茉莉花茶的開發(fā)與資源利用、茉莉花茶有效物質的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茉莉花茶樣品由福建春倫集團有限公司提供。

1.2 試驗試劑與儀器

主要試劑：纖維素酶(綠色木霉)(400 U·mg-1)購自上海源葉生物有限公司；無水檸檬酸(分析純)和檸檬酸鈉購自阿拉丁試劑 (上海) 有限公司；硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、十二水磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

主要儀器：電子分析天平(AR224CN)購自奧豪斯儀器(上海)有限公司；pH計(PHS-3E)購自上海儀電科學儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6S)購自拓赫機電科技(上海)有限公司；可見分光光度計(UV-6100A)購自上海佑科儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9240A)購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1茉莉花茶酶解方法 準確稱取茉莉花茶葉1 g，按單因素設定條件添加一定比例的蒸餾水；調整茶湯的pH，并添加一定量的纖維素酶進行酶解，水浴溫度保持不變，酶解結束后快速過濾出茶湯樣品，待檢測茶多酚含量。

1.3.2茶多酚含量的測定 參考酒石酸亞鐵比色法[12]并做略微修改，取2 mL茶湯注入25 mL的具塞試管內，加水至5 mL，再準確移取5 mL的酒石酸亞鐵溶液于試管內，倒入pH 7.5的磷酸鹽緩沖液至刻度線，迅速搖勻，保持5 min的靜置時間。同時配置試劑空白溶液。將待測液移入1 cm的比色皿內，用試劑空白溶液調零，在30 min內，540 nm波長測定吸光值，并利用公式算出茶多酚提取率(%)。

1.3.3單因素條件對茉莉花茶茶多酚提取率的影響 選擇纖維素酶添加量、酶解時間、酶解溫度、料液比和pH值等單因素條件(表1)，按1.3.1方法酶解，并測定茶多酚含量。

表1 不同單因素酶解條件Table 1 Different single factor enzymatic hydrolysis conditions

1.3.4響應面試驗設計 在單因素試驗基礎上，選擇酶解時間90 min、酶解溫度50℃試驗條件，以酶添加量(A)、液料比(B)、pH值(C)為考查變量，以茶多酚提取率為響應值，采用Box-Behnken響應面法對其工藝進行優(yōu)化。因素水平見表2。

表2 Box-Behnken Design的因素水平及編碼Table 2 Box-Behnken Design factor level and coding

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上各指標測定均重復3次，采用Excel和SPSS19進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 不同單因素條件對茉莉花茶茶多酚提取率的影響

由圖1(a)可知，隨著纖維素酶添加量的增大，茶多酚提取率逐漸上升。在纖維素酶添加量達20 mg時，茶多酚提取率達到最高值，之后提高酶用量，提取率呈下降趨勢。因此，纖維素酶添加量對茉莉花茶中茶多酚的提取效率，在一定水平會達到最高值。由圖1(b)可知，隨著酶解時間的增加，茉莉花茶茶多酚提取率逐漸上升，在條件為90 min時達到最高值。繼續(xù)延長提取時間，并沒有明顯提高茶多酚的提取率。由圖1(c)可知，隨著酶解溫度的升高，茉莉花茶茶多酚提取率持續(xù)上升，且無明顯下降趨勢；即溫度越高，茶多酚的提取率越高，且沒有拐點。這可能與高溫有利于花茶中固形物溶出有關。但隨著提取溫度的提高，會對茉莉花茶的香氣造成損失[13]。且酶解溫度高于最佳溫度會導致纖維素酶的分子空間被改變，使纖維素酶變性失活，部分酶或者是全部酶變性，從而使酶解反應受到抑制[14]。由圖1 (d)可知，隨著液料比的增加，茶多酚提取率逐漸升高。在液料比為80∶1時，茶多酚提取率達到最高值。這也驗證水加速了茶多酚從茶葉到萃取溶劑水的擴散，從而提高茶多酚提取率。當液料比為100∶1時茶多酚提取率出現(xiàn)回落，表明茉莉花茶中的茶多酚被提取完全，過多溶劑會導致因酶促反應速度減緩引起的茶多酚提取率回落現(xiàn)象。由圖1(e)可知，隨著pH值的增大，茶多酚提取率在pH值為4.5時便達到了提取率的最高值，在pH 4.5之后茶多酚提取率開始逐漸下降。本試驗所用的纖維素酶是從綠色木霉提取，其屬于酸性酶。在高pH值的條件下，茶多酚極易被氧化，且茶葉酶解液顏色會呈變暗且茶多酚含量明顯下降[15]。

注:(a)不同酶添加量對茉莉花茶多酚提取率的影響；(b)不同酶解時間對茉莉花茶多酚提取率的影響；(c)不同酶解溫度對茉莉花茶多酚提取率的影響；(d)不同料液比對茉莉花茶多酚提取率的影響；(e)不同pH值對茉莉花茶多酚提取率的影響圖1 不同酶解單因素條件對茉莉花茶茶多酚提取率的影響Fig.1 Effects of different single factor conditions of enzymatic hydrolysis on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.2 Box-Behnken設計數(shù)據(jù)處理結果

確認了采用三因素三水平進行響應面優(yōu)化試驗時，因此需要進行17組試驗得出其結果，得出單因素變量及試驗結果，17組設計的茶多酚含量見表3。

表3 Box-Behnken Design方案及數(shù)據(jù)處理結果Table 3 Box-Behnken Design scheme and the data processing results

2.3 回歸模型建立

利用軟件對表4進行多元的回歸擬合，得到酶添加量(A)與液料比(B)、pH(C) 對茶多酚提取率(R)的回歸模型為：

R=15.50+0.081A+0.16B+0.050C+0.12AB+0.12AC+0.025BC-0.23A2+0.041B2-0.14C2

回歸模型中的系數(shù)絕對值能反映出各因素對茶多酚提取率的影響，其中正負號代表影響方向。通過觀察一次項系數(shù)的數(shù)值可以得出各因素對該茶多酚提取率的影響程度。數(shù)據(jù)表明，茶多酚提取率(R)受影響的程度為：液料比(B)>酶添加量(A)>pH(C)。

2.4 回歸模型的方差分析

為對多元回歸擬合方程進行有效性檢驗，以顯著性、多元回歸模型方差等進行分析，結果見表4。

表4 茉莉花茶茶多酚提取率回歸模型針對方差的分析Table 4 Analysis on the variance of regression model for the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.5 響應面交互作用分析

響應面等高線曲線圖可以很好地反映出兩個因子之間的相互作用，在等高線為圓形時，這兩個因子相互作用不明顯；在等高線為橢圓或馬鞍形時，這兩個因子之間的相互作用明顯。而響應面的三維曲線上的彎曲度與其對反應值的影響呈正相關，傾斜度越高，坡度越陡，就說明對R的影響程度更大，若曲線平滑則說明兩個因素的交互作用對R影響并不明顯。

由圖2可知，茉莉花茶茶多酚提取率會直接受到酶添加量、液料比的影響，在三維的響應面上表現(xiàn)出明顯的斜坡，在響應面的等高線曲線圖可以看出等高線間更緊密、呈馬鞍形，即兩者相互作用對茉莉茶多酚的提取率有很大的影響。

圖2 酶添加量和液料比對茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.2 Interaction between the amount of enzyme added and the ratio of liquor to material on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

由圖3可得出相似的結果，在響應面的等高線曲線圖可以看出等高線間更緊密、近似橢圓，即酶添加量和pH值對茉莉茶多酚的提取率有很大的影響。

圖3 酶添加量和pH值對茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.3 Interaction of the amount of enzyme added and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

由圖4可知，茉莉花茶茶多酚提取率會直接受到液料比、pH的影響。液料比與pH對茶多酚提取率的影響相較于酶添加量與液料比、酶添加量與pH對茶多酚提取率的影響程度較小。與上述的顯著性結果一致。

圖4 液料比和pH對茉莉花茶茶多酚提取率的相互影響Fig.4 Interaction between the ratio of liquor to material and pH on the extraction rate of tea polyphenols from jasmine scented tea

2.6 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗證

通過Design-Expert軟件對3種較優(yōu)檢驗變量的結合對結果影響的研究，得到了最佳的工藝參數(shù)：酶添加量33.8 mg、液料比100∶1、pH 4.8，此時的茉莉花茶茶多酚提取率為15.77%，經過3次平行試驗得出茉莉花茶茶多酚提取率為15.89%，試驗結果和理論計算值吻合較好，誤差較小。本研究結果表明，可以利用該數(shù)學模型對酶解法的茉莉花茶茶多酚含量進行準確預測。

3 討論與結論

酶提取是一種綠色、環(huán)保、有效的提取技術。本研究中使用的纖維素酶能夠破壞植物細胞的細胞壁，促進茶多酚從茶內的滲透[16]。在一定范圍內，酶添加量、酶解溫度、酶解時間或pH值均可能影響酶解效果。加大纖維素酶添加量可提高提取率，纖維素酶與底物發(fā)生反應的機會就越多，酶的催化效率就慢慢提升[17]，結合纖維素酶在體系中的作用效果，本研究中茶多酚的提取率慢慢升高。當酶用量為20 mg時，茉莉花茶茶多酚提取率可達到15.37%。但是過多的酶添加，則不利于有效成分的溶出，這與前人的結果一致。研究結果表明，茶葉中蛋白可與茶多酚相互結合，二者形成聚合沉淀，間接導致茶多酚提取率回落[18]。

從酶反應進程看，茶多酚提取率在提取初期隨時間的延長而上升。這與初期纖維素酶活性高有關，會促其積極與底物發(fā)生反應，但隨著酶解反應持續(xù)進行，所得的產物會堆積，當產物到一定濃度時，則會抑制了酶的活力及酶解反應的進行。長時間對茶葉進行浸泡使得茶葉及茶水收到空氣對茶多酚的氧化作用增大，容易發(fā)生褐變導致出現(xiàn)茶多酚含量降低的情況[19]。另外，茶葉中含有的一些酚類單寧和花色素也是纖維素酶的一種天然的抑制劑，如果酶在水里過量，會抑制酶的分解。長時間對茶葉進行浸提也會導致大量雜質溶出，茶多酚的析出也就不再明顯。因此，需要尋找一個適合提取茶多酚的時間。

pH值對酶的活性有很大的影響，各酶具有最佳的酸堿度，一旦超過最佳酸堿度，都會導致酶的活力下降甚至消失。對最佳pH值的微小偏差，使酶活性部位的基團顆粒發(fā)生變化，使酶活力下降；當pH值偏差過大時，酶就會發(fā)生變性。由試驗結果可知該纖維素酶的最適pH為4.5。在最適pH下，有利于發(fā)揮酶的最大活力值，在最適條件下，利用纖維素酶可以使茉莉茶的細胞壁發(fā)生損傷，使其傳遞阻力減小，有利于茶多酚的提取[20]。pH值太高或pH太低，對酶在體系內的反應都存在著不利影響。

在優(yōu)化試驗工藝時，本研究選擇的方法為響應面法，用響應面軟件輔助完成試驗的優(yōu)化。在優(yōu)化茉莉花茶酶解工藝研究中，以茶多酚提取率為檢測因子，使用纖維素酶(綠色木霉) 400 U·mg-1，酶添加量33.8 mg，液料比為100∶1，pH值在4.8，50℃條件下時酶解90 min。在此操作條件下，經過3次平行試驗得出茉莉花茶提取率的實際提取率為15.89%，模型的預測值、實際值二者具有很好的一致性，利用該模型分析酶法提取茉莉花茶茶多酚可靠度高。

本研究選擇纖維素酶提取茉莉花茶中的茶多酚，在一定的提取條件下，酶可破壞植物細胞的細胞壁，促使茶多酚更有效溶出，同時利用響應面方法優(yōu)化并預測最優(yōu)提取工藝，在此工藝條件下茶多酚提取率為15.89%，接近模型預測值。