陸玉婷，安桂葉，張曉艷，楊 倩，霍永利，李佃貴

（1.河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050000；2.河北中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院脾胃病科，河北 石家莊 050000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸道疾病，臨床以慢性起病、遷延不愈、易反復發(fā)作為特點，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾?。?］。大部分患者臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及黏液膿血便，西方國家此病發(fā)病率高。據(jù)流行病學統(tǒng)計，我國UC 的發(fā)病率及患病率也呈逐年升高的趨勢。當前西醫(yī)治療UC 以氨基水楊酸類藥物及類固醇激素為主［2］，但是存在著副作用大、復發(fā)率高等缺點。我國傳統(tǒng)中醫(yī)學在UC 的診療中發(fā)揮了其獨特的優(yōu)勢，國醫(yī)大師李佃貴教授總結(jié)50 余年的經(jīng)驗，逐漸確立濁毒學說［3］，認為濁毒為UC 發(fā)病的啟動因子，以濁毒內(nèi)蘊證為其主要病機［4］，自擬翁連解毒湯方治療UC，前期研究表明其臨床療效顯著［5］。免疫因素在UC 的發(fā)病機制中占有重要的位置，其中細胞因子、腫瘤壞死因子與UC 的發(fā)病有著重要的聯(lián)系［6］。本研究旨在探討翁連解毒湯對UC 大鼠血清白介素18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及結(jié)腸組織黏蛋白-2（MUC2）表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

購買河北醫(yī)科大學動物中心清潔級Wistar 雄性大鼠60 只（動物合格證號：2008220），體質(zhì)量（200±20）g。本實驗所涉及的方案及操作流程已獲得河北中醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物及制備

翁連解毒湯組成：黃連6 g，白頭翁15 g，苦參6 g，蒲公英15 g，紅景天、大血藤、白芍、防風、黃柏、秦皮、地榆、升麻、葛根、陳皮各12 g，茯苓15 g，炒白術(shù)6 g，薏苡仁20 g，炙甘草6 g。中藥為配方免煎顆粒（廣東一方制藥有限公司）。用80 ℃無菌飲用水將配好的中藥免煎顆粒攪拌溶解，按照人體與大鼠間體表面積等效劑量比值換算出高、中、低劑量組大鼠每公斤體重每天分別給藥劑量為43.8、21.9、10.95 g，將相應劑量的免煎顆粒加入2 mL 的無菌飲用水稀釋成混懸液，對應的濃度分別為5.92、2.96、1.48 g/mL，制備好藥液放置于4 ℃冰箱保存。

美沙拉嗪腸溶片（惠迪，生產(chǎn)廠家為葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司，規(guī)格：0.25 g，批號：201222）。將藥片研末過篩，按等效劑量比值給藥劑量為0.36 g·kg-1·d-1），加入2 mL 無菌飲用水配成0.045 g/mL 濃度的藥液，貼標簽備注，放冰箱冷藏。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 試劑盒 IL-18、TNF-α 定量酶聯(lián)檢測試劑盒（批號：20180319，上海森雄科技實業(yè)有限公司）；ABC 免疫組化試劑盒（PK-4000，Vector Laboratories，Inc.）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（編號：C0105，索來寶科技有限公司）；三硝基苯磺酸（批號：SL-BG2566V，美國sigma 公司）。

1.3.2 檢測儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀（MK3 FC，Thomer Fisher 公司）；顯微圖像分析系統(tǒng)（HMIAS-2000，武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Leica DFC295，日本奧林巴斯公司）；高速冷凍離心機（1-15K，Thermo 公司）；石蠟切片機（德國Leica 公司）；光學顯微鏡［蔡司光學儀器（上海）公司］。

1.4 造模與分組

60 只大鼠隨機分為空白組、模型組及中藥高、中、低劑量組和美沙拉嗪組，共6 組，每組10 只，用三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇復合誘導UC 大鼠模型［7］，大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，造模前記錄大鼠的一般情況、體重、糞便性狀及隱血情況，大鼠禁食（期間不禁水）24 h 后開始造模，造模開始前用乙醚對大鼠進行麻醉，麻醉完全后，根據(jù)TNBS 100 mg/kg 劑量，經(jīng)肛門注入0.6 mL 的TNBS-乙醇溶液以灌腸，待結(jié)腸黏膜與混合液充分接觸后將大鼠平放于籠內(nèi)。同時空白組經(jīng)肛門注入等體積的生理鹽水，造模完畢后，等待大鼠蘇醒，蘇醒后全部大鼠恢復正常的飲食、飲水。造模3 d，可見到大鼠糞便性狀的改變，出現(xiàn)稀便及膿血等，隨機抽取2 只（模型組、中藥高劑量組）處死，剖取結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸黏膜有充血水腫，潰瘍形成，確認UC 模型建立成功。實驗結(jié)束后，中藥高、中劑量組及美沙拉嗪組各死亡1只，其中2 只因灌胃液誤入氣管所致，1 只死因不明。

1.5 動物給藥

造模成功后，于第4 天開始灌胃給藥，西藥組予美沙拉嗪0.36 g/kg，翁連解毒湯低、中、高劑量組分別予10.95、21.9、43.8 g/kg，空白組、模型組給予等體積的生理鹽水，每日灌胃1 次，均連續(xù)給藥2 周。

1.6 標本采集及處理

末次給藥后，禁食24 h，在此期間不禁水，所有大鼠經(jīng)水合氯醛麻醉之后，迅速于右側(cè)股動脈處取血4 mL，凝固后離心15 min，取其上清液標記后置于－20 ℃冰箱保存。脫頸處死大鼠，沿腸系膜縱軸剪開，留取肛門以上約8 cm 結(jié)腸組織，生理鹽水沖洗腸道，濾紙吸干水分，肉眼觀察后放入編碼的40 g/L 的多聚甲醛固定液中密封避光，24 h 后切取病變處，進行石蠟包埋切片，常規(guī)HE 染色，封片，進行鏡下觀察。

1.7 指標檢測

1.7.1 大鼠一般狀況及疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評分 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、皮毛情況（光澤度、密度）、飲食量、糞便性狀及便血等情況，并做記錄，同時測量每只每日大鼠的體質(zhì)量。肛門消毒后采集糞便，采用鄰甲苯胺法［8］測量糞便隱血情況。根據(jù)DAI 評分標準［9］進行評分，DAI＝（體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù)）/3。見表1。

表1 大鼠DAI 評分標準Tab 1 Standard for evaluation of DAI in rats

1.7.2 鏡下觀察 大鼠結(jié)腸組織行常規(guī)HE 染色之后，光鏡下觀察結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)。

1.7.3 生化指標檢測 依照試劑盒說明書規(guī)定的標準進行操作，IL-18 和TNF-α 血清含量用酶聯(lián)免疫法檢測，免疫組化法檢測結(jié)腸組織中MUC2 的蛋白含量，在細胞測量模式下測其平均光度值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況及DAI 評分

2.1.1 大鼠一般狀況 空白組大鼠精力充沛，反應靈敏，飲食正常，體質(zhì)量明顯增加，毛發(fā)光澤，無稀便，便中無膿血、黏液。其余各組大鼠造模后，出現(xiàn)納食量減少，體重減輕，靜臥少動，精神差，大便不成形伴有膿血便等改變。藥物灌胃后，各用藥組開始出現(xiàn)活動增多，食欲好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量增加，以中藥高、中劑量組及美沙拉嗪組大鼠一般狀況好轉(zhuǎn)更為明顯。模型組大鼠自造模后一般狀況始終較差，精神萎靡，毛發(fā)黯淡，飲食減少，體質(zhì)重下降，肛周污穢。

2.1.2 大鼠DAI 評分結(jié)果 與空白組比較，模型組及各給藥組大鼠DAI 評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組及美沙拉嗪組DAI 評分均有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥高、中劑量組與美沙拉嗪組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在給藥組中，中藥低劑量組DAI 評分最高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠DAI 評分比較（分，±s）Tab 2 Comparison of DAI scores of rats in each group（score，±s）

表2 各組大鼠DAI 評分比較（分，±s）Tab 2 Comparison of DAI scores of rats in each group（score，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

DAI 評分0.00±0.00 3.28±0.49*1.56±0.44*△#1.59±0.52*△#2.81±0.44*△1.62±0.50*△#309.790＜0.05組別空白組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組美沙拉嗪組n 10 999 10 9 FP

2.2 結(jié)腸組織病理觀察結(jié)果

病理切片經(jīng)HE 染色后，空白組大鼠可觀察到結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰，腺體、隱窩形態(tài)正常，排列規(guī)則，杯狀細胞豐富，未見炎性細胞浸潤。與空白組相比，模型組可見腺體遭到嚴重破壞，隱窩變形結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細胞大量丟失，黏膜層及黏膜下層可見浸潤的炎性細胞。與模型組相比，中藥高劑量組、中藥中劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸黏膜得到修復和改善，腺體結(jié)構(gòu)基本完整，炎性細胞浸潤明顯減少。中藥低劑量組腺體黏膜結(jié)構(gòu)略欠清晰，可見少量炎性細胞浸潤。見圖1A～F。

圖1 各組結(jié)腸組織病理學變化（HE 染色，×200）Fig 1 Histopathological changes in each group（HE staining，×200）

2.3 生化指標檢測結(jié)果

2.3.1 ELISA 檢測結(jié)果 與空白組相比，模型組IL-18、TNF-α 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組IL-18、TNF-α 含量均有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中，中藥高劑量組、中藥中劑量組與美沙拉嗪組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），IL-18、TNF-α 含量均低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠IL-18、TNF-α 比較（pg/mL，±s）Tab 3 I Comparison of L-18 and TNF-αof rats in each group（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠IL-18、TNF-α 比較（pg/mL，±s）Tab 3 I Comparison of L-18 and TNF-αof rats in each group（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

TNF-α 13.70±2.23 20.51±4.25*14.69±4.43*△#14.86±5.37*△#16.13±3.18*△14.55±3.15*△#39.495＜0.05組別空白組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組美沙拉嗪組n 10 999 10 9 FP IL-18 142.31±27.33 199.42±70.32*172.85±22.82*△#174.38±31.97*△#181.79±29.46*△173.15±23.50*△#14.546＜0.05

2.3.2 免疫組化檢測結(jié)果 與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2 表達水平明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，各給藥組MUC2 表達水平均有增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中藥高劑量、中藥中劑量組與美沙拉嗪組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中藥低劑量組MUC2 表達水平低于其余各給藥組，陽性細胞分布范圍低于其余各給藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 各組大鼠MUC2 蛋白積分光密度的比較（±s）Tab 4 Comparison of integral optical density of MUC2 protein in each group of rats（±s）

表4 各組大鼠MUC2 蛋白積分光密度的比較（±s）Tab 4 Comparison of integral optical density of MUC2 protein in each group of rats（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05;與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

MUC2 20 853.12±842.16 8 469.28±1 035.49*16 996.39±868.28*△#16 895.16±869.39*△#14 369.25±907.35*△16 495.69±813.55*△#228.736＜0.05組別空白組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組美沙拉嗪組n 10 999 10 9 FP

圖2 翁連解毒湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸上皮組織MUC2 蛋白表達的影響（×200）Fig 2 Effect of Wenglianjiedu decoction on expression of MUC2 protein in colonic epithelium of rats with ulcerative colitis（×200）

3 討論

UC 是一種慢性、特發(fā)性腸道炎癥疾病，由于UC 發(fā)病機制尚不完全明確，因此本病并無特效藥治療?，F(xiàn)代醫(yī)學治療UC 以激素、氨基水楊酸制劑、免疫抑制劑為主。美沙拉嗪屬氨基水楊酸類制劑，目前被廣泛用于輕、中度UC 的治療，雖療效值得肯定，但存在著不良反應多、易反復等問題，降低了患者生活質(zhì)量。中醫(yī)藥在治療UC 的過程中具有多系統(tǒng)、多靶點的整體調(diào)節(jié)作用，在UC 患者的臨床治療過程中有其獨特的優(yōu)勢，尤其中藥復方制劑對于調(diào)整免疫、抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥因子等起著重要作用，能穩(wěn)定病情，增強療效［10］。

從古至今，各路醫(yī)家對本病的認識不斷完善，傳統(tǒng)醫(yī)學將本病歸為“腸辟”、“滯下”、“腸風”、“痢疾”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有對“腸辟”的病因病機論述，書中認為“腸辟”的病因病機為“陰陽失和，邪氣中陰”，本病的發(fā)病主要與飲食不當、情志失調(diào)、脾胃虛弱、血絡腸絡等相關［11］?，F(xiàn)代醫(yī)家國醫(yī)大師李佃貴教授首創(chuàng)“濁毒”理論，從濁毒角度認識UC，認為濁毒內(nèi)蘊為UC 的主要病機，病變部位在腸，主要損傷腸絡［12］，其發(fā)展機理為感受外邪，或飲食不潔（不節(jié)）等因素作用于脾胃虛弱之體，脾胃運化無權(quán)，釀成濕熱化生濁邪，膠結(jié)于腸腑，日久成毒，進而濁毒之邪損傷腸道脂膜血絡，化腐成膿，內(nèi)潰成瘍［13］。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，京津冀地區(qū)UC 中醫(yī)證候分布主要以濁毒內(nèi)蘊證為主［14］。翁連解毒湯基于濁毒內(nèi)蘊的病機所創(chuàng)立，以化濁解毒、涼血止痢為治療原則，方藥組成為黃連、白頭翁、苦參、蒲公英、紅景天、大血藤、白芍、防風、黃柏、秦皮、地榆、升麻、葛根、陳皮、茯苓、炒白術(shù)、薏苡仁、炙甘草。黃連具有清熱燥濕止瀉之功，黃連中主要的化學成分小檗堿具有顯著抗炎作用，使促炎細胞與抗炎細胞達到一種平衡狀態(tài)，有研究表明小檗堿對結(jié)腸炎癥狀態(tài)有很好的治療效果，在中國人群中的廣泛使用也說明其具有很好的耐受性［15，16］。白頭翁具有清熱解毒，消癰散結(jié)之功效，擅祛毒愈瘍。中藥藥理學研究顯示，白頭翁中的皂苷類成分具有調(diào)節(jié)促炎因子及TNF-α 的潛力，具有免疫調(diào)節(jié)作用，同時能抑制癌細胞的增殖，誘導其凋亡，因此對于反復遷延難愈的UC，能有效降低其癌變的風險［17，18］?？鄥⒒瘽峤舛眷顫?，黃柏尤善利下焦?jié)駸幔咄茫睬迥c道之濕熱；茯苓、白術(shù)、薏苡仁共行滲除脾濕，健脾止瀉之效；蒲公英、大血藤清熱解毒活血，既清除大腸濁毒，又活血止?。患t景天活血化瘀，解毒止痛，使腸絡瘀血得以消散，脾胃得以運化，濁毒無以蘊生；地榆清熱涼血，收澀止血，與白頭翁相配伍，澀中兼通，是治療血痢的常用藥對之一；秦皮微苦、微澀，性寒，清熱澀腸止??；葛根味辛升發(fā)，能升發(fā)清陽之氣，鼓舞脾胃清陽之氣，而奏止瀉痢之功；防風作為風藥，能行、能使、能引，白術(shù)祛濕止瀉，白芍柔肝緩急止痛，需借助風藥升浮，助生長之勢，行化濁解毒之功；炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏涼血止痢，化濁解毒之功。

UC 的發(fā)生是免疫紊亂、宿主易感等多種因素造成的結(jié)果，腸道持續(xù)存在的慢性炎癥是其重要的特征。UC 發(fā)病的關鍵因素在于IL、TNF-α 等促炎細胞因子的大量釋放［19］。IL-18、TNF-α 等是公認的促炎因子，在免疫應答中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用。正常狀態(tài)下，抗炎與促炎因子處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，如果IL-18、TNF 等促炎因子分泌增加，這種動態(tài)平衡被打破，機體則會啟動免疫系統(tǒng)，導致促炎因子釋放、抑制炎癥細胞因子的凋亡，產(chǎn)生炎癥和毒性反應，從而形成潰瘍。中醫(yī)藥通過多靶點、多系統(tǒng)的整體調(diào)節(jié)，在維持其動態(tài)平衡起到重要的作用［5］。腸道黏膜層對于外來的抗原有防御作用，黏膜層中的MUC2 對腸道有直接的保護作用。MUC2 表達下降，黏膜屏障功能受到破壞，腸腔內(nèi)抗原、內(nèi)毒素則會誘發(fā)免疫反應，形成炎癥［20］。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥各劑量組IL-18、TNF-α 分泌均有下降，MUC2 蛋白表達增加；中藥高、中劑量組與美沙拉嗪組相差不大，中藥低劑量組IL-18、TNF-α 在治療組中含量最高，MUC2 蛋白表達最低。結(jié)果表明，翁連解毒湯不同用藥劑量治療UC 療效不同，中藥高、中劑量組療效優(yōu)于中藥低劑量組，但中藥高劑量組與中藥中劑量組療效差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明當中藥劑量達到一定的血藥濃度時，翁連解毒湯的療效不隨劑量的增加而增強，以此為臨床應用提供了依據(jù)。中藥高、中劑量組與美沙拉嗪組療效差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但大量臨床試驗表明，美沙拉嗪存在著明顯的肝臟、腎臟、胃腸道等多個系統(tǒng)的不良反應，中藥組具有復發(fā)率低、不良反應小等優(yōu)點。

綜上所述，翁連解毒湯能明顯降低UC 模型大鼠IL-18、TNF-α 的含量，上調(diào)MUC2 的表達，抑制炎癥因子的釋放，保護腸黏膜，促進損傷黏膜的修復，在治療UC 中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗炎、抗氧化作用。但是本研究仍存在一定的局限性：（1）因受研究經(jīng)費預算、時間、場地等因素影響，各實驗組樣本量較少，致本研究偏倚較大，后期研究中可擴大樣本量以增強本研究的可信度；（2）本研究旨在探討翁連解毒湯對于促炎因子IL-18、TNF-α 的作用機制，觀察指標較少，后期研究中可增加抑炎因子等指標以更加全面明確翁連解毒湯的作用機制。

作者貢獻度說明：

陸玉婷：動物實驗的操作及數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；安桂葉：參與實驗實施；張曉艷：數(shù)據(jù)整理與分析；楊倩：項目（中醫(yī)藥防治重大疑難疾?。冃越Y(jié)腸炎））負責人；霍永利：科研設計，對文章進行審校；李佃貴：理論指導。

本文無利益沖突。