劉建兵，林 風(fēng)，林 軍，鄭秋霞，蘇瀚星，吳麗云

（福建省微生物研究所福建省紅曲微生物技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福建 福州 350007）

蕪菁（Brassica rapaL.）別名蔓菁、芫根、盤菜、元根、圓根等，在藏藥中又叫“妞媽”（《四部醫(yī)典》）［1，2］。蕪菁是十字花科蕓苔屬一年或二年生草本植物，植株可以高達(dá)1 m，根、莖、葉均可食用，其塊根是重要的蔬菜，塊根肉質(zhì)，圓球形、扁圓球形或短圓錐形，其外形圓似蘿卜，味甜，密實(shí)度高。蕪菁是藏區(qū)傳統(tǒng)的藥食兩用植物，《本草綱目》、《太平圣惠方》中早有記載：“其氣味苦，溫，無(wú)毒，具有美容、醒酒、促消化，增強(qiáng)體質(zhì)等功效”，蕪菁還是一種味道鮮美，安全無(wú)毒的蔬菜，在藏區(qū)享有“小人參”美稱［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，蕪菁富含黃酮、多糖、三萜、硫代葡糖糖苷、脂肪酸等多種生物學(xué)活性成分，具有顯著的抗炎、抗氧化、抑菌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和降血脂等功效，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域正受到廣泛的關(guān)注［4］。Li 等［5］通過(guò)小鼠模型發(fā)現(xiàn)蕪菁多糖可調(diào)節(jié)炎癥因子和凋亡因子，降低四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷，提示蕪菁多糖具有開(kāi)發(fā)成保肝藥的潛力；張發(fā)斌等［6］以糖尿病模型小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)蕪菁正丁醇提取物可有效降血壓、降血脂、提高胰島素水平。

高脂血癥是一種在患者血漿內(nèi)一種或多種脂類異常超標(biāo)的全身性疾病，可表現(xiàn)為血脂總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇的異常。隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，生活水平的提高，人們的膳食營(yíng)養(yǎng)日益增加，但高脂血癥患者數(shù)量也不斷增加，在我國(guó)血脂異?；颊咭堰_(dá)1.6 億人。高脂血癥是糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的主要誘因之一，因此預(yù)防和控制高脂血癥對(duì)于心血管疾病的預(yù)防有著重要的意義。目前，對(duì)高脂血癥主要通過(guò)飲食或藥物治療，其中他汀類藥物是應(yīng)用最廣泛的降脂藥物，但是藥物治療停藥后很容易反彈，還會(huì)帶來(lái)一定的毒副作用，因此尋找一種安全有效的措施來(lái)預(yù)防和治療高脂血癥變得越來(lái)越重要［7］。

本文旨在通過(guò)體外膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞模型評(píng)價(jià)蕪菁的降血脂活性，再利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)蕪菁的降血脂作用機(jī)制進(jìn)行分析，為蕪菁的降血脂作用研究及其功能性食品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及藥劑

蕪菁?jí)K根樣品購(gòu)于西藏林芝市；HepG2 細(xì)胞購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和脫氧膽酸鈉購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、MTT、油紅O、油酸購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素/鏈霉素）、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；甘油三酯（TG）和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總膽固醇（TC）試劑盒購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司；NaOH、無(wú)水乙醇等其他試劑均購(gòu)于中國(guó)國(guó)藥公司；Thermo Scientific Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀。

1.2 蕪菁水提物的制備

將干燥的蕪菁?jí)K根樣品切成薄片，按3%的料液比加入蒸餾水，于90 ℃水浴鍋中提取1 h，抽濾，濾液先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮10 倍后，再冷凍干燥即得蕪菁水提物。

1.3 蕪菁水提物對(duì)膽酸鹽吸附率測(cè)定

用以0.1 mol/L、pH＝6.3 的磷酸緩沖溶液分別配制不同濃度的甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和脫氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L），取1 mL 于具塞試管中，加入3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H2SO4溶液于70 ℃水浴20 min，取出冰浴5 min，在387 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以膽酸鹽含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蕪菁水提物粉末加水復(fù)溶后，配制成2、5、7 g/L的蕪菁水提物樣品，分別取5 mL 于具塞試管中，以蒸餾水作為空白對(duì)照。再加入3 mL 10 g/L 胃蛋白酶，1 mL 0.01 mol/L 的HCl 溶液，在37 ℃條件下恒溫振蕩1 h，模擬胃部消化環(huán)境；再用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至6.3 后，加入4 mL 10 g/L 胰蛋白酶，在37 ℃條件下恒溫振蕩1 h，模擬腸道消化環(huán)境。每個(gè)樣品再分別加入4 mL 0.4 mmol/L 甘氨膽酸鈉、0.5 mmol/L ?；悄懰徕c和1 mmol/L 的脫氧膽酸鈉，在37 ℃條件下恒溫振蕩進(jìn)行膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)，1 h 后轉(zhuǎn)移至離心管中4 000 r./min 離心20 min，取1 mL上清液進(jìn)行膽酸鹽含量檢測(cè)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣液中膽酸鹽的濃度，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行。膽酸鹽結(jié)合率＝（C0－C1）/C0×100，式中：C0為膽酸鹽加入量，C1為膽酸鹽剩余量。

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn)

HepG2 細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。培養(yǎng)過(guò)夜后吸棄上清，加入含不同濃度蕪菁水提物（0.10、0.35、0.70、1.00、1.40 g/L）的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和調(diào)零孔，每個(gè)處理6 個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄上清，加入10% MTT（5 g/L）100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，充分混勻5 min，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)各組OD 值。通過(guò)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組－OD調(diào)零孔）/（OD對(duì)照組－OD調(diào)零孔）×100%。

1.5 油紅O 染色實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（control group）、模型組（model group）、陽(yáng)性對(duì)照組（lovastatin）和不同濃度的蕪菁水提物干預(yù)組（WET）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。培養(yǎng)過(guò)夜后吸棄上清，除空白對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液外，其余各組加入含0.3 mmol/L 油酸的培養(yǎng)液處理24 h，造模成功后模型組換成完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加含100 mg/L 洛伐他汀的培養(yǎng)液處理，不同濃度的蕪菁水提物干預(yù)組分別添加含不同濃度（0.10、0.35、0.70、1.00、1.40 g/L）蕪菁水提物的培養(yǎng)液處理。處理細(xì)胞24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗，用體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液固定20 min 后，再以PBS 清洗3 遍，油紅避光染色40 min。染色完成后，以體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇溶液快速清洗，加PBS二次清洗，于顯微鏡20 倍下觀察細(xì)胞形態(tài)。觀察過(guò)后，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的異丙醇溶液，室溫靜置40 min，振板10 min，在528 nm 處檢測(cè)吸光值，根據(jù)下式計(jì)算脂變率：脂變率＝（OD給藥組－OD調(diào)零組）/（OD對(duì)照組－ OD調(diào)零組）×100%。

1.6 細(xì)胞內(nèi)TG、TC 水平測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔接種1 mL。實(shí)驗(yàn)分組及給藥同油紅O 染色實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞給藥處理完后加胰酶消化，收集至1.5 mL離心管中，用PBS 清洗2 遍，最后加入250 μL PBS，用超聲破碎細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定總蛋白、TG、TC 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）、t-檢驗(yàn)和LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 蕪菁活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)檢索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)、等數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)收集蕪菁?jí)K根中的活性成分，并將活性成分的canonical SMILES 導(dǎo)入至admetSAR 平臺(tái)（http：//lmmd.ecust.edu.cn/admetsar2/）進(jìn)行分子性質(zhì)預(yù)測(cè)，篩選符合類藥五原則［（1）分子量小于500；（2）氫鍵給體數(shù)目小于5；（3）氫鍵受體數(shù)目小于10；（4）脂水分配系數(shù)小于5；（5）可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過(guò)10 個(gè)］的活性成分進(jìn)行下一步分析。將活性成分的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入 SwissTargetPrediction （http：//www.swisstargetprediction. ch/）和 SEA Search Server（https：//sea.bkslab.org/）平臺(tái)進(jìn)行反向分子對(duì)接靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，限定物種為“Homo sapiens（Human）”，將靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因注釋，并校正為官方名稱（Official symbol），取并集得到蕪菁的活性成分作用的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.9 高血脂相關(guān)靶點(diǎn)檢索與篩選

以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）中檢索高血脂相關(guān)靶點(diǎn)，物種限定為“Homo sapiens”。選擇“Relevance score”值大于2 的靶點(diǎn)作為高血脂相關(guān)靶點(diǎn)。

1.10 “化合物－靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

高血脂相關(guān)靶點(diǎn)與蕪菁的活性成分作用的相關(guān)靶點(diǎn)取交集，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.6.1 軟件中構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)并做網(wǎng)絡(luò)分析。

1.11 GO 和KEGG 通路的富集分析

將靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行基因本位論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。GO 富集分析，包含生物過(guò)程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）3 個(gè)部分，根據(jù)（false discovery rate，F(xiàn)DR）分別選擇排名前10 條的結(jié)果繪制柱狀圖。KEGG通路分析結(jié)果以P＜0.01，Count＞3 為顯著信號(hào)通路。

1.12 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建與分析

將交集靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），物種選為Homo sapiens，設(shè)置“Minimum required interaction score”為0.7（高可信度）。并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.6.1 軟件中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并做網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 蕪菁提取物膽酸鹽結(jié)合能力分析

人體內(nèi)膽固醇的主要分解途徑是轉(zhuǎn)變成膽酸鹽，膽酸鹽又可以經(jīng)過(guò)腸道-肝臟進(jìn)行回收，所以通過(guò)結(jié)合消化道中膽酸鹽，以此有效排除體內(nèi)膽汁酸，間接降低膽固醇含量，達(dá)到降低血脂的目標(biāo)［8］。如圖1 所示，蕪菁水提物對(duì)甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉和脫氧膽酸鈉3 種膽酸鹽都有一定的結(jié)合能力，且隨著蕪菁濃度的增加而增強(qiáng)。在添加7 g/L 時(shí)對(duì)這3 種膽酸鹽結(jié)合達(dá)到最大，分別為36.01%、28.93%、78.55%。

圖1 蕪菁提取物體外結(jié)合甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和脫氧膽酸鈉能力Fig 1 Effect of Brassica rapa aqueous extract（BRAE）on bile salt-binding capacity（sodium glycylcholate，sodium taurocholate and sodium deoxycholate）

2.2 蕪菁對(duì)油酸誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞的降血脂作用

2.2.1 蕪菁對(duì)細(xì)胞活力的影響 采用MTT 法評(píng)估蕪菁提取物作用下的細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖2A。結(jié)果表明，蕪菁提取物在0.10～1.40 g/L 濃度下對(duì)HepG2細(xì)胞活力無(wú)顯著影響（P＞0.05），細(xì)胞活力均在90%以上，說(shuō)明蕪菁提取物無(wú)顯著細(xì)胞毒性，并具有良好的細(xì)胞相容性。

2.2.2 蕪菁取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響 油酸可通過(guò)影響肝細(xì)胞的糖脂代謝的平衡，造成糖脂代謝的紊亂，形成脂滴堆積而發(fā)生一系列的病變，利用油酸作為誘導(dǎo)劑，復(fù)制肝細(xì)胞脂肪變性模型是研究脂肪肝、肥胖等一些代謝性疾病的一種重要手段。通過(guò)油紅染色觀察（圖2C）和半定量檢測(cè)（圖2B）分析不同劑量的蕪菁提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響，結(jié)果顯示經(jīng)油酸誘導(dǎo)后的模型組內(nèi)所有細(xì)胞均可見(jiàn)密集的紅色脂滴，顯著的高于空白對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明建模成功。經(jīng)不同劑量（0.10～1.40 g/L）的蕪菁提取液干預(yù)后，紅色脂滴的密度均有不同程度的減少，且隨著劑量的增加脂滴越少，1.40 g/L 的劑量組（g）與陽(yáng)性對(duì)照洛伐他汀組（h）的效果相當(dāng)。

圖2 蕪菁提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響Fig 2 Effect of Brassica rapa aqueous extract（BRAE）on intracellular lipid accumulation induced by oleinic acid

2.2.3 蕪菁提取物對(duì)細(xì)胞內(nèi)TG、TC 水平的影響

TG、TC 水平是臨床上用來(lái)診斷高血脂的常用指標(biāo)。本文以蕪菁提取液1.40 g/L 的濃度處理為例，分析其對(duì)油酸誘導(dǎo)的高脂細(xì)胞內(nèi)的TG（A）和TC（B）水平的影響。由圖3 可以看出，模型組細(xì)胞內(nèi)的TG（圖3A）和TC（圖3B）水平均顯著的高于空白對(duì)照組（P＜0.01），而經(jīng)過(guò)蕪菁提取液干預(yù)組，TG 和TC 水平均顯著降低（P＜0.01），尤其是TC 水平，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 蕪菁提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)TG（A）和TC（B）含量的影響Fig 3 Effect of BRAE on TG and TC Levels in HepG2 cells

2.3 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)蕪菁降血脂的機(jī)制分析

2.3.1 蕪菁活性成分篩選 本研究共確定了21 個(gè)有效成分（表1）。

表1 蕪菁活性成分信息Tab 1 Information of active components of Brassica rapa

2.3.2 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)篩選 利用Swiss Target Prediction 和SEA Search Server 平臺(tái)預(yù)測(cè)蕪菁活性成分的靶點(diǎn)，去除重復(fù)后共獲得活性成分的潛在靶點(diǎn)682 個(gè)，與高血脂相關(guān)靶點(diǎn)取交集，整理合并后得交集靶點(diǎn)共55 個(gè)。蕪菁21 個(gè)有效成分中與高血脂相關(guān)靶點(diǎn)有互作關(guān)系的有15 個(gè)，包括6 個(gè)糖苷類化合物（芐基α-D-果糖呋喃糖苷、正戊基β-D-果糖呋喃糖苷、芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷、2-C-β-D-吡喃葡萄糖基-1-甲氧基吲哚-3-乙腈、乙酮-1-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、乙基β-D-吡喃葡萄糖苷），3 個(gè)黃酮類化合物（甘草素、4，4'-二羥基-3'-甲氧基查耳酮、利可考酮A），2 個(gè)酚類化合物（6-姜酮酚、6-姜烯酚），2 個(gè)異硫氰酸鹽類（2-苯乙基異硫氰酸酯、異硫氰酸芐酯）和2 個(gè)其他類化合物（石竹烯、吲哚乙腈）。由“合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）可以看出，該網(wǎng)絡(luò)由71 個(gè)節(jié)點(diǎn)和137 條邊構(gòu)成，其中6-姜酮酚（6-paradol）、6-姜烯酚（6-shogaol）、芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷（benzyl-beta-D-glucopyranoside）、芐基α-D-果糖呋喃糖苷（benzyl-alpha-D-fructofuranoside）和甘草素（liquiritigenin）的度值（degree）較高，均與10 個(gè)以上靶點(diǎn)互作，由此可以推測(cè)其是蕪菁降血脂的主要活性成分。

圖4 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Compound-target network

2.3.3 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將55 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，如圖5 所示。此網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)相互作用產(chǎn)生了118 條邊，平均最短路徑長(zhǎng)度為1.979，平均聚類系數(shù)為0.250，平均度值為5.2。主要靶點(diǎn)包括VEGFA、IL6、EGFR、PPARG、MMP9、MPO、F2、SERPINE1、TLR4、MGAM 等，其中度值≥10 的有4 個(gè)，VEGFA（度值＝18）、IL-6（度值＝17）、EGFR（度值＝13）、PPARG（度值＝12），推測(cè)這些靶點(diǎn)是蕪菁降血脂的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 5 PPI network of potential lipid-lowering targets of active ingredientsof Brassica rapa

2.3.4 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)GO 富集分析 GO 富集分析結(jié)果如圖6 所示，包括生物學(xué)過(guò)程（BP），細(xì)胞組分（CC），分子功能（MF），其中富集到172 個(gè)BP 條目，占比69.35%。根據(jù)FDR（false discovery rate）分別列出了排名前10 條的結(jié)果，主要涉及carbohydrate metabolic process、glycogen catabolic process、cholesterol homeostasis、cholesterol metabolic process 等生物學(xué)過(guò)程，extracellular space、extracellular exosome、extracellular region 等細(xì)胞組分和steroid hormone receptor activity、steroid binding、glycogen phosphorylase activity 等分子功能。表明蕪菁能通過(guò)參與體內(nèi)多種生物學(xué)調(diào)控過(guò)程以發(fā)揮降血脂作用。

圖6 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)GO 富集分析Fig 6 Analysis of GO enrichment of potential targets for lowering blood lipid in active ingredients of Brassica rapa

2.3.5 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析 KEGG 通路分析結(jié)果顯示，蕪菁降血脂的潛在靶點(diǎn)共涉及36 條信號(hào)通路。圖7 列出了P＜0.01 且通路中靶個(gè)數(shù)（Count）＞3 的為顯著信號(hào)通路，主要包括淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、胰島素抵抗、胰島素信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。

圖7 蕪菁活性成分潛在降血脂靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析Fig 7 Enrichment analysis of KEGG pathway of potential target for blood lipid-lowering active ingredients in Brassica rapa

3 討論

蕪菁在我國(guó)有悠久的栽培應(yīng)用歷史，作為味道鮮美的蔬菜被大量種植，隨著對(duì)蕪菁研究的不斷深入，其越來(lái)越多的功效作用被人們發(fā)現(xiàn)，比如抗炎、抗氧化、抑菌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和降血脂等。其中，蕪菁的降脂減肥作用越來(lái)越多的被人們關(guān)注，陳志鵑等［16］研究了蕪菁的總皂苷提取物的降脂減肥作用，給高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型灌胃蕪菁總皂苷提取物45 d 后，其血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、脂蛋白脂酶和肝脂酶的活性相比于模型組均不同程度的升高了，而丙二醛、游離脂肪酸、痩素的含量顯著的降低了。皮寧寧等［17］研究了蕪菁乙醇提取物的降血脂作用，結(jié)果顯示，蕪菁乙醇提取物能夠顯著的降低高血脂癥大鼠血清中甘油三酯和總膽固醇水平，還能夠顯著升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，其效果比陽(yáng)性對(duì)照物地奧脂必妥片更好。本研究通過(guò)體外膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了蕪菁的降血脂活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蕪菁水提物在體外有很好的降血脂效果，蕪菁水提物對(duì)甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c和脫氧膽酸鈉都有一定的結(jié)合能力，在7 g/L 時(shí)結(jié)合率分別為36.01%、28.93%和78.55%。蕪菁水提物對(duì)油酸誘導(dǎo)的HepG2 脂肪變性細(xì)胞有顯著的脂肪堆積抑制效果，1.4 g/L 的抑制效果與陽(yáng)性對(duì)照物洛伐他汀的效果相當(dāng)，其還能顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC 水平，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種從系統(tǒng)生物學(xué)角度，結(jié)合生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)方法分析藥物對(duì)疾病作用機(jī)制的新方法，它能更全面地認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體之間的相互作用關(guān)系［18］。相比于傳統(tǒng)“一個(gè)藥物、一個(gè)基因、一種疾病”的藥物開(kāi)發(fā)模式，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)更能契合中藥“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”發(fā)揮整體協(xié)同作用的特點(diǎn)，以多維化視角闡明中醫(yī)藥所蘊(yùn)含的內(nèi)涵，已成為中醫(yī)藥深入發(fā)展的一個(gè)得力助推手。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，進(jìn)一步對(duì)蕪菁降血脂作用的機(jī)制進(jìn)行了探討。收集到蕪菁?jí)K根中符合類藥五原則的活性成分21 個(gè)，并通過(guò)構(gòu)建的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖分析出蕪菁中的糖苷類和酚類類化合物在發(fā)揮降血脂功效中起到了重要作用，其中核心成分為6-姜酮酚、6-姜烯酚、芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷、芐基α-D-果糖呋喃糖苷和甘草素。6-姜酮酚和6-姜烯酚是常見(jiàn)于生姜中的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂，以及心血管和神經(jīng)保護(hù)等活性，Wu 等［14］從新鮮的蕪菁?jí)K根中，用硅膠柱、Sephadex LH-20 柱多次反復(fù)層析分離出6-姜酮酚和6-姜烯酚。6-姜酮酚是由6-姜烯酚在樣品干制、加工過(guò)程中轉(zhuǎn)化而來(lái)，是蕪菁辛辣感的主要來(lái)源物質(zhì)［19］。Wei 等［20］經(jīng)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，6-姜酮酚是由6-姜烯酚具有降脂降血糖功效，其可以通過(guò)增強(qiáng)AMPK 酶的磷酸化作用，來(lái)提高3T3-L1 脂肪細(xì)胞和C2C12 肌管細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率，也能顯著降低肥胖小鼠的體重、膽固醇和血糖指標(biāo)。

根據(jù)構(gòu)建的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，分析得出VEGFA、IL-6、EGFR、PPARG 4 個(gè)靶點(diǎn)的度值≥10，可能是蕪菁降血脂的關(guān)鍵靶點(diǎn)。VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，vascular endothelial growth factor），是一個(gè)重要的促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子，對(duì)修復(fù)和維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能具有重要的作用，并且被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括冠心病、腫瘤、糖尿病及血脂異常等。多篇文獻(xiàn)報(bào)道VEGFA 與血脂異常密切相關(guān)，其可以通過(guò)抑制內(nèi)皮脂酶、LPL 和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2 等基因的表達(dá)，來(lái)達(dá)到降血脂效果。通過(guò)本研究中的“化合物-靶點(diǎn)”可以看出，蕪菁中的6 個(gè)糖苷類化合物和2 個(gè)黃酮類化合物（甘草素、4，4'-二羥基-3'-甲氧基查耳酮）均與VEGFA 靶點(diǎn)有互作關(guān)系。IL-6（Interleukin-6）是一種由巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和T 細(xì)胞分泌的重要促炎癥因子，能介導(dǎo)細(xì)胞增殖、血管炎癥過(guò)程和調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)的進(jìn)展［21］。高血脂患者一般都伴隨著低級(jí)慢性全身炎癥，有文獻(xiàn)指出IL-6 與血脂異常密切相關(guān)，并且在調(diào)節(jié)血脂和體重的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其可以通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α），降低胰島素抵抗，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的血糖血脂水平［22］。蕪菁中的6-姜酮酚和甘草素可PPARG 靶點(diǎn)產(chǎn)生互作，PPARG 是肪組織中調(diào)控脂肪酸代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也是臨床上當(dāng)作治療脂肪酸紊亂的靶基因［23］。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)得出蕪菁水提物具有很好的降血脂效果，其能顯著的降低細(xì)胞內(nèi)TG、TC 水平和脂肪堆積。并應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了蕪菁的降血脂機(jī)制，蕪菁中的6-姜酮酚、6-姜烯酚、芐基-β-D-吡喃葡萄糖苷、芐基α-D-果糖呋喃糖苷和甘草素等活性成分，與VEGFA、IL-6、EGFR、PPARG 等靶點(diǎn)進(jìn)行互作，調(diào)控淀粉和蔗糖代謝、胰島素抵抗、HIF-1、PI3K-Akt 等信號(hào)通路來(lái)達(dá)到降血脂效果，這體現(xiàn)了其多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的整體協(xié)同作用。本文為深入研究蕪菁的藥理機(jī)制提供了理論依據(jù)，但預(yù)測(cè)結(jié)果不能完全證明其正確性，還需要根據(jù)本研究結(jié)果開(kāi)展系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳飳W(xué)驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

劉建兵：課題設(shè)計(jì)、實(shí)施及撰寫(xiě)全文；林風(fēng)：課題設(shè)計(jì)，提供實(shí)驗(yàn)材料及理論指導(dǎo)；林軍：實(shí)施部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容；鄭秋霞：實(shí)施部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容；蘇瀚星：實(shí)施部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容；吳麗云：課題設(shè)計(jì)及理論指導(dǎo)。