王 磊，屈 紅，鄭 君，顧立萍，2

1 甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050;2 甘肅省中醫(yī)藥研究院

外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變又稱為“外陰營(yíng)養(yǎng)不良”“外陰白色病變”，它是以女性外陰皮膚黏膜組織發(fā)生色素改變和變性為特征的一組慢性疾患［1-2］，以外陰皮膚瘙癢、色素減退白化、黏膜萎縮變薄或增厚粗糙為主要臨床表現(xiàn)［2］。目前該病病因及發(fā)病機(jī)理尚不明了，有研究發(fā)現(xiàn)［3-5］可能是真皮層內(nèi)血管壁基底膜增厚，中、底層血管擴(kuò)張，局部血管閉塞，微血管數(shù)量減少，局部微循環(huán)障礙，進(jìn)而引起表皮生長(zhǎng)發(fā)生障礙。常規(guī)藥物及物理療法效果不佳，且復(fù)發(fā)率高，是臨床治療難題。聚焦超聲治療是利用超聲波的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)及功能調(diào)節(jié)作用，使真皮層內(nèi)病變組織發(fā)生變性，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞膜通透性，改善微血管和神經(jīng)末梢營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)局部組織再生與重建，從而使病變皮膚恢復(fù)正常［6］。我科運(yùn)用聚焦超聲治療外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變已10 余年，并根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)制定了科室協(xié)定方參菊洗劑，在聚焦超聲治療后皮膚恢復(fù)過(guò)程中給予參菊洗劑煎水先熏洗后坐浴，增加臨床療效，但其治療機(jī)理尚待研究。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種具有促進(jìn)血管生成并增加血管通透性的糖蛋白，內(nèi)皮素1（endotelin-1，ET-1）是一種具有血管收縮活性的多肽物質(zhì)，也是一種神經(jīng)肽類致癢介質(zhì)，兩種物質(zhì)在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化法觀察治療前后外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變患者皮膚組中VEGF、ET-1的表達(dá)，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2020年1～9月在甘肅省中醫(yī)院就診的外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變患者65 例，剔除因依從性差未能取得完整病理標(biāo)本的病例5例，將其余60 例隨機(jī)分為對(duì)照組與觀察組各30例。觀察組患者年齡最大64 歲，最小21 歲，平均（41.03±11.34）歲；病程最長(zhǎng)11 年，最短6 個(gè)月，平均（4.42±2.95）；慢性單純性苔蘚14 例，硬化性苔蘚型16例。對(duì)照組患者年齡最大62歲，最小22歲，平均（40.7±10.39）歲；病程最長(zhǎng)9年半，最短7個(gè)月，平均（4.19±2.44）；慢性單純性苔蘚13例，硬化性苔蘚型17例。兩組患者年齡、病程、病理類型等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)及病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。

1.2.2 中醫(yī)診斷及辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中醫(yī)婦科學(xué)》［8］“陰癢病”濕熱下注型標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)［7-8］；2）治療前或治療中不能接受其他治療；3）知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)1）經(jīng)期、妊娠及哺乳期患者；2）病歷資料記錄及追蹤不完整者；3）其他婦科疾病有上述癥狀表現(xiàn)者；4）基礎(chǔ)情況差，不能耐受治療，全身基礎(chǔ)疾病較多或糖尿病患者。

1.5 剔除及脫落標(biāo)準(zhǔn)1）依從性差，不按研究方案治療及隨訪者；2）治療期間出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或意外事件不能繼續(xù)治療者；3）中途自動(dòng)退出者。

1.6 治療方法

1.6.1 對(duì)照組 予聚焦超聲治療儀（重慶海扶技術(shù)有限公司）治療。具體方法：患者取膀胱截石位，調(diào)節(jié)治療儀參數(shù)：頻率10.60 MHz，功率3.5～4.5 W，脈沖1200 Hz?；继幊Ｒ?guī)消毒后以0.75% 利多卡因行局部阻滯麻醉。麻醉起效后將超聲探頭貼緊病變皮膚。掃描方式：以1～2 mm/s速度勻速直線移動(dòng)掃描；治療范圍：覆蓋全部外陰病損區(qū)及邊緣外0.5 cm 處；時(shí)間10～30 min；能量2000～4000 J。治療后病變皮膚明顯充血水腫，毛孔粗大，皮溫升高3～5℃，皮膚黏膜完整。治療結(jié)束后立即涂抹燙傷膏，并予冰袋冰敷3 min，歇5 min。12～24 h后停止。經(jīng)期停用，共治療3個(gè)月經(jīng)周期。

1.6.2 觀察組 在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上于術(shù)后第3 天外陰無(wú)明顯水腫后開(kāi)始給予參菊洗劑（苦參30 g，野菊花30 g，地膚子15 g，白鮮皮15 g，紫花地丁15 g，蛇床子15 g，土茯苓15 g，黃柏15 g，當(dāng)歸15 g，白芍20 g，淫羊藿10 g），上方加水煎煮，1劑煎煮2 次，每次取汁800～1000 mL，趁熱先熏10 min，待藥液溫度降至37～40°左右將患處全部浸泡于藥液中約15 min，每晚1 次. 經(jīng)期停用，共治療3個(gè)月經(jīng)周期。

1.7 觀察指標(biāo)VEGF、ET-1 表達(dá)及微血管計(jì)數(shù)。治療前、后分別取兩組患者外陰病變皮膚活組織1～2塊，標(biāo)本離體后立即予10%甲醛固定，石蠟包埋切成厚度為4 μm的薄片。1）采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照羅氏（Bench Mark Gx）DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供）說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。VEGF 陽(yáng)性結(jié)果為檢測(cè)組織細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)中觀察到棕黃色至深棕色染色，其染色結(jié)果參考CHOW 等［9］的標(biāo)準(zhǔn)，以染色陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)算。無(wú)染色為（-），陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為（+），5%～15% 為（++），＞15% 為（+++）。2）ET-1陽(yáng)性結(jié)果為檢測(cè)組織目標(biāo)的鱗狀上皮基底層、細(xì)胞膜或包漿中可觀察到棕黃色至深棕色染色。參考及判讀同VEGF。3）微血管計(jì)數(shù)采用Weidner［10］方法：在低倍鏡（×100）下觀察到微血管密集區(qū)，在高倍鏡（×400）下選擇5 個(gè)相互不連續(xù)不重疊的視野分別計(jì)數(shù)，取平均值記為MVD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變皮膚活組織中VEGF分布情況VEGF 主要在外陰表皮、真皮的成纖維細(xì)胞中表達(dá)，在上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿和包膜中也可見(jiàn)其表達(dá)。兩組治療后VEGF陽(yáng)性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 外陰病變皮膚組織中VEGF表達(dá)情況（×400）

表1 兩組外陰病變皮膚活組織中VEGF表達(dá)情況

2.2 外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變皮膚活組織中ET-1分布情況ET-1 主要在外陰皮膚的鱗狀上皮基底部及血管內(nèi)皮細(xì)胞的包膜及包漿中表達(dá)。治療3月后兩組患者ET-1分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

圖2 外陰病變皮膚組織中ET-1表達(dá)情況（×400）

表2 兩組外陰病變皮膚活組織中ET-1表達(dá)情況

2.3 微血管計(jì)數(shù)的MVD值治療后兩組MVD值均較治療前改善（P＜0.01）；觀察組改善優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 兩組外陰病變皮膚活組織中MVD值比較（±s）

表3 兩組外陰病變皮膚活組織中MVD值比較（±s）

組別觀察組對(duì)照組tP例數(shù)30 30治療前12.67±1.49 12.60±1.47治療后3月17.67±1.97 16.00±1.41 3.3280＜0.01 t 11.07 9.10 p＜0.01＜0.01

3 討論

外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變作為一種慢性非腫瘤病變。VEGF 是一種具有高度生物活性的功能性糖蛋白，最早在牛垂體的腺泡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并提取［11］，它可與特異性受體相結(jié)合作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞而發(fā)揮作用，具有促進(jìn)血管生成，增加血管通透性等作用。主要作用部位在血管內(nèi)皮細(xì)胞，機(jī)制可能是與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體高親和力結(jié)合后，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，進(jìn)而促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、加速胞外基質(zhì)溶解及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，形成毛細(xì)血管袢。同時(shí)，可增加毛細(xì)血管通透性，致使血漿蛋白外漏，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞間質(zhì)，從而加速生成體內(nèi)新生血管［12-14］，在組織損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。ET 是最早于1988 年從豬動(dòng)脈中提取而得到的一種具有血管收縮活性的多肽物質(zhì)，是產(chǎn)生于血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎髓質(zhì)、巨噬細(xì)胞的一種血管收縮因子。ET 根據(jù)其肽結(jié)構(gòu)分為ET-1、ET-2、ET-3。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1 收縮血管的能力最強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間最久［15］。ET-1 不僅存在于心血管系統(tǒng)，并且廣泛存在于人體其他組織，如：肺、肝、腎、子宮、卵巢、皮膚等。ET 的生物學(xué)效應(yīng)決定了其在微血管循環(huán)中的重要作用［16-17］。另外它還是一種神經(jīng)肽類致癢介質(zhì)，能夠直接刺激瘙癢性神經(jīng)末梢，或通過(guò)釋放內(nèi)源性介質(zhì)和組胺的間接作用引起瘙癢［18-19］。研究發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)注射ET-1主要通過(guò)激活肥大細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)元上的內(nèi)皮素A（ET-A）受體引起搔抓反應(yīng)［20］。因此認(rèn)為ET-1 不僅參與調(diào)節(jié)血管功能，還是一種致癢介質(zhì)。在外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變的發(fā)生中可能起重要作用。

聚焦超聲是目前公認(rèn)的治療外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變的一種安全有效的物理療法。郭菊芳等［21］對(duì)聚焦超聲治療該病的療效做了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，聚焦超聲治療外陰上皮非瘤樣病變的臨床療效較其他傳統(tǒng)藥物及物理治療高，復(fù)發(fā)率低，是一種有前景的新型治療方法。

參菊洗劑方中苦參味苦性寒，可清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲(chóng)止癢；野菊花疏散風(fēng)熱，清肝明目，清熱解毒，兩藥合用既清肝經(jīng)濕熱，又祛風(fēng)燥濕而止癢，同為君藥；地膚子、白鮮皮清熱利濕，祛風(fēng)止癢，兩藥不僅止癢，又能除濕止帶為臣；紫花地丁加強(qiáng)清熱解毒之功；黃柏、土茯苓清利下焦?jié)駸?；蛇床子苦辛溫，歸腎經(jīng)，具有燥濕祛風(fēng)，殺蟲(chóng)止癢之功；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝，當(dāng)歸可行血活血，意為“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”；淫羊藿溫?zé)幔瑲w肝腎經(jīng)，溫腎陽(yáng)，祛風(fēng)濕，為使藥。全方配伍合理，共奏清熱除濕，滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血祛風(fēng)止癢之功效。加之將藥物煎湯熏洗坐浴治療可使藥物避開(kāi)肝臟“首過(guò)效應(yīng)”直達(dá)病灶，迅速提高病變局部藥物濃度，促進(jìn)外陰部氣血旺盛，使皮膚得到濡養(yǎng)。多項(xiàng)研究表明［22-24］，經(jīng)皮局部給藥可促進(jìn)吸收，是一種有效的治療方法，局部坐浴軟化皮膚，開(kāi)通毛孔，有利于藥物滲透至真皮層，促進(jìn)藥物吸收，改善局部血液循環(huán)和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。

本研究結(jié)果顯示在聚焦超聲治療后給予中藥參菊洗劑熏洗外陰能增加病變皮膚中VEGF 表達(dá)，降低ET-1 表達(dá)，同時(shí)能增加組織中微血管數(shù)目。推測(cè)其可能的機(jī)理是通過(guò)改善病變皮膚微循環(huán)、降低瘙癢介質(zhì)水平而發(fā)揮療效。