張藝凡 唐喜軍 王新帥

1.廣東省珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科，廣東珠海 519000；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南洛陽 471003

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤[1]，我國每年新發(fā)病例約27 萬[2-3]，其中三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）占12%～20%[4]。TNBC 患者對內(nèi)分泌及Her-2 靶向治療均不敏感，治療難度大。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管生成主要依賴血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），VEGF 通過VEGFR-2正反饋作用刺激腫瘤血管生成，為腫瘤生長提供營養(yǎng)物質(zhì)[5-6]。阿帕替尼作為新一代口服VEGFR-2 酪氨酸激酶抑制劑，其能競爭性抑制VEGFR-2 的ATP 結(jié)合位點[7-9]，抑制腫瘤血管生成[10-11]。本文旨在研究阿帕替尼對TMBC MDA-MB-468 細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步探索其潛在的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MDA-MB-468 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 阿帕替尼（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：H20140103），MTT（美國Sigma-Aldrich公司，貨號：M2128-100MG），AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，貨號：556547），Tranwell（美國Corning 公司，貨號：CLS3783）。兔抗人Bcl-2（英國Abcam 公司，貨號：ab32124）、兔抗人p65（英國Abcam 公司，貨號：ab32536）、兔抗人GAPDH（英國Abcam 公司，貨號：ab9485）、山羊抗兔二抗（英國Abcam 公司，貨號：ab96899），超敏ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司，貨號A38554）。

1.1.3 器材 酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：K3），流式細(xì)胞儀（美國BD 公司，型號：FACSCalibur），垂直凝膠電泳儀及配套設(shè)備（美國BIO-RAD 公司，型號：1658001），Chemical XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD 公司，型號:1708265）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，按1∶3的比例分皿傳代。

1.2.2 MTT 實驗 制細(xì)胞懸液并接種于96 孔板。設(shè)置PBS 組、阿帕替尼組。每組復(fù)孔數(shù)為6。各阿帕替尼組各依次加入藥物濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml 的完全培養(yǎng)基，PBS組加入含等藥物體積PBS 的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，加入MTT，4 h 后，加入二甲基亞砜使紫色結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度值（OD 值），計算各組細(xì)胞存活率。用GraphPad 軟件計算阿帕替尼的IC50值。

細(xì)胞存活率=（某藥物濃度組平均OD 值-調(diào)零孔平均OD 值）/（PBS 組平均OD 值-調(diào)零孔平均OD 值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析 制細(xì)胞懸液并接種于6 孔板。每組復(fù)孔數(shù)為6。1、10 μg/ml 阿帕替尼組分別加入藥物濃度為1、10 μg/ml 的完全培養(yǎng)基，PBS 組加入含等藥物體積PBS 的完全培養(yǎng)基，每組4 個復(fù)孔。48 h 后加入Annexin-V/FITC 和PI，進(jìn)行流式細(xì)胞儀凋亡檢測。用75%乙醇固定細(xì)胞，次日加入PI，進(jìn)行流式細(xì)胞儀周期檢測。實驗獨立重復(fù)3 次。

1.2.4 劃痕愈合實驗 細(xì)胞融合度達(dá)90%時，用200 μl槍頭劃痕，1、10 μg/ml 阿帕替尼組分別加入藥物濃度為1、10 μg/ml 的完全培養(yǎng)基，PBS 組加入含等藥物體積PBS 的完全培養(yǎng)基，每組4 個復(fù)孔。0、24 h 觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。實驗獨立重復(fù)3 次。

細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗 制細(xì)胞懸液，取100 μl加入上室，將含20%FBS 的培養(yǎng)基加入下室。取藥物濃度為3、30 μg/ml 的完全培養(yǎng)基50 μl 分別加入1、10 μg/ml 阿帕替尼組的上室，將含等藥物體積PBS 的完全培養(yǎng)基50 μl 加入PBS 組的上室，每組4 個復(fù)孔。24 h 后用結(jié)晶紫溶液將細(xì)胞染色。觀察侵襲細(xì)胞數(shù)量并拍照。實驗獨立重復(fù)3 次。

1.2.6 Western blot 實驗 待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，5、10 μg/ml 阿帕替尼組分別加入藥物濃度為5、10 μg/ml 的完全培養(yǎng)基，PBS 組加入含等藥物體積PBS 的完全培養(yǎng)基，每組4 個復(fù)孔。48 h 后提取蛋白。SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，室溫封閉，加入相應(yīng)抗體。次日漂洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，置于凝膠成像儀中檢測目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad 軟件處理數(shù)據(jù)分析作圖，SPSS 21.0 版軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 檢測阿帕替尼對MDA-MB-468 細(xì)胞增殖的影響

各阿帕替尼組細(xì)胞存活率均低于PBS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），提示阿帕替尼可抑制細(xì)胞增殖。見圖1。阿帕替尼作用MDA-MB-468 細(xì)胞48 h后的IC50值為10.674 μg/ml。PBS 組和1、5 及10 μg/ml阿帕替尼組的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)見圖2。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

1、10 μg/ml 阿帕替尼組細(xì)胞凋亡率均高于PBS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），見圖3。PBS 組與1、10 μg/ml 阿帕替尼組細(xì)胞周期分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），見圖4。

2.3 劃痕愈合實驗檢測阿帕替尼對MDA-MB-468細(xì)胞遷移能力的影響

1、10 μg/ml 阿帕替尼組細(xì)胞遷移運動面積均少于PBS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖5。

2.4 Transwell 侵襲實驗檢測阿帕替尼對MDA-MB-468 細(xì)胞侵襲能力的影響

1、10 μg/ml 阿帕替尼組細(xì)胞侵襲數(shù)量均少于PBS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖6。

2.5 阿帕替尼對MDA-MB-468 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

5、10 μg/ml 阿帕替尼組、p65 及Bcl-2 表達(dá)量均低于PBS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖7。

3 討論

乳腺癌主要分為Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2 過表達(dá)型和TNBC 型[12]，其預(yù)后不盡相同[13]。TNBC 患者年齡輕，以絕經(jīng)前女性居多，惡性程度較高[14-16]。越來越多的研究開始探索針對TNBC 的血管生成抑制劑及相關(guān)靶向藥物的聯(lián)合治療方案[17-19]。阿帕替尼作為新一代血管生成抑制劑可抑制大鼠主動脈環(huán)生成，降低微血管密度[5,9,20]，臨床試驗[21-22]顯示，阿帕替尼可延長腫瘤患者的生存期，并且毒性可控。

轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[23-24]。p65 是NF-κB 家族最重要的亞基[25-26]。Bcl-2 作為重要的抗凋亡蛋白，接受p65 對其啟動子區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明[27]，p65 的激活可促進(jìn)Bcl-2 蛋白的表達(dá)。為進(jìn)一步探究阿帕替尼對p65/Bcl-2 信號通路的影響，本研究通過Western blot 實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，經(jīng)阿帕替尼作用后，細(xì)胞的p65、Bcl-2 的表達(dá)量均有下降，這提示阿帕替尼抑制了p65/Bcl-2 信號通路的傳導(dǎo)。

綜上所述，阿帕替尼能抑制MDA-MB-468 的增殖，誘導(dǎo)凋亡，并抑制p65、Bcl-2 蛋白的表達(dá)。本研究為乳腺癌的診斷與治療提供了一個新的方向和視角，或具有一定的應(yīng)用價值或借鑒意義。