宮慧麗，劉麗君，段國(guó)霞，劉春霞，李翠枝，呂志勇

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

反式脂肪酸指含有1 個(gè)或多個(gè)反式構(gòu)型雙鍵的不飽和脂肪酸，其分子結(jié)構(gòu)中2 個(gè)氫原子位于雙鍵上碳鏈的兩側(cè)，其空間構(gòu)象呈“一”字型[1-3]。反式脂肪酸有天然存在和人工制造2 種情況，牛、羊等反芻動(dòng)物的脂肪和乳制品中天然存在反式脂肪酸；油脂在脫色、脫臭等精煉和煎炸過(guò)程中可產(chǎn)生反式脂肪酸[4-5]。反式脂肪酸不是人體必需的脂肪酸，對(duì)健康存在潛在危害，若食品中反式脂肪酸含量過(guò)多，人在攝入食物過(guò)程中攝入大量反式脂肪酸容易誘發(fā)老年癡呆[6-7]、心血管和肥胖等疾病[8-10]。為了避免反式脂肪酸可能對(duì)人體健康造成的威脅，需要注意控制食品中反式脂肪酸的含量，準(zhǔn)確測(cè)定食品中的反式脂肪酸對(duì)于保證人體健康至關(guān)重要。目前，有氣相色譜檢測(cè)食用油[11-14]、奶茶[15]、沙拉醬[16]、巧克力[17]等中反式脂肪酸和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)炸薯?xiàng)l和食用油[18]、母乳脂肪[19]及乳粉[20]中反式脂肪酸的相關(guān)報(bào)道，但氣相色譜檢測(cè)雪糕中反式脂肪酸的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

目前，GB 5009.257—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中反式脂肪酸的測(cè)定》[21]方法的樣品處理步驟較為復(fù)雜，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，方法操作繁瑣。本研究以GB 5009.257—2016和GB 5413.36—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中反式脂肪酸的測(cè)定》[22]為基礎(chǔ)，將復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單化，并對(duì)前處理和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，利用氣相色譜氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）對(duì)雪糕樣品進(jìn)行檢測(cè)，峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，為雪糕中反式脂肪酸含量的測(cè)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪糕：市場(chǎng)隨機(jī)抽取共10 種樣品，雪糕類(lèi)型包括巧克力類(lèi)、含乳類(lèi)和不含乳類(lèi)，每種樣品抽取1 支，其中涉及到的主要配料有：白砂糖、可可脂、可可粉、乳清粉、食用葡萄糖、葡萄糖漿、食用鹽、全脂乳粉、無(wú)水奶油、食用植物油、麥芽糊精、乳清蛋白粉、全蛋粉、食用大豆分離蛋白、大米粉、小麥粉、紅棗醬、山楂醬、藍(lán)莓醬、濃縮菠蘿汁等；能力驗(yàn)證樣品為2020年Fapas樣品。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：37 種脂肪酸甲酯混標(biāo)（37 種脂肪酸甲酯中每種組分占2.63%）、異油酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反亞油酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、亞麻酸甲酯8 種順?lè)串悩?gòu)體混標(biāo)（反-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15t）、反-9,12-順-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15c）、反-9-順-12-反-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15t）、順-9-反-12-反-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9c,12t,15t）、反-9-順-12-反-15十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15t）、順-9-反-12-順-15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9c,12t,15c）、反-9-順-12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12c,15c）、α-亞麻酸甲酯（C18:3n-3））（純度＞99%）北京盛科博源生物科技有限公司；巖芹酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-9-十六碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-6-十八碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-9-十八碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-11-十八碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-11-二十碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、反-9-順-12十八碳二烯酸甲酯對(duì)照品（純度99%）、反-13-二十二碳烯酸甲酯對(duì)照品（純度＞99%）、順-9-反-12-十八碳二烯酸甲酯對(duì)照品（純度99%） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；石油醚、乙醚、無(wú)水乙醇（均為分析純） 天津富宇精細(xì)化工有限公司；異辛烷（色譜純） 天津福晨化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、甲醇（色譜純）成都科隆化學(xué)品有限公司；氫氧化鉀（分析純） 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；正庚烷（色譜純） 天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010 Plus氣相色譜儀（配備FID） 日本島津公司；AL204分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；SuperVario-N多功能離心機(jī) 德國(guó)Funke Gerber公司；pro UV超純水機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司；DZKW-4電熱恒溫水浴鍋 北京興偉儀器有限公司；MS 3 basic渦旋振蕩器、RVID旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

1.3.1.1 樣品水解

準(zhǔn)確稱取固體和半固態(tài)樣品2.0 g（精確至0.01 g，對(duì)于不同的樣品稱樣量可適當(dāng)調(diào)整，保證樣品中脂肪質(zhì)量不小于0.125 g）置于毛氏抽脂瓶中，加入8 mL水充分混合，再加入8 mL濃鹽酸（12 mol/L）混勻；將雪糕樣品整支融化后混勻?yàn)橐后w試樣，稱取均勻試樣10.00 g置于毛氏抽脂瓶中，加入8 mL濃鹽酸（12 mol/L）混勻。將上述毛氏抽脂瓶置于60～70 ℃水浴中，每隔5～10 min振搖1 次，約40～50 min，至試樣完全水解，取出毛氏抽脂瓶，加入10 mL無(wú)水乙醇充分混合，冷卻至室溫。

1.3.1.2 脂肪提取

在毛氏抽脂瓶中加入25 mL乙醚，加塞振搖1 min，打開(kāi)塞子，用適量的石油醚-乙醚溶液（體積比1∶1）沖洗瓶塞和瓶口附著的脂肪，600 r/min離心5 min或靜置10 min，使乙醚層、水層分開(kāi)，將上層有機(jī)相放入圓底燒瓶中；再加入25 mL乙醚，加塞振搖1 min，打開(kāi)塞子，用適量的石油醚-乙醚溶液（體積比1∶1）沖洗瓶塞和瓶口附著的脂肪，600 r/min離心5 min或靜置10 min，合并有機(jī)相于圓底燒瓶中，將全部有機(jī)相過(guò)適量的無(wú)水硫酸鈉脫水，用少量石油醚-乙醚溶液（體積比1∶1）淋洗無(wú)水硫酸鈉，收集全部流出液于100 mL容量瓶中，用乙醚定容并混勻。

精確移取上述定容液50 mL于恒質(zhì)量的圓底燒瓶?jī)?nèi)，50 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸去溶劑后，至（100±5） ℃干燥箱恒質(zhì)量，計(jì)算樣品中脂肪含量；另50 mL于50 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑后，用于反式脂肪酸的甲酯化。

1.3.1.3 甲酯化

稱取60 mg經(jīng)1.3.1.2節(jié)步驟提取的脂肪（未經(jīng)干燥箱干燥），置于10 mL具塞試管中，加入4 mL異辛烷充分溶解，加入0.2 mL 2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，渦旋混勻1 min，靜置至澄清；加入1 g硫酸氫鈉中和過(guò)量的氫氧化鉀，渦旋混勻30 s，于4 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液作為試樣待測(cè)液。

1.3.2 儀器工作條件

SP-2560色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流進(jìn)樣，分流比1∶30；柱流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積1.0 μL；檢測(cè)器溫度280 ℃，載氣：氮?dú)?；尾吹流量（氮?dú)猓?5 mL/min；升溫程序：初始溫度120 ℃，保持0 min，以10 ℃/min的升溫速率升至140 ℃，保持5 min，以1.3 ℃/min的升溫速率升至240 ℃，保持4 min。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算

1.3.3.1 試樣中脂肪含量

式中：Cz為試樣中脂肪含量/%；m1為圓底燒瓶和脂肪總質(zhì)量/g；m0為圓底燒瓶質(zhì)量/g；m2為試樣質(zhì)量/g；

1.3.3.2 脂肪中反式脂肪酸含量

反式脂肪酸以反式脂肪酸甲酯形式進(jìn)行計(jì)算，反式脂肪酸甲酯相對(duì)含量按式（2）計(jì)算。

式中：Cx為歸一化法計(jì)算得到的反式脂肪酸甲酯x相對(duì)含量/%；Ax為反式脂肪酸甲酯x峰面積；fx為反式脂肪酸甲酯x的校準(zhǔn)因子，參考GB 5009.257—2016[21]；A為除去溶劑峰后所有峰校準(zhǔn)面積的總和。

脂肪中反式脂肪酸含量按式（3）計(jì)算。

式中：Ct為脂肪中反式脂肪酸含量/%。

（2）參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》評(píng)估療效，計(jì)算出總有效率（A概率+B概率）。A（顯效標(biāo)準(zhǔn)）：治療后心功能改善幅度至少達(dá)到2級(jí)，并且心臟超聲檢查也改善明顯；B（有效標(biāo)準(zhǔn)）：心功能在治療后改善1級(jí)，心臟超聲檢查有一定的改善；C（無(wú)效標(biāo)準(zhǔn)）：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3.3 試樣中反式脂肪酸含量

試樣中反式脂肪酸含量按式（4）計(jì)算。

式中：C為試樣中反式脂肪酸含量/%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Minitab軟件對(duì)數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行處理和繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化

參照GB 5009.257—2016方法進(jìn)行樣品的制備，酸水解是利用強(qiáng)酸破壞蛋白質(zhì)、纖維素及結(jié)合態(tài)脂類(lèi)，使脂肪游離；水解后加入無(wú)水乙醇可使蛋白質(zhì)沉淀，降低表面張力，促進(jìn)脂肪球聚合，同時(shí)溶解一些碳水化合物。所以濃鹽酸和無(wú)水乙醇的加入量是提取脂肪的關(guān)鍵點(diǎn)，本研究對(duì)濃鹽酸和無(wú)水乙醇的加入量進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 濃鹽酸加入量對(duì)反式脂肪酸測(cè)定值的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件固定，向試樣中分別加入5、8、10 mL濃鹽酸，每組重復(fù)測(cè)定6 次，3 組反式脂肪酸測(cè)定結(jié)果平均值為0.11%、0.15%和0.15%。利用方差分析對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行差異性分析，由圖1A可知，P=0＜0.05，說(shuō)明加入5、8、10 mL濃鹽酸的檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異。由圖1B可知，P=0.687＞0.05，說(shuō)明加入8、10 mL濃鹽酸檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著差異。原因可能是，加入5 mL濃鹽酸水解不完全，未能使脂肪完全游離出來(lái)，當(dāng)加入8 mL或10 mL濃鹽酸時(shí)，水解完全，脂肪全部游離出來(lái)。

圖1 濃鹽酸加入量對(duì)反式脂肪酸含量測(cè)定值的影響Fig. 1 Effect of the amount of hydrochloric acid on the measured content of trans fatty acids

2.1.2 無(wú)水乙醇加入量對(duì)反式脂肪酸測(cè)定值的影響

其他實(shí)驗(yàn)條件固定，分別加入無(wú)水乙醇5、10、15 mL，每組重復(fù)測(cè)定6 次，3 組反式脂肪酸測(cè)定結(jié)果平均值為0.11%、0.15%和0.15%。利用方差分析對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行差異性分析，由圖2A可知，P=0＜0.05，說(shuō)明加入無(wú)水乙醇5、10、15 mL的檢測(cè)結(jié)果存在顯著差異。由圖2B可知，P=0.687＞0.05，說(shuō)明加入無(wú)水乙醇10、15 mL檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有顯著差異。原因可能是，加入5 mL無(wú)水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀不完全，且乙醚不能將脂肪完全提取出來(lái)，當(dāng)無(wú)水乙醇加入量為10 mL或15 mL時(shí)，均能使蛋白質(zhì)沉淀完全，且乙醚能將脂肪完全提取出來(lái)。

圖2 無(wú)水乙醇加入量對(duì)反式脂肪酸含量測(cè)定值的影響Fig. 2 Effect of the amount of anhydrous ethanol on the measured content of trans fatty acids

綜上所述，在確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，選用試劑消耗量最少的條件，達(dá)到節(jié)約成本和保護(hù)環(huán)境的目的。因此，加入8 mL濃鹽酸水解，水解后的樣品加入10 mL無(wú)水乙醇為最佳條件。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇

色譜柱越長(zhǎng)，則分離度越高。一般來(lái)說(shuō)，15 m的短柱用于快速分離較簡(jiǎn)單的樣品，也適用于掃描分析；30 m的色譜柱是最常用的柱長(zhǎng)，大多數(shù)分析在此長(zhǎng)度的柱子上完成；50、60、100 m的色譜柱用于分離比較復(fù)雜的樣品。

由于雪糕中脂肪酸結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，因此考慮采用100 m高極性色譜柱。對(duì)CP-Sil 88（100 m×0.25 mm，0.20 μm）與SP-2560（100 m×0.25 mm，0.20 μm）2 種色譜柱分離效果進(jìn)行比較。當(dāng)采用CP-Sil 88色譜柱時(shí)，反-9,12,15-十八碳三烯酸甲酯（C18:3n-9t,12t,15t）與花生酸甲酯（C20:0）重合為一個(gè)色譜峰。采用SP-2560色譜柱時(shí)，上述2 種物質(zhì)得到了較好的分離。因此選用SP-2560毛細(xì)管色譜柱。

2.2.2 分離條件優(yōu)化

2.2.2.1 程序升溫速率的選擇

為了得到更好的分離效果，固定色譜柱流速為0.8 mL/min，改變升溫程序中第2階段升溫速率分別為0.8、1.3、1.5 ℃/min。由圖3A可知，升溫速率為0.8 ℃/min時(shí)，30號(hào)峰與31號(hào)峰未分離，無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算；由圖3B可知，升溫速率升至1.3 ℃/min時(shí)，30號(hào)峰和31號(hào)峰均得到有效分離，能夠進(jìn)行定量計(jì)算；由圖3C可知，隨著升溫速率繼續(xù)升高，30號(hào)峰和31號(hào)峰出現(xiàn)部分重合，28號(hào)峰與29號(hào)峰也出現(xiàn)部分重合。程序升溫速率為1.3 ℃/min為色譜峰有效分離的最優(yōu)條件。

圖3 不同升溫速率的色譜圖Fig. 3 Chromatograms with different heating rates

2.2.2.2 色譜柱流速的選擇

確定最優(yōu)的升溫速率后，固定升溫程序中升溫速率為1.3 ℃/min，改變色譜柱流速分別為0.7、0.8、1.0、1.3 mL/min。由圖4A可知，色譜柱流速為0.7 mL/min時(shí)，30號(hào)峰與31號(hào)峰存在部分重合現(xiàn)象，無(wú)法進(jìn)行定量計(jì)算；由圖4B可知，色譜柱流速為0.8 mL/min時(shí)，30號(hào)峰和31號(hào)峰均能實(shí)現(xiàn)分離，能夠進(jìn)行定量計(jì)算；由圖4C可知，隨著柱流速進(jìn)一步增加到1.0 mL/min，30號(hào)峰和31號(hào)峰出現(xiàn)了部分重合現(xiàn)象；由圖4D可知，色譜柱流速增加到1.3 mL/min時(shí)，30號(hào)峰和31號(hào)峰幾乎重合。故色譜柱流速為0.8 mL/min是反式脂肪酸甲酯與順式脂肪酸甲酯和飽和脂肪酸甲酯的色譜峰有效分離的最佳條件。

圖4 不同色譜柱流速的色譜圖Fig. 4 Chromatograms with different column velocities

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

確定最佳的色譜柱流速和程序升溫條件，得到順式脂肪酸、飽和脂肪酸和16 種反式脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，對(duì)應(yīng)的色譜峰名稱、分子簡(jiǎn)式和保留時(shí)間如表1所示。雪糕樣品中脂肪酸甲酯色譜圖如圖5所示。

圖5 雪糕脂肪酸甲酯色譜圖Fig. 5 Chromatogram of fatty acid methyl esters in ice cream

表1 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰名稱、分子簡(jiǎn)式和參考保留時(shí)間Table 1 Chromatographic peak names, molecular formulae and reference retention times of fatty acid methyl ester standards

續(xù)表1

由表1可知，反式脂肪酸甲酯與順式脂肪酸甲酯和飽和脂肪酸甲酯的色譜峰均能有效分離，實(shí)現(xiàn)了51 種脂肪酸甲酯的基線分離，與GB 5009.257—2016中分別給出的反式脂肪酸甲酯和37 種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖比較，該方法得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖分離效果更佳。同時(shí)，脂肪酸甲酯的出峰順序如下：1）相同碳原子的反式脂肪酸甲酯于順式脂肪酸甲酯之前出峰；2）對(duì)于一烯酸甲酯，碳原子數(shù)越少出峰時(shí)間越早，隨著碳原子數(shù)的增加，出峰時(shí)間推后；3）碳原子數(shù)相同的脂肪酸甲酯，一烯酸甲酯最先出峰，其次是二烯酸甲酯，最后是三烯酸甲酯；4）相同碳原子一烯酸甲酯，反式位號(hào)數(shù)越小出峰越早；全反式二烯酸甲酯和三烯酸甲酯的出峰時(shí)間早于含有順式異構(gòu)的脂肪酸甲酯。

2.4 方法重復(fù)性

分別對(duì)不同含量反式脂肪酸的雪糕進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，得到反式脂肪酸含量的6 個(gè)平行值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。由表2可知：雪糕1反式脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果RSD為1.81%，雪糕2為1.11%，雪糕3為0.76%；根據(jù)GB/T 27417—2017的要求，被測(cè)組分含量為1%時(shí)，RSD≤2.7%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD均小于2.7%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性符合要求。

表2 雪糕反式脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果（n=6）Table 2 Results of determination of trans fatty acids in ice cream (n = 6)

2.5 方法正確性

Fapas14215能力驗(yàn)證樣品在本研究中的測(cè)定結(jié)果為119%，準(zhǔn)確值為94.9%，Z值為0.8，|Z|≤2為滿意值，表明方法正確性符合要求。

2.6 檢出限、定量限

雪糕1樣品重復(fù)測(cè)定6 次，將雪糕1樣品與雪糕10樣品1∶1混合，重復(fù)測(cè)定6 次。由表3可知，雪糕1樣品稀釋1 倍重復(fù)測(cè)定6 次結(jié)果為均能檢出，RSD為2.08%，根據(jù)GB/T 27417—2017的要求，被測(cè)組分含量為0.01%時(shí)，RSD≤5.3%，重復(fù)性符合要求，故0.011%可作為檢出限。雪糕1樣品重復(fù)測(cè)定6 次，測(cè)定結(jié)果平均值為0.020%，RSD為1.81%，重復(fù)性符合要求，故0.020%可作為定量限。

表3 定量限、檢出限結(jié)果測(cè)定Table 3 Limit of detection and limit of quantification for actual samples

2.7 盲樣結(jié)果

隨機(jī)選取的10 種雪糕反式脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果如表4所示。

表4 10 種雪糕反式脂肪酸含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Contents of trans fatty acids in 10 commercial samples of ice cream

3 結(jié) 論

采用隨機(jī)抽取的雪糕樣品進(jìn)行前處理?xiàng)l件、色譜條件優(yōu)化，確定最佳前處理?xiàng)l件為加入8 mL濃鹽酸和10 mL無(wú)水乙醇，經(jīng)SP-2560毛細(xì)管柱分離，氣相色譜儀FID檢測(cè)，面積歸一化法計(jì)算反式脂肪酸組分含量。結(jié)果表明，此方法具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，同時(shí)能夠有效分離反式脂肪酸甲酯與順式脂肪酸甲酯和飽和脂肪酸甲酯，提供了一種能準(zhǔn)確測(cè)定雪糕中反式脂肪酸的檢測(cè)方法。