田露露，華 旭，韓 迪

（潤(rùn)盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

由于健康、營(yíng)養(yǎng)和飲食之間的關(guān)聯(lián)，碳水化合物食品在人類健康中起著重要作用，尤其是在胃腸道（gastrointestinal tract，GIT）功能中[1]，因?yàn)榇蠖鄶?shù)腸道細(xì)菌需要發(fā)酵碳水化合物作為能量來(lái)源[2-3]。碳水化合物包括可消化或不可消化兩類[4]。不可消化低聚糖（nondigestible oligosaccharide，NDO）是指不能被人類消化酶消化，但可由結(jié)腸中的腸道細(xì)菌發(fā)酵的低聚糖，其中大多數(shù)NDO在人體內(nèi)首先水解為小低聚物和單體，然后由厭氧細(xì)菌進(jìn)一步代謝[4]。因此，NDO可以刺激各種細(xì)菌，尤其是有益細(xì)菌的生長(zhǎng)[5]。NDO可能作為益生元發(fā)揮作用[1]。Gibson等于2010年第6次國(guó)際益生菌與益生元科學(xué)協(xié)會(huì)會(huì)議中提出，益生元定義為一種選擇性發(fā)酵成分，可通過(guò)改變胃腸道微生物群的組成和/或活性對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益影響[6]。通常，益生元是通過(guò)酶水解等方法從植物中商業(yè)化提煉[7]。目前，常見的益生元包括菊粉、低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）、低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）、低聚木糖（xylooligosaccharide，XOS）和低聚異麥芽糖（isomalto oligosaccharide，IMO），是主要由果糖、半乳糖、葡萄糖或木糖等單糖組成的NDO[8]。

合生元產(chǎn)品可以選擇性地刺激有益細(xì)菌的生長(zhǎng)，從而提高GIT中益生菌的存活率。通常，合生元配方由益生菌菌株（如乳桿菌和雙歧桿菌）和益生元（如FOS、GOS、XOS和菊粉）組成[9]。為了正確選擇合生元配方，有必要建立某些益生元與特定菌株之間的關(guān)系。因此，菌株在特定碳源上的生長(zhǎng)速率是一個(gè)研究方向。另一個(gè)方向是研究特定碳源如何使細(xì)菌增殖[10]。

之前的研究表明，一些NDO在體外改變腸道微生物群的組成方面起著重要作用。多種碳水化合物已經(jīng)被用作益生元。在大多數(shù)情況下，益生元效應(yīng)是通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，即給藥后的碳水化合物發(fā)酵和/或體內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)來(lái)研究的[3]。產(chǎn)氣和發(fā)酵程度受單體組成、糖苷鍵、聚合度（degree of polymerization，DP）、分子結(jié)構(gòu)、分支方式、細(xì)菌與底物之間的協(xié)同作用等因素的影響[4,8,11]。

本研究的目的是評(píng)估一些市售碳水化合物，尤其是NDO如何影響乳桿菌和雙歧桿菌的體外生長(zhǎng)。研究結(jié)果有助于深入了解影響益生菌發(fā)酵NDO過(guò)程的因素，從而有助于確定如何使用不同類型的碳水化合物配制合適的合生元配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)菌菌株

本研究使用18 株來(lái)自食品或人體的雙歧桿菌和乳桿菌，包括6 株雙歧桿菌和12 株乳桿菌（表1）。

1.1.2 碳水化合物

乳糖（用作對(duì)照品）、MASA和MASB培養(yǎng)基中所需的所有其他化學(xué)品 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳糖醇（純度95%，雜質(zhì)為其他多元醇2.5%、還原糖0.1%）、XOS（純度95%，雜質(zhì)為木糖、木聚糖、葡萄糖、阿拉伯糖）、GOS（純度53.5%，雜質(zhì)為乳糖20%、葡萄糖16.9%）、短鏈菊粉（純度92.3%，雜質(zhì)為果糖、葡萄糖、蔗糖（含量7.6%））、IMO（IMO含量66.6%，（異麥芽糖+異麥芽三糖+潘糖）含量36.8%）、抗性糊精（單糖含量＜1.5%，二糖含量＜3.5%，雜質(zhì)為可消化碳水化合物）、L-阿拉伯糖（純度99.5%）、赤蘚糖醇（純度99.5%）、水蘇糖（純度74.6%，雜質(zhì)為三糖、五糖、蔗糖） 市售；FOS（純度96.4%，雜質(zhì)為葡萄糖2%、蔗糖3%） 百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司；聚葡萄糖（純度92.6%，雜質(zhì)為葡萄糖3.1%、1,6-無(wú)水-D-葡萄糖2.6%、山梨醇1.7%） 丹麥Danisco公司；長(zhǎng)鏈菊粉（純度90%，雜質(zhì)為葡萄糖、蔗糖）、FOS（純度96.5%，雜質(zhì)為蔗糖、無(wú)葡萄糖） 維樂(lè)夫（Vilof）集團(tuán)。

本研究所涉及的13 種不同類型碳水化合物包括益生元、膳食纖維、單糖和糖醇。其中益生元包括菊粉、FOS、IMO、XOS、GOS和水蘇糖，膳食纖維包括抗性糊精、聚葡萄糖，糖醇包括乳糖醇、赤蘚糖醇，單糖包括L-阿拉伯糖。菊粉和FOS為果聚糖，F(xiàn)OS的單糖為乳糖和果糖，GOS的單糖為半乳糖，XOS的單糖為木糖，IMO的單糖為葡萄糖，水蘇糖的單糖為半乳糖、果糖和葡萄糖[12]。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102C紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；BPX-162電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海穎漢化工科技有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；FiveEasy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；BioFlo/CelliGen 115玻璃通氣發(fā)酵罐德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

所有菌株均在-80 ℃的培養(yǎng)基中貯藏，并添加體積分?jǐn)?shù)50%甘油作為冷凍保護(hù)劑。出于貯藏目的，乳桿菌和雙歧桿菌菌株在其最適生長(zhǎng)溫度（37 ℃）厭氧培養(yǎng)。隨后，將來(lái)自儲(chǔ)備培養(yǎng)物的細(xì)胞傳代培養(yǎng)（以體積分?jǐn)?shù)1%將乳桿菌接種至MASA培養(yǎng)基，雙歧桿菌接種至MASB培養(yǎng)基），并進(jìn)一步厭氧培養(yǎng)16 h以形成種子培養(yǎng)物。隨后，將0.32 mL種子培養(yǎng)物分別接種到試管中，每個(gè)試管中含有16 mL不含乳糖的MASB培養(yǎng)基（含有7.5 g/mL碳水化合物作為37 ℃條件下生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)的唯一碳源）。為了進(jìn)行比較，同時(shí)將種子培養(yǎng)物接種到僅含有MASB培養(yǎng)基（含有乳糖）的試管中。杜氏小管被放置在每個(gè)試管中測(cè)試氣體的生成情況。

培養(yǎng)物（16 mL）在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h和72 h，使用分光光度計(jì)測(cè)定培養(yǎng)物在600 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD600nm），pH計(jì)測(cè)定pH值。

MASA培養(yǎng)基組成：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏粉10 g/L、酵母膏5 g/L、K2HPO42 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、CHCOONa 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、吐溫-80 1 g/L。MASB培養(yǎng)基組成：乳糖7.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g/L、牛肉提取物粉10 g/L、K2HPO42 g/L、CHCOONa 5 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、吐溫-80 1 g/L。將培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至6.8，然后進(jìn)行高壓滅菌（121 ℃、20 min）。

1.3.2 產(chǎn)氣情況分析

培養(yǎng)物（16 mL）在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)16 h后，在杜氏小管中觀察氣泡產(chǎn)生情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為了得出益生菌菌株在不同碳水化合物中發(fā)酵的差異，使用Genesis軟件構(gòu)建熱圖，并且使用Genesis軟件中的完整鏈接聚類方法，使用默認(rèn)設(shè)置執(zhí)行分層聚類。柱形圖采用Excel進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株在不同碳源中的生長(zhǎng)情況

對(duì)培養(yǎng)物在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h的OD600nm和pH值進(jìn)行分析。除了干酪乳桿菌（OD600nm0.208、pH 6.02）之外，所有的測(cè)試菌株在MASB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。總的來(lái)說(shuō)，不同碳水化合物的促生長(zhǎng)作用在菌株間表現(xiàn)出很大差異。

當(dāng)13 種碳水化合物用作唯一碳源時(shí)，12 株乳桿菌菌株表現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)趨勢(shì)。大多數(shù)乳桿菌不能有效利用抗性糊精、聚葡萄糖、XOS和赤蘚糖醇。副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌對(duì)FOS、菊粉、IMO、水蘇糖、菊粉（長(zhǎng)鏈）和FOS（Vilof）的促生長(zhǎng)作用非常相似。與乳糖對(duì)照組（OD600nm2.05（羅伊氏乳桿菌）、OD600nm2.02（發(fā)酵乳桿菌），pH 4.79（羅伊氏乳桿菌）、pH 4.71（發(fā)酵乳桿菌））相比，在測(cè)試的乳桿菌中，只有羅伊氏乳桿菌（OD600nm1.79、pH 4.46）和發(fā)酵乳桿菌（OD600nm2.25、pH 4.46）在含有L-阿拉伯糖的情況下生長(zhǎng)良好（OD600nm超過(guò)1.00、pH值低于5.00）。與對(duì)照組（OD600nm3.265、pH 4.37）相比，約氏乳桿菌（OD600nm0.567、pH 5.21）在GOS為碳源時(shí)生長(zhǎng)良好。與對(duì)照組（OD600nm4.25（鼠李糖乳桿菌）、OD600nm3.74（副干酪乳桿菌）、OD600nm3.83（唾液乳桿菌），pH 4.31（鼠李糖乳桿菌）、pH 4.28（副干酪乳桿菌）、pH 4.19（唾液乳桿菌））相比，乳糖醇對(duì)鼠李糖乳桿菌（OD600nm2.57、pH 4.79）、副干酪乳桿菌（OD600nm2.075、pH 4.65）和唾液乳桿菌（OD600nm3.2、pH 4.28）菌株有促進(jìn)生長(zhǎng)作用。與對(duì)照組（OD600nm3.265（約氏乳桿菌）、OD600nm3.83（唾液乳桿菌），pH 4.37（約氏乳桿菌）、pH 4.19（唾液乳桿菌））相比，除了約氏乳桿菌（OD600nm0.706、pH 5.07）和唾液乳桿菌（OD600nm1.152、pH 5.3）之外的乳桿菌都在IMO為碳源時(shí)生長(zhǎng)良好。只有嗜酸乳桿菌、約氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌和唾液乳桿菌在水蘇糖為碳源時(shí)生長(zhǎng)良好?？偟膩?lái)說(shuō)，與其他11 種碳水化合物相比，IMO和GOS對(duì)乳桿菌的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著。

乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)促進(jìn)模式?jīng)]有顯著差異，每個(gè)菌株對(duì)不同的碳水化合物底物表現(xiàn)出不同的效果。GOS對(duì)所有的雙歧桿菌均有顯著的促生長(zhǎng)作用，水蘇糖、IMO、FOS和乳糖醇對(duì)青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和短雙歧桿菌有相似的促生長(zhǎng)作用，菊粉（短鏈和長(zhǎng)鏈）對(duì)除青春雙歧桿菌之外的雙歧桿菌有很弱的促生長(zhǎng)作用。

2.2 不同菌株pH值和產(chǎn)氣情況比較

測(cè)定培養(yǎng)24 h和72 h的培養(yǎng)基pH值，結(jié)果表明，菌株在生長(zhǎng)24 h時(shí)的OD600nm與該菌株生長(zhǎng)的相應(yīng)pH值呈負(fù)相關(guān)，即培養(yǎng)基的最終pH值越低，最終OD600nm越高?？梢越忉尀椋S著生長(zhǎng)的細(xì)菌增多，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸越多。

根據(jù)杜氏小管實(shí)驗(yàn)觀察到，羅伊氏乳桿菌在含有GOS或乳糖（對(duì)照組）的培養(yǎng)基，發(fā)酵乳桿菌在含有乳糖（對(duì)照組）、GOS或水蘇糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生氣體。之前的研究表明，F(xiàn)OS在結(jié)腸中發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生H2和CO2，因此會(huì)給人帶來(lái)不適[9]。一些體外研究表明，與FOS、聚葡萄糖、GOS和IMO相比，菊粉產(chǎn)生的氣體最多[11]。本研究的結(jié)果表明，沒(méi)有一種受試菌株同菊粉或FOS發(fā)酵能產(chǎn)生大量氣體。因此，菊粉和FOS的產(chǎn)氣特性取決于不同的菌株。

2.3 菌株的分層聚類

乳桿菌在不同碳源上的生長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，由圖1可知，基于分層聚類，可以在乳桿菌菌株中區(qū)分2 個(gè)主要分支：第1個(gè)分支包含10 個(gè)表現(xiàn)出最佳生長(zhǎng)情況的菌株；干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌根據(jù)它們利用FOS、菊粉和IMO的能力聚為一類。

圖1 乳桿菌在不同碳水化合物作為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的OD600 nm熱圖Fig. 1 Heatmap of OD600 nm for lactobacilli grown on different carbohydrates as sole carbon source for 24 h

關(guān)于雙歧桿菌，由分層聚類結(jié)果圖2可以看出，有2 個(gè)主要的分支：乳雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌聚為一類；青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和短雙歧桿菌因其利用FOS和水蘇糖的特性而被歸為另一類。

圖2 雙歧桿菌在不同碳水化合物作為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的OD600 nm熱圖Fig. 2 Heatmap of OD600 nm for bifidobacteria grown on different carbohydrates as sole carbon sources for 24 h

2.4 不同碳水化合物對(duì)不同益生元的發(fā)酵特性比較

在所有益生元（FOS、XOS、GOS、菊粉、IMO、抗性糊精、水蘇糖）中，GOS對(duì)除約氏乳桿菌之外的所有測(cè)試菌株都有很強(qiáng)的促生長(zhǎng)效果，可能是由于半乳糖苷酶的誘導(dǎo)[3,13]。該結(jié)果與先前的研究一致，即由半乳糖單體組成的線性鏈益生元比由葡萄糖和果糖單體組成的益生元能更好地發(fā)酵益生菌[14]。雙歧桿菌菌株在其自身可以產(chǎn)生的酶（如β-半乳糖苷酶）生產(chǎn)的低聚糖上表現(xiàn)出最高的生長(zhǎng)速率[3]。

膳食纖維是不易消化的碳水化合物，其DP不小于3[15]。FOS和抗性糊精是2 種不同的益生元，具有不同的糖基單位。FOS是果聚糖，單糖為葡萄糖和果糖，只有一種糖苷鍵，DP為3～5?？剐院奶腔鶈挝粸槠咸烟牵? 種糖苷鍵，平均DP為10。聚葡萄糖是一種高度支化的碳水化合物，具有不同數(shù)量的糖苷鍵，平均DP為12及以上[15]。如圖1所示，抗性糊精和聚葡萄糖對(duì)所有乳桿菌和雙歧桿菌的促生長(zhǎng)作用非常有限，一般來(lái)說(shuō)，利用FOS作為唯一碳源的菌株比利用抗性糊精和聚葡萄糖作為唯一碳源的菌株多，可能是由于抗性糊精和聚葡萄糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，尤其是糖苷鍵[16]。

除副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌之外，所有的菌株對(duì)不同制造商的FOS表現(xiàn)出不同的增長(zhǎng)效應(yīng)。雖然來(lái)自同一來(lái)源，但純度為96.4%的FOS顯示出更好的促生長(zhǎng)效果，這可能是因?yàn)樯a(chǎn)工藝和雜質(zhì)含量不同。

由于缺乏果聚糖酶，果聚糖不能被胃腸道酶消化，因此腸道細(xì)菌（包括雙歧桿菌和乳桿菌）在生長(zhǎng)過(guò)程中利用果聚糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸[17]。之前的研究表明，在果聚糖的細(xì)菌利用中，β-呋喃果糖苷酶的存在是決定因素[18]。果聚糖的細(xì)菌發(fā)酵主要有2 種方式，細(xì)胞外發(fā)酵或進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)代謝[19-20]。一些菌株，如青春雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌產(chǎn)生β-呋喃果糖苷酶[3]，不同的細(xì)菌產(chǎn)生的β-呋喃果糖苷酶顯示出不同的分解β-2,1-糖苷鍵的能力[18]。本研究表明，乳雙歧桿菌對(duì)不同果聚糖的利用率不同，其中FOS的利用率最高，而長(zhǎng)鏈菊粉和FOS（Vilof）的利用率最低。青春雙歧桿菌對(duì)所有果聚糖表現(xiàn)出很高的利用率。短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌對(duì)果聚糖的利用率各不相同。

嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)FOS和菊粉的利用率很高，這與以前的報(bào)道一致：副干酪乳桿菌1195含有一種與細(xì)胞壁相關(guān)的胞外酶，可在細(xì)胞外將大部分果聚糖降解為短鏈，然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被進(jìn)一步水解[19,21-22]，嗜酸乳桿菌具有FOS利用能力[21,23]。同之前的研究相一致的是，卷曲乳桿菌并沒(méi)有顯示出果聚糖的高利用率[24]。

之前的研究表明，與短鏈碳水化合物相比，長(zhǎng)鏈碳水化合物發(fā)酵更慢，產(chǎn)氣更少[11]。在本研究中，短鏈菊粉和長(zhǎng)鏈菊粉發(fā)酵的差異如圖1～2所示。

XOS由通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接的木糖單體組成，DP為2～10[25]。之前的體外研究表明，XOS有利于刺激雙歧桿菌的生長(zhǎng)，但對(duì)乳桿菌沒(méi)有太大影響[26-28]，并且這種作用有菌株特異性[25]。本研究結(jié)果表明，在以XOS作為唯一碳源的培養(yǎng)物中，所有受試菌株的生長(zhǎng)都相對(duì)緩慢，如圖1～2所示，這與之前的研究結(jié)果一致，即觀察到缺乏β-木糖酶活性[3,29]。在本研究中，XOS確實(shí)略微促進(jìn)了一些菌株的生長(zhǎng)，如乳雙歧桿菌和青春雙歧桿菌。然而，沒(méi)有證據(jù)表明XOS有特定的跨膜傳輸系統(tǒng)。

先前的研究表明，DP小于7的IMO可能被帶入微生物細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)被細(xì)胞質(zhì)酶降解[30]。本研究中，在以IMO為唯一碳源的培養(yǎng)基中，約氏乳桿菌和兩歧雙歧桿菌的生長(zhǎng)相對(duì)較慢。

α-半乳糖苷，如水蘇糖，由1～4 個(gè)半乳糖單元組成，通過(guò)α-1,6糖苷鍵連接到葡萄糖部分。體外研究表明，由于α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，雙歧桿菌和乳桿菌能夠以α-半乳糖苷為碳源生長(zhǎng)[31]。青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌的一些菌株可以產(chǎn)生α-半乳糖苷酶[3]。本研究表明，青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌在以水蘇糖為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)良好。

乳糖醇是一種甜味糖醇，對(duì)人體健康有益，因?yàn)樗梢蕴娲墙档蜔崃?，在口腔保健產(chǎn)品中，可以幫助降低齲齒風(fēng)險(xiǎn)，縮短腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間。此外，乳糖醇正在被研究歸類為潛在益生元[32]。之前的研究表明，乳糖醇對(duì)嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌和干酪乳桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[32]。本研究表明，乳糖醇對(duì)鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、唾液乳桿菌和青春雙歧桿菌的生長(zhǎng)有較強(qiáng)促進(jìn)作用。

L-阿拉伯糖是一種甜味戊糖，可選擇性抑制腸道蔗糖酶活性，從而控制攝入蔗糖后的甘油反應(yīng)[33]。因此，L-阿拉伯糖通常用于體質(zhì)量控制配方。在本研究中，L-阿拉伯糖被少數(shù)受試菌株利用，即羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌。

赤蘚糖醇是一種多元醇，常用作甜味劑。根據(jù)早期的體外實(shí)驗(yàn)，赤蘚糖醇被認(rèn)為在24 h內(nèi)不被人體腸道微生物群發(fā)酵[34]。在本研究中，在以赤蘚糖醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中，大多數(shù)菌株的OD600nm小于0.5。

2.5 幾種碳水化合物對(duì)特定菌株促生長(zhǎng)作用比較

選擇在24 h發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)緩慢的幾種菌株及相應(yīng)碳水化合物，進(jìn)行72 h發(fā)酵驗(yàn)證。由圖3～4可知，長(zhǎng)鏈菊粉為碳源時(shí)，嗜酸乳桿菌的OD600nm隨時(shí)間延長(zhǎng)明顯增長(zhǎng)，但格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌和短雙歧桿菌則沒(méi)有這樣的趨勢(shì)。同樣，嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)pH值從24 h到72 h時(shí)也在降低。因此可以得出結(jié)論，長(zhǎng)鏈菊粉的發(fā)酵速度較慢，并且對(duì)嗜酸乳桿菌的促生長(zhǎng)作用更加明顯。這一結(jié)果部分符合之前的研究結(jié)果，即長(zhǎng)鏈菊粉比短鏈菊粉具有更顯著的促進(jìn)作用[20]。然而，在培養(yǎng)24 h時(shí)，長(zhǎng)鏈菊粉對(duì)大多數(shù)菌株的生長(zhǎng)促進(jìn)作用與短鏈菊粉相似或較弱。比如，嗜酸乳桿菌OD600nm,24h為1.914（短鏈菊粉為碳源），OD600nm,24h為1.344（長(zhǎng)鏈菊粉為碳源），OD600nm,72h為1.344（長(zhǎng)鏈菊粉為碳源），短鏈菊粉只有發(fā)酵24 h數(shù)值，因此測(cè)定結(jié)果圖中未顯示。

圖3 幾種碳水化合物對(duì)特定菌株發(fā)酵OD600 nm的作用Fig. 3 Effects of several carbohydrates on fermentation OD600 nm of specific strains

圖4 幾種碳水化合物對(duì)特定菌株發(fā)酵pH值的作用Fig. 4 Effects of several carbohydrates on fermentation pH value of specific strains

長(zhǎng)鏈菊粉發(fā)酵嗜酸乳桿菌比短鏈菊粉緩慢，OD600nm從24 h的1.344增加到72 h的2.095。同樣地，發(fā)酵液的pH值從24 h的4.92下降到72 h的4.36。然而，格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、干酪乳桿菌和短雙歧桿菌則沒(méi)有顯示出緩慢發(fā)酵長(zhǎng)鏈菊粉的趨勢(shì)。之前的研究認(rèn)為，在不同鏈長(zhǎng)的低聚糖混合物中，雙歧桿菌首先發(fā)酵較短的低聚糖[3]。在本研究中，干酪乳桿菌發(fā)酵FOS時(shí)，OD600nm從24 h的3.41增加到72 h的3.63，24 h和72 h的pH值保持不變（4.28），表明這是一個(gè)緩慢的過(guò)程。所有其他測(cè)試菌株，包括嗜酸乳桿菌、格氏乳桿菌、卷曲乳桿菌和短雙歧桿菌沒(méi)有表現(xiàn)出這種趨勢(shì)。因而可以得出結(jié)論，不同碳水化合物的發(fā)酵生長(zhǎng)速率具有菌株特異性。

3 討 論

細(xì)菌利用碳水化合物作為碳源的方式因菌株而異，但都涉及胞內(nèi)或胞外酶以及膜中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[3]。因此，腸道細(xì)菌將多糖分解為低分子質(zhì)量低聚糖，然后通過(guò)解聚酶（即細(xì)胞外、細(xì)菌包膜內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的糖苷酶）降解為單糖[3]。乳桿菌和雙歧桿菌能夠降解的低聚物和多糖的數(shù)量差異很大，很可能是因?yàn)樗鼈儺a(chǎn)生的酶不同[2,35]。

微生物酶的活性受其生長(zhǎng)的碳水化合物來(lái)源的影響。先前的研究表明，細(xì)菌的某些酶的活性取決于它們生長(zhǎng)的底物，例如，當(dāng)有葡萄糖等首選碳源時(shí)，就無(wú)法產(chǎn)生大量相關(guān)酶來(lái)降解低聚物或多糖[3]。

單一菌株和單一碳源底物的純培養(yǎng)生長(zhǎng)研究可用于確定某些菌株與它們能夠分解利用的碳水化合物之間的相關(guān)性。然而，由于腸道微生物群和結(jié)腸環(huán)境的復(fù)雜性，此類研究無(wú)法解釋腸道中碳水化合物的確切發(fā)酵情況[25]。

多年來(lái)，人們一直采用各種方法來(lái)研究益生元和益生菌菌株之間的關(guān)系。人們普遍認(rèn)為，細(xì)菌對(duì)不同碳水化合物的利用有很大差異，這取決于菌株代謝酶和特定底物的生化特性[36]。例如，Broek等[3]研究雙歧桿菌的碳水化合物修飾酶；Watson等[37]測(cè)試68 株細(xì)菌對(duì)10 種碳水化合物的代謝機(jī)制；Finegold等[38]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究得出結(jié)論，服用XOS可增加雙歧桿菌的數(shù)量，但不會(huì)顯著影響乳桿菌的數(shù)量。因此，有必要對(duì)各菌株的酶活性進(jìn)一步研究，并進(jìn)行模擬腸道環(huán)境的體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

眾所周知，益生元可以以有益的方式改變胃腸道微生物群的組成和/或活性。迄今為止，已有大量臨床實(shí)驗(yàn)證明，攝入益生元可以刺激腸道內(nèi)乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)。然而，本研究結(jié)果表明，使用碳水化合物，特別是益生元作為唯一碳源，只能促進(jìn)有限數(shù)量的受試乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)，這與之前的臨床研究結(jié)果相矛盾。因此，可以假設(shè)益生元通過(guò)影響整個(gè)腸道微生物群而對(duì)人類健康有益，但不會(huì)直接影響乳桿菌和雙歧桿菌，腸道微生物群中除乳桿菌或雙歧桿菌以外的一些其他細(xì)菌涉及某些酶，這些酶可降解益生元，然后被某些益生菌利用。

本研究結(jié)果對(duì)益生菌和益生元配方有幫助，并為益生菌和益生元作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了參考。例如，研究表明，唾液乳桿菌G60和副干酪乳桿菌LPc-G110對(duì)口腔健康均有益[39-40]，唾液乳桿菌G60+菊粉比唾液乳桿菌G60更能緩解口臭和舌苔[39]。本研究結(jié)果表明，唾液乳桿菌G60幾乎不能在菊粉上生長(zhǎng)，而副干酪乳桿菌LPc-G110可以。因此可以認(rèn)為，菊粉的有益功能不是來(lái)源自其對(duì)唾液乳桿菌G60的促生長(zhǎng)作用。

4 結(jié) 論

本研究確定了不同碳水化合物對(duì)不同雙歧桿菌和乳桿菌菌株發(fā)酵的作用，這種發(fā)酵結(jié)果具有菌株特異性。在培養(yǎng)24 h時(shí)，抗性糊精、聚葡萄糖和赤蘚糖醇對(duì)所有菌株的促生長(zhǎng)作用都非常有限，可能是因?yàn)檫@些菌株缺乏相應(yīng)的酶水解糖苷鍵。短鏈菊粉和長(zhǎng)鏈菊粉的發(fā)酵特性具有菌株特異性，長(zhǎng)鏈菊粉對(duì)嗜酸乳桿菌的發(fā)酵比較緩慢，但不適用于其他菌株。一些益生元，如XOS和菊粉，對(duì)大多數(shù)受試菌株沒(méi)有表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促生長(zhǎng)作用。據(jù)推測(cè)，一些益生元對(duì)人類健康有益，不是通過(guò)直接促進(jìn)乳桿菌或雙歧桿菌的生長(zhǎng)，而是首先被腸道中的一些其他細(xì)菌降解，然后被益生菌菌株利用。