李 淳，劉學(xué)輝，卜昶棟，姚勝軍，王莉爽

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所 貴陽 550006；2.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院 貴陽 550025）

番茄是貴州發(fā)展蔬菜產(chǎn)業(yè)的重要作物之一，而病毒病是危害番茄生產(chǎn)的重要病害。目前，危害我國番茄生產(chǎn)的主要DNA病毒有番茄黃化曲葉病毒（，TYLCV）、廣東番茄黃化曲葉病毒（，ToYLCGDV）、中國番茄黃化曲葉病毒（，TYLCCNV）、泰國番茄黃化曲葉病毒（，TYLCTHV）、海南番茄曲葉病毒（，ToLCHNV）、中國番茄曲葉病毒（，ToLCCNV）、臺灣番茄曲葉病毒（，ToLCTWV）、煙草曲莖病毒（，TbCSV）和中國番木瓜曲葉病毒（，PaLCuCNV）9種。而目前我國尚未有苧麻花葉病毒（，RaMV）危害番茄的報道。因此，對這一新的番茄病毒的危害，應(yīng)予以足夠的重視以確保我國番茄產(chǎn)業(yè)的健康良性發(fā)展。按照ICTV最新分類標(biāo)準，苧麻花葉病毒是雙生植物真菌病毒目（）、雙生病毒科（）、菜豆金色黃花葉病毒屬（）成員，大多數(shù)菜豆金色花葉病毒屬病毒具有雙組分的基因組，即DNA-A和DNA-B，大小在2.5～2.8 kb之間。國內(nèi)外對雙生病毒的研究主要集中在基因組結(jié)構(gòu)、傳毒介體、傳播途徑與寄主的互作等方面。Chen等報道了苧麻花葉病毒在中國廣東地區(qū)侵染西番蓮。Peng等研究發(fā)現(xiàn)，苧麻花葉病毒對地中海型煙粉虱行為的改變存在性別差異，雌性煙粉虱的傳毒效率明顯高于雄性。SHEN等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶SnRK1的過量表達能使植物對雙生病毒的抗性增強，沉默SnRK1會增加雙生病毒的易感性，SnRK1還能直接磷酸化雙生病毒蛋白以減少感染。Kanakala等研究報道，煙粉虱親環(huán)素B（CypB）和熱休克70蛋白（hsp70）在病毒傳播途徑上與TYLCV在煙粉虱中腸內(nèi)相互作用并共位點定位，這2種蛋白在病毒傳播過程中都有重要作用。目前，國內(nèi)尚未見到苧麻花葉病毒侵染番茄的相關(guān)報道，明確該病毒的株系和變異情況對制定相關(guān)的防控策略具有重要的指導(dǎo)作用。筆者運用PCR擴增得到了RaMV的DNA-A和DNA-B，分析了該分離物與其他地區(qū)及其他作物上分離物的系統(tǒng)進化關(guān)系，并分析了不同地區(qū)RaMV各基因的核苷酸一致性，以期為科學(xué)防控RaMV提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品采集與試驗 疑似番茄病毒病樣品于2019年秋季采自貴州省關(guān)嶺縣，品種為金石頭番茄D6689（來源于貴陽粒豐種子有限公司代理）。保存在-80℃冰箱。以未發(fā)病的健康番茄植株葉片作為陰性對照。試驗于2020年6—7月在貴州省植物保護研究所植物病理實驗室進行。

1.1.2 試劑 TransStartFastPfu DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、EasyPureQuick Gel Extraction Kit、2×EasyPCRSuperMix（Transgen biotech，AS111）、Trans2KPlus DNA Marker購自北京全式金生物有限公司；其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 番茄葉片樣本總DNA提取采用CTAB法。

1.2.2 PCR擴增與測序 采用劉勇等報道的通用引物BegoAFor1（5’-TGYGARGGICCITGYAARGTYCARTC-3’）和BegoARev1（5’-ATHCCMDCHATCKTBCTITGCAATCC-3’）進行番茄疑似病毒病樣品擴增，酶采用2×EasyPCRSuperMix。反應(yīng)程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃1 min 12 s，35個循環(huán)；72℃5 min。

采用Li等設(shè)計的RaMV的DNA-A特異性引 物J4F（5'-CATGTATCGGAAGCCCAAGATG-3'）和J4R（5'-ATGGGCCTGTACGTCCAAGC-3'）擴增DNA-A，體系為Template 2μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase1μL，5X Trans-StartFastPfu Buffer10μL，Nuclease-freeWater 35μL，Total volume 50μL。反應(yīng)程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35個循環(huán)；72℃5 min。

設(shè)計了RaMV的DNA-B特異性引物RaMV-B-F（5'-TGATCAAGTCCCAGAGGAGATTGAATGC-3'）和RaMV-B-R（5'-AAGGACGATGATAAGAATGGACTGTAC-3'）擴增DNA-B，體系為Template2μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol·L）1μL，Reverse Primer（10μmol·L）1μL，TransStartFastPfu DNA Polymerase 1μL，5×TransStartFastPfu Buffer 10μL，Nuclease-free Water 35μL，Total volume 50μL。反應(yīng)程序為95℃3 min；95℃15 s，50℃15 s，72℃3 min，35個循環(huán)；72℃5 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆到pEASY-Blunt Simple Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)過菌落PCR鑒定后，選取陽性克隆進行測序，引物合成及測序由重慶擎科興業(yè)生物科技有限公司完成。

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN和BioEdit對不同地區(qū)，不同作物上的RaMV的DNA-A和DNA-B及其編碼的各基因進行核苷酸序列相似性比較。運用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建基于DNA-A和DNA-B全長核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，構(gòu)建DNA-A和DNA-B系統(tǒng)發(fā)育進化樹采用的雙生病毒分離物序列來源見表1和表2。

表1 不同地區(qū)Begomovirus DNA-A分離物及其在國際基因庫中收錄的情況

表2 不同地區(qū)Begomovirus DNA-B分離物及其在國際基因庫中收錄的情況

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似雙生病毒感染的樣品檢測

用雙生病毒通用引物BegoAFor1/BegoARev1對提取的總DNA進行擴增，得到1200 bp產(chǎn)物（圖1），回收后連接至T載體，克隆后送樣測序，經(jīng)過Blast比對，確認其為RaMV序列。

圖1 番茄疑似Begomovirus樣品檢測

2.2 RaMV的DNA-A和DNA-B的全長基因組的克隆與序列分析

以J4F/J4R擴增DNA-A，得到大小2737 bp的條帶（圖2），以RaMV-B-F/RaMV-B-R擴增DNA-B，得到大小2709 bp的條帶（圖3），產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、克隆后送樣測序，比對結(jié)果表明，其序列為RaMV序列，具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因結(jié)構(gòu)的典型特征。圖4顯示，該病毒DNA-A基因組具有6個開放閱讀框，病毒鏈上有AV1（編碼外殼蛋白CP）和AV2（編碼移動相關(guān)蛋白），互補鏈上AC1（編碼Rep蛋白，轉(zhuǎn)錄激活及復(fù)制相關(guān)），AC3（編碼REn蛋白，增強復(fù)制）和AC4（沉默抑制子）；圖5顯示，DNA-B具有2個開放閱讀框，病毒鏈有BV1（編碼核穿梭蛋白NSP），互補鏈有BC1（編碼運動蛋白MP）。

圖2 RaMV-GZDNA-A基因組擴增

圖3 RaMV-GZ DNA-B基因組擴增

圖4 SnaGene DNA-A全序列分析圖

圖5 SnaGene DNA-B全序列分析圖

對病毒編碼的DNA-A和DNA-B及各個基因進行核苷酸序列相似性比較（表3、4），結(jié)果表明，其DNA-A與各地的分離物的相似性相差不大，一致性在94.7%～95.5%之間，與RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%；而體現(xiàn)在基因方面，則在AC2最為保守，一致性在96.3%～98.0%之間，與RaMV-Guangdong（KC171652）的一致性最高，達到了98%；在AV2變異性最高，一致性在91.9%～96.7%之間，RaMV-Guangdong（KC171652）的變異性最高，一致性為91.9%。DNA-B的相似性則相對低一些，一致性在90.4%～92.4%之間，最高為RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）；BC1和BV1的一致性分別為91.2%～93.4%和91.6%～93.1%，一致性最高的都是RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）。

表3 DNA-A及其編碼基因序列相似性比較 %

表4 DNA-B及其編碼基因序列相似性比較 %

2.3 RaMV的DNA-A和DNA-B的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

為進一步分析貴州番茄RaMV-GZ分離物與已經(jīng)報道的各RaMV分離物及其他的親緣關(guān)系，選取了來自國內(nèi)8個地區(qū)的RaMV的DNA-A分離物，同時選取了國內(nèi)外不同地區(qū)已經(jīng)報道其他13類的DNA-A作為外組利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖6）。結(jié)果顯示，RaMV-GZ的DNA-A與中國其他地區(qū)的RaMV DNA-A序列都聚在一個小的分支上。同時，RaMV-GZ的DNA-A與的DNA-A親緣關(guān)系也較近。

圖6 基于Begomovirus DNA-A相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

選取了來自國內(nèi)5個地區(qū)的RaMV的DNA-B分離物，以及國內(nèi)外11類的DNA-B作為外組構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖7）。結(jié)果顯示，RaMV-GZ的DNA-B與中國不同地區(qū)的RaMV的DNA-B的序列都聚在一個小的分支上，其與及的親緣關(guān)系也較近。結(jié)合DNA-A的系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結(jié)果，貴州侵染番茄的RaMV與中國不同地區(qū)不同寄主的RaMV分離物的親緣關(guān)系較近，且地域差異不明顯。

圖7 基于Begomovirus DNA-B相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論與結(jié)論

據(jù)報道，RaMV的寄主有苧麻和煙草及西番蓮，而該病毒侵染番茄在我國未見報道。從結(jié)果分析，RaMV-GZ的DNA-A與已報道的RaMV分離物的一致性在94.7%～95.5%，DNA-B的一致性為91.2%～93.4%。在雙生病毒科病毒同源性比較中，同源性大于89%被認為是同一病毒的不同株系，在此基礎(chǔ)上，基因組序列同源性大于94%，則被認為是同一株系的不同分離物。因此，可以認為RaMV-GZ的DNA-B的變異較大，其能侵染番茄也可能是由于DNA-B的變異引起的，具體的機制有待進一步研究。

我國已報道的RaMV主要分布于江蘇、浙江、廣東等地，而在貴州番茄上的發(fā)現(xiàn)是屬于在新的地區(qū)新的作物上發(fā)現(xiàn)了該病毒。筆者通過PCR擴增得到了RaMV-GZ的DNA-A和DNA-B全長，并闡明了其基因組結(jié)構(gòu)，通過Blast比對發(fā)現(xiàn)DNA-A與RaMV-Zhejiang-Z1（FN396971）、RaMV-Jiangsu-J4（FN396969）和RaMV-Fujian（EF125190）的一致性都是95.5%，DNA-B與RaMV-Guangdong-Hn（KC171651）一 致 性 為92.4%，通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹確定該分離物DNA-A和DNA-B都屬于RaMV。從地域性差異來說，比較的幾個RaMV分離物雖然屬于不同地區(qū)，但相似性都比較高，都在90%以上，說明這些分離物可能有共同的來源。本試驗結(jié)果對貴州乃至西南地區(qū)RaMV的防控、抗病育種等工作具有重要意義。

雙生病毒的復(fù)合侵染是其遺傳重組的重要來源，同時也能加重侵染的癥狀。田間調(diào)查顯示非洲木薯花葉病毒（，ACMV）和東非木薯花葉病毒烏干達毒株（，EACMV-UG）復(fù)合侵染，2種病毒的協(xié)同作用引起木薯花葉病的大流行，導(dǎo)致了巨大的經(jīng)濟損失。而RNA病毒和DNA病毒的復(fù)合侵染也會導(dǎo)致癥狀的加重，如番茄褪綠病毒（，ToCV）與TYLCV在山東及江蘇番茄上復(fù)合侵染導(dǎo)致番茄病毒病癥狀加重，且煙粉虱可同時攜帶這2種病毒傳播。在本試驗中筆者未發(fā)現(xiàn)DNA病毒或RNA病毒的復(fù)合侵染，但在同地區(qū)的其他樣品中檢測出了TYLCV和ToCV（本文中未顯示結(jié)果），不排除有復(fù)合侵染的可能性，應(yīng)對此予以重視。

筆者首次對侵染貴州番茄的RaMV進行分子鑒定和序列分析，明確RaMV貴州分離物的分子特征，為RaMV在我國的傳播擴散、自然寄主鑒定和遺傳進化分析等方面研究提供了基礎(chǔ)，同時也為番茄抗病新品種的選育提供了科學(xué)依據(jù)。