呂庭莉 ，杲紹強(qiáng)，張虎，張易嬋，陳鵬 ，王嘉偉，喬幗，楊伯平，張明明*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；3.邳州市新河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇 徐州 221313；4.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；5.鹽城工學(xué)院 電氣工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

1 引言

瘤背石磺（Onchidium struma）隸屬軟體動物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、石磺科（Onchidiidae），俗稱土海參，又名海賴子，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。主要生長在潮間帶灘涂中，其背部表皮角質(zhì)層厚，溫度適應(yīng)性強(qiáng)，適應(yīng)陸棲生活[2]，因有自由生活幼蟲期而被認(rèn)為是海洋生物向陸地生物輻射進(jìn)化的重要代表物種[3]。此外，瘤背石磺屬于海洋灘涂底棲動物，其早期發(fā)育對各種環(huán)境因子的變化尤為敏感，且因其幼蟲易于采集和培育，常被用于評價海洋污染物的毒性，也可被作為海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測的指示生物[4]。

近年來，瘤背石磺作為一種具有較高經(jīng)濟(jì)和營養(yǎng)價值的海產(chǎn)珍品，日益受到人們的青睞，但由于環(huán)境污染、濫采濫捕或過度采捕等因素，其自然資源量已急劇減少。人們已經(jīng)對瘤背石磺的人工養(yǎng)殖進(jìn)行了研究[5]，但是尚未突破其規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)。因此，研究瘤背石磺基礎(chǔ)免疫學(xué)將對其生長、發(fā)育、繁殖和物種保護(hù)具有重要意義。

目前人們普遍認(rèn)為，包括軟體動物在內(nèi)的無脊椎動物缺乏適應(yīng)性免疫，完全依賴于先天性免疫應(yīng)答[6]。牡蠣和貽貝等雙殼類通過血細(xì)胞吞噬侵入的微生物、促進(jìn)傷口愈合、消化食物和運(yùn)輸營養(yǎng)[7-8]；體腔液及其體腔細(xì)胞是海參先天性免疫防御的重要組成部分，發(fā)揮著重要的免疫防御作用，具有氧化殺滅、吞噬清除、凝集和創(chuàng)傷修復(fù)等多種防御功能[9-10]。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者相繼利用單克隆抗體、熒光標(biāo)記及分子生物學(xué)技術(shù)對海參（Holothurioidea）、海膽（Echinoidea）和海星（Asteroidea）等棘皮動物體腔細(xì)胞的形態(tài)、功能和發(fā)生進(jìn)行了深入研究，進(jìn)一步揭示了棘皮動物體腔細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的重要作用[11-13]。但人們對瘤背石磺體腔細(xì)胞的特點(diǎn)及其在免疫防御中的作用知之甚少。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門基于整體轉(zhuǎn)錄水平來研究基因轉(zhuǎn)錄圖譜并揭示生物學(xué)通路和性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的學(xué)科，近年來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中[14-15]。高通量RNA-Seq 測序技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的第二代檢測技術(shù)，具有高通量、高準(zhǔn)確性、成本低等優(yōu)點(diǎn)[16]，基于此技術(shù)，不僅轉(zhuǎn)錄組本身及其調(diào)控復(fù)雜性的認(rèn)知被大大拓展，有關(guān)生物體的功能基因組學(xué)研究也被深入推進(jìn)[17]，如刺參（Apostichopus japonicus）[18]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）等[19]。藉此，本研究利用RNA-Seq 測序技術(shù)對來自健康瘤背石磺的體腔細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，豐富其遺傳信息；此外，本文研究了瘤背石磺體腔細(xì)胞的免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性，統(tǒng)計了體腔細(xì)胞中各主要類型體腔細(xì)胞的密度，研究結(jié)果將為今后進(jìn)一步研究瘤背石磺的基礎(chǔ)免疫學(xué)提供寶貴的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對于提高人工繁育的效率和質(zhì)量、遺傳圖譜的建立和物種保護(hù)提供有價值的參考。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

健康瘤背石磺（平均體質(zhì)量：（8.3±0.5）g）采自江蘇省射陽縣新洋港潮間帶，帶泥運(yùn)回實驗室后，在塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)（70 cm × 50 cm × 40 cm，90 頭/箱）暫養(yǎng)3 d。塑料桶內(nèi)鋪上8～12 cm 厚的海泥，再鋪上半圓形瓦片供瘤背石磺隱藏和附著。每個飼養(yǎng)箱用網(wǎng)紗覆蓋，用于通風(fēng)、觀察和防止瘤背石磺逃生。飼養(yǎng)箱內(nèi)的相對濕度通過噴灑人工海水保持在80%左右，與自然生活潮間帶濕度相近[20]，室溫保持在（26±1）℃。暫養(yǎng)期間，投喂螺旋藻（粗蛋白57.64%、粗脂肪2.73%、灰分7.53%、鈣0.2%、磷0.79%和水分8.28%），日投喂量為體質(zhì)量的2%，將螺旋藻涂抹于無菌玻璃上，并在飼喂2 h 后清理干凈，防止藻類腐敗發(fā)臭以保持良好的養(yǎng)殖環(huán)境。

2.2 實驗方法

2.2.1 瘤背石磺體腔液的采集

暫養(yǎng)3 d 后，將瘤背石磺隨機(jī)分到3 個飼養(yǎng)箱中，每箱放置15 頭。從每箱中隨機(jī)選取3 頭瘤背石磺，用無菌海水沖洗體表海泥后，解剖紙吸干水分，用無菌手術(shù)剪沿瘤背石磺腹部縱向解剖，并用50 mL 離心管收集體腔液。記錄體腔液體積后，取100 μL 體腔液與等體積的抗凝劑（葡萄糖：20.8 g/L、檸檬酸鈉：8 g/L、EDTA ：3.36 g/L、氯化鈉：22.5 g/L，pH：7.5）混勻，進(jìn)行體腔細(xì)胞計數(shù)。剩余體腔液于4℃、3 000 r/min離心30 min，分別收集上清液和底層細(xì)胞沉淀，每3 頭瘤背石磺的上清液混合作為一個平行樣本，-80℃保存，用于免疫相關(guān)酶和抗氧化酶活性測定；底層細(xì)胞加入RNA 保護(hù)劑以防止RNA 降解，立即放于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

2.2.2 瘤背石磺體腔細(xì)胞的分類和數(shù)量分析

將處理獲得的體腔液制作細(xì)胞涂片，在40 倍光學(xué)顯微鏡（Olympus,PH100-3B41L-IPL）下觀察體腔細(xì)胞并依據(jù)形態(tài)、大小和核質(zhì)比進(jìn)行細(xì)胞分類。

將體腔液滴于血球計數(shù)板（25×16）上，并在光學(xué)顯微鏡下測定總體腔細(xì)胞密度（Total Coelomocytes Density,TCD）和不同類型體腔細(xì)胞密度（Different Coelomocytes Density,DCD）。計算公式為

式中，A為25 中方格內(nèi)總體腔細(xì)胞數(shù)之和（單位：cells/mL）；B為稀釋倍數(shù)；C為25 中方格中某類型體腔細(xì)胞數(shù)之和（單位：cells/mL）。細(xì)胞計數(shù)重復(fù)3 次。

2.2.3 瘤背石磺體腔液中免疫相關(guān)指標(biāo)活性測定

通過試劑盒測定體腔液中酸性磷酸酶（Acid Phosphatase,ACP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AKP）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）和酚氧化酶（Phenoloxidase,PO）活力及總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity,T-AOC），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，根據(jù)說明書進(jìn)行操作和活力計算。

2.2.4 瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.4.1 總RNA 提取和cDNA 文庫的構(gòu)建

cDNA 文庫的構(gòu)建及測序在北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行。根據(jù)使用說明書從體腔細(xì)胞中提取總RNA，RNA 的質(zhì)量經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀檢測合格后用于cDNA 文庫構(gòu)建。根據(jù)RNA 質(zhì)量篩選獲得6 個樣品的RNA，純化后，使用fragment buffer 將包含Poly(A)的mRNA 片段分成200～250 bp 的短片段。使用N6 引物將片段化的RNA 轉(zhuǎn)錄入第一鏈cDNA，隨后合成第二鏈cDNA。用QIA quick PCR 試劑盒純化雙鏈cDNA，之后通過2%瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段。使用PCR primer cocktail 和PCR master mix 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增來富集合適的銜接子連接的片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)ampureXP 珠純化后使用Illumina HiSeq? 3000 平臺進(jìn)行測序。

2.2.4.2 Unigenes 功能注釋與分類

獲得原始片段后，使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk//projects/fastqc/）軟件進(jìn)行質(zhì)量分析，去除帶有接頭、低質(zhì)量和N（表示無法確定堿基信息）比例大于10%的序列，獲得過濾后數(shù)據(jù)。將過濾后的數(shù)據(jù)用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）組裝出全長轉(zhuǎn)錄本序列。在已知的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，將所有組裝的Unigenes 通過BLASTX進(jìn)行比對，去掉E-value 值大于10-5的比對序列。數(shù)據(jù)庫包括：NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫（Nt:https://www.ncbi.nlm.nih.gov）、NCBI 冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Nr:http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、PFAM（HMMER3.0package）、Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）、COG 數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和KEGG 數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg）。

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 瘤背石磺體腔細(xì)胞的分類和數(shù)量

根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、大小、核質(zhì)比、顏色和相關(guān)研究報道[21]，將瘤背石磺的體腔細(xì)胞分為變形細(xì)胞（圖1a）、球形細(xì)胞（圖1b）和色素細(xì)胞（圖1c）。變形細(xì)胞類似海參中的變形細(xì)胞，細(xì)胞形狀各異，大小不一，細(xì)胞核呈圓形，胞質(zhì)中含有大量的絲狀偽足，呈花瓣狀[22]；球形細(xì)胞靜止時呈球形，內(nèi)部均勻充滿了小球狀顆粒，大小不一；色素細(xì)胞的形狀各異，大小不一，呈黃色或棕色。在瘤背石磺體腔液中，3 類細(xì)胞的密度由多到少依次為球形細(xì)胞（（6.17±0.14）×106cells/mL）、變形細(xì)胞（（1.40±0.30）×105cells/mL）、色素細(xì)胞（（7.00±0.40）×104cells/mL）（圖2）。

圖1 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細(xì)胞的顯微形態(tài)（×40）Fig.1 The micro-morphology of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma (×40)

圖2 瘤背石磺體腔液中不同類型體腔細(xì)胞的密度Fig.2 Density of different coelomocytes in coelomic fluid of Onchidium struma

3.2 瘤背石磺體腔液免疫相關(guān)酶活性分析

無外源刺激下瘤背石磺體腔液中ACP、AKP、TAOC、SOD 和PO 均有活力，ACP、AKP、T-AOC、SOD 和PO 活性分別為（0.98±0.60）U/mL、（4.68±0.98）U/mL、（0.01±0）U/mL、（21.59±1.33）U/mL 和（180.34±2.85）U/mL，其中，PO 活性最高。

3.3 瘤背石磺體腔細(xì)胞高通量測序與序列拼接

瘤背石磺體腔細(xì)胞6 個文庫的序列統(tǒng)計見表1。原始序列過濾后，共獲得328 759 318 條原始測序數(shù)據(jù)和318 727 812 條過濾后數(shù)據(jù)，過濾后數(shù)據(jù)比例為96%。在這些過濾后數(shù)據(jù)中，Q20 值為97.51%，Q30 值為92.91%，GC 含量為40.66%，這表明測序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析。

表1 瘤背石磺體腔細(xì)胞6 個文庫的序列統(tǒng)計Table 1 Statistics of transcriptomic sequences from six libraries formed from coelomocytes of Onchidium struma

將來自6 個文庫的過濾后數(shù)據(jù)使用Trinity 軟件進(jìn)一步組裝得到63 097 個Unigenes，其平均長度、最長長度和最短長度分別為1 520 bp、29 277 bp 和301 bp。此外，過濾后數(shù)據(jù)被組裝成124 853 個轉(zhuǎn)錄本，它們的平均長度、最長長度和最短長度分別為1 974 bp、29 277 bp和301 bp（圖3）。瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本測序原始數(shù)據(jù)在NCBI 中的登錄號分別為：SRR6118632、SRR6118633、SRR6118634、SRR6118635、SRR6118636和SRR6118637。

圖3 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 和Transcript 長度分布Fig.3 Length distribution of all Unigenes and Transcript from coelomocytes in Onchidium struma

3.4 Unigenes 功能注釋與分類

63 097 個Unigenes 在GO、KO、KOG、NR、NT、PFAM 和SwissProt 數(shù)據(jù)庫中成功注釋的比例分別為33.33%、11.5%、11.55%、30.64%、9.45%、33.33%和20.85%。

在這些Unigenes 中，99%以上的Unigenes 與NCBI數(shù)據(jù)庫中的注釋序列的相似性大于40%（圖4a），18.4%的Unigenes 的E值大于10-15（圖4b）。這些非重復(fù)序列基因比對分析表明，與瘤背石磺轉(zhuǎn)錄本具有最高相似度的是海蝸牛（Aplysia californica）（47.1%），其次是光滑雙臍螺（Biomphalaria glabrata）（27.8%）、棒絡(luò)新婦蜘蛛（Nephila clavipes）（3.1%）、仿刺參（1.7%）和青螺（Lottia gigantea）（1.4%）（圖4c）。

圖4 瘤背石磺體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列比對結(jié)果Fig.4 Comparison of transcriptomic sequences from coelomocytes in Onchidium struma with the known sequences from different species in database

在GO 功能注釋中，21 036 個Unigenes 被注釋到3 個功能類別，分別為：分子功能、生物過程和細(xì)胞組成，并被進(jìn)一步注釋為55 個子類。在這3 大功能類別中，得到注釋最多的子類是細(xì)胞過程、結(jié)合、單生物過程、代謝過程、催化活性、細(xì)胞、細(xì)胞組分和膜（圖5）。

圖5 瘤背石磺體腔細(xì)Unigenes 的GO 功能注釋Fig.5 Gene ontology (GO) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

COG 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，共有7 294 個Unigenes 被注釋到26 個功能類別中（圖6）。其中，優(yōu)勢類群為：“一般功能預(yù)測” “信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制” “翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊、分子伴侶” “未知功能” “轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)構(gòu)和發(fā)生” “胞內(nèi)運(yùn)輸分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)”和“轉(zhuǎn)錄”。在這些Unigenes 中，有302 個Unigenes 與“復(fù)制、復(fù)合、修復(fù)”和“防御機(jī)制”有關(guān)。

圖6 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 的COG 統(tǒng)計圖Fig.6 Cluster of orthologous group (COG) functional annotation of Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

基于KEGG 數(shù)據(jù)庫，共有7 258 個Unigenes 被劃分為5 個類別：細(xì)胞過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、代謝和生物系統(tǒng)，共涉及32 個KEGG 注釋分類，得到最多注釋的為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)” “運(yùn)輸和分解代謝”“內(nèi)分泌系統(tǒng)” “翻譯” “折疊、分選和降解” “碳水化合物代謝” “消化系統(tǒng)” “細(xì)胞交流” “脂類代謝”和“免疫系統(tǒng)”，參與免疫系統(tǒng)的Unigenes 共有309 個（圖7）。

圖7 瘤背石磺體腔細(xì)胞Unigenes 的KEGG 注釋分類Fig.7 KEGG annotation of the assembled Unigenes from coelomocytes in Onchidium struma

4 討論

國內(nèi)外對石磺科的研究起步較晚，目前的研究主要集中在繁殖生物學(xué)和生態(tài)學(xué)這兩個方面，而關(guān)于免疫學(xué)方面的研究甚少[23-24]。與其他海洋無脊椎動物一樣，體腔液是瘤背石磺進(jìn)行病原防御的重要體液，其經(jīng)離心后大致可分為由各類體腔細(xì)胞組成的底部沉淀和由多種免疫相關(guān)酶、補(bǔ)體因子和凝集素等體液免疫因子組成的體腔上清液兩部分[25]。本研究中，我們觀察到了3 種不同類型的體腔細(xì)胞，分別是變形細(xì)胞、球形細(xì)胞和色素細(xì)胞，這與海參體腔液中體腔細(xì)胞組成相類似[21]。在十足目甲殼動物和雙殼類軟體動物中，已鑒定出3 種主要的血細(xì)胞類型，即透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞[26-27]。其中，透明細(xì)胞多呈規(guī)則圓形，且胞內(nèi)不含顆粒，在海洋無脊椎動物的大部分種類中均有發(fā)現(xiàn)，包括香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）[28]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）[29]、西施舌（Coelomactra antiquata）、波紋巴非蛤（Paphia undulata）、雙線紫蛤（Sanguinolaria diphos）[30]和橄欖蟶蚌（Solenaia oleivora）[31]等，除此之外，有人在蝦夷馬糞海膽（Strongylocrntrotus intermedius）[32]和紫海膽（Anthocidaris crassispina）[33]中發(fā)現(xiàn)了一類無色球形細(xì)胞，其細(xì)胞特征與透明細(xì)胞基本類似，因此也可歸為一類細(xì)胞進(jìn)行命名劃分。San Miguel-Ruiz 和García-Arrarás[34]在褐石海參（Holothuria glaberrima）體壁上人工創(chuàng)傷進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)體壁創(chuàng)傷后，球形細(xì)胞和桑椹細(xì)胞的數(shù)量會逐漸增加，并且不斷遷移至傷口附近，重構(gòu)細(xì)胞基質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。色素細(xì)胞來源于外胚層中被稱為神經(jīng)嵴細(xì)胞的特化細(xì)胞，是兩棲動物、魚類、爬行動物、甲殼動物和頭足綱動物中含有生物色素的一類細(xì)胞[35]。色素細(xì)胞是調(diào)控動物體色的關(guān)鍵，與生物生存和繁殖活動密切相關(guān)[36]。在魚類中共報道6 種色素細(xì)胞，包括虹彩色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、白色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞和藍(lán)色素細(xì)胞，但是色素細(xì)胞的組成因物種而異[37]。徐偉等[38]研究了幾種不同鯉鯽的鱗片色素細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，組成鱗片的色素細(xì)胞有4 種：紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和鳥糞素細(xì)胞，鳥糞素細(xì)胞又可被分為虹彩色素細(xì)胞和白色素細(xì)胞。在瘤背石磺體內(nèi)，我們觀察到了黃棕色的色素細(xì)胞，推測其可能類似于魚類中的黃色素細(xì)胞，使瘤背石磺外觀呈土黃色，便于其藏匿于灘涂中，具有一定的保護(hù)作用。目前，不同類型的體腔細(xì)胞在瘤背石磺免疫系統(tǒng)中的具體作用尚不清楚，有待深入研究。

體腔液是低等水生動物的重要體液之一，含有凝集素、溶血素、酶、類補(bǔ)體物質(zhì)等大量免疫因子[39]。酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，動物體內(nèi)酶水平可間接反應(yīng)機(jī)體免疫能力[40]。在健康瘤背石磺體腔液內(nèi)，各種酶均保持活性，并發(fā)揮各自的作用來維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。超氧陰離子（）是好氧生物機(jī)體代謝過程中必不可少的物質(zhì)，在正常狀態(tài)下，自由基的產(chǎn)生和消除維持著動態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體受到外來病原如細(xì)菌、病毒侵害時，機(jī)體會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而釋放大量活性氧，最終使機(jī)體發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死等損傷[41]。T-AOC、SOD 是機(jī)體重要的抗氧化酶，T-AOC 反映機(jī)體的總抗氧化能力；SOD 可以和過氧化氫酶（Catalase,CAT）協(xié)同作用，減少機(jī)體的氧化損傷[42]。PO 是一種重要的免疫相關(guān)酶，參與無脊椎動物的體液免疫防御過程，與黑色素產(chǎn)生、細(xì)胞黏附、包裹和吞噬有關(guān)[43]。磷酸酶根據(jù)最適pH 的不同，分為堿性磷酸酶AKP 和酸性磷酸酶ACP，它們是溶酶體酶的重要組成部分，具有水解、清除、消化異物的作用，從而達(dá)到免疫防御；并與生物的DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)，可以促進(jìn)機(jī)體生長和提高免疫力[44-45]。在健康瘤背石磺體內(nèi)，ACP 和AKP 以酶原的形式存在于體腔液中，ACP 的活性可以代表體腔液清除異物的能力[45]。本實驗揭示，自然狀態(tài)下瘤背石磺體腔液中存在的多種抗氧化及免疫相關(guān)酶的活性，這不僅為進(jìn)一步檢測瘤背石磺在應(yīng)激狀態(tài)下的免疫應(yīng)答能力提供了對比，也為瘤背石磺抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

楊鐵柱[46]在2020 年利用RNA-Seq 技術(shù)篩選出與瘤背石磺歸巢行為相關(guān)聯(lián)的生物節(jié)律性和環(huán)境感知性基因，為探討瘤背石磺在潮間帶灘涂區(qū)域適應(yīng)性進(jìn)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對于瘤背石磺而言，體腔細(xì)胞是其發(fā)揮非特異性免疫的重要載體，為了進(jìn)一步剖析瘤背石磺體腔細(xì)胞的免疫防御分子機(jī)制，本實驗通過Illumina 平臺對瘤背石磺的體腔細(xì)胞進(jìn)行測序與功能注釋，共獲得63 097 個Unigenes，數(shù)據(jù)含量大，基因信息豐富，可為未來瘤背石磺的研究奠定基礎(chǔ)。通過GO 功能注釋，有21 036 個Unigenes 被注釋到分子功能、生物過程和細(xì)胞組成3 個功能類別中，這與刺參體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)高度相似[47]。基于Nr 數(shù)據(jù)庫對比，海蝸牛與瘤背石磺序列同源性最高，與Oskars等[48]的報道相似，其次是光滑雙臍螺、棒絡(luò)新婦蜘蛛、刺參和青螺，分別屬于軟體動物門、節(jié)肢動物門和棘皮動物門，瘤背石磺與不同物種間的同源性也證明了其獨(dú)特的進(jìn)化地位。基于通路的分析有助于進(jìn)一步闡明基因的生物學(xué)功能和相互作用機(jī)制，KEGG注釋表明，這些Unigenes 參與了機(jī)體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、免疫防御等各個過程，這將為進(jìn)一步篩選免疫相關(guān)基因和信號通路提供指引。

5 結(jié)論

瘤背石磺體腔液內(nèi)主要含有變形細(xì)胞、球形細(xì)胞和色素細(xì)胞3 種不同類型的體腔細(xì)胞，其中，球形細(xì)胞最多。此外，瘤背石磺的體腔液內(nèi)含有多種抗氧化酶和免疫相關(guān)酶，它們發(fā)揮著各自的作用，共同維護(hù)機(jī)體健康。RNA-Seq 測序表明，從瘤背石磺體腔細(xì)胞中共組裝出63 097 個Unigenes，這些Unigenes 被成功注釋到GO、COG 和KEGG 數(shù)據(jù)庫中。如上結(jié)果為深入了解瘤背石磺進(jìn)化地位及其免疫系統(tǒng)奠定理論基礎(chǔ)，為發(fā)展瘤背石磺人工養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。