陳曉嘉，陳 茹，韋 譽(yù)，貝榮廷，周芳梅，馮志強(qiáng)

（1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 510000；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 510000；3.江蘇廣海檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司，江蘇南通 226121）

獸藥殘留指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥母體化合物或其代謝物，以及與獸藥相關(guān)的雜質(zhì)殘留。近年來(lái)食品中獸藥殘留成為食品安全領(lǐng)域的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)[1-7]。在我國(guó)，濫用、亂用限制使用的藥物、非法使用禁止使用的藥物的現(xiàn)象屢禁不止，喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類等化合物在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面使用較多，藥物濫用易造成水產(chǎn)品污染，通過(guò)食物鏈可在人體內(nèi)蓄積并具有使人體產(chǎn)生抗藥性等副作用的可能性。因此，對(duì)抗生素的殘留進(jìn)行監(jiān)測(cè)對(duì)促進(jìn)水產(chǎn)品食品安全具有極其重要的意義[8-15]。

我國(guó)發(fā)布了多項(xiàng)法規(guī)以規(guī)范獸藥規(guī)范使用，也明確水產(chǎn)品中獸殘及其代謝物的檢出限量范圍。目前有近百種獸藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中使用[16]，其性質(zhì)各異，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法多以化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的同族化合物進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)，對(duì)同一水產(chǎn)品樣本中的獸藥殘留目前沒(méi)有合適標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行同步快速篩查[17]。在現(xiàn)有相關(guān)的多種獸藥殘留分析方法中，存在前處理步驟較多、分析時(shí)間較長(zhǎng)、基質(zhì)涵蓋較小等局限性?；诖?，本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)魚、蝦等水產(chǎn)品中喹諾酮類、磺胺類、硝基咪唑類3大類46種獸藥的高通量檢測(cè)技術(shù)，提高了多殘留獸藥的檢測(cè)效率，可以滿足水產(chǎn)品中多種類獸藥風(fēng)險(xiǎn)篩查及監(jiān)測(cè)工作的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)品：魚、蝦，采購(gòu)于市場(chǎng)。

試劑：甲醇（LC-MS，Honeywell）；乙酸銨（HPLC，阿拉?。灰译妫℉PLC，CINC）；甲酸（LC-MS，ACS）；正己烷（HPLC，Honeywell）；冰乙酸（分析純，康科德）；C18（40～ 60 μm，60?，艾杰爾）；PSA（40～60 μm，60A，艾杰爾）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；0.22 μm濾膜（艾杰爾）；超純水（Milli-Q）。

標(biāo)準(zhǔn)品：46種化合物（17種喹諾酮類、24種磺胺類、5種硝基咪唑類）的標(biāo)準(zhǔn)品生產(chǎn)于Tmstandard、Dr.Ehrenstorfer、Bepure、CATO、First Standard、ANPEL，純度為86.5%～100%。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Sciex Triple Quad 5500 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB公司）：配有電噴霧（ESI）離子源；超聲儀（新芝生物科技）；渦旋振蕩器（heidolph）；高速冷凍離心機(jī)（Hettich）；氮吹儀（?？苾x器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

單標(biāo)儲(chǔ)備液：精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，甲醇溶解，定容至10 mL，配制為100 μg·mL-1單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于 -18 ℃保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：移取儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成 10.0 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)提取液配制成 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

取適量可食部分，絞碎，均質(zhì)，稱取均質(zhì)樣2.0 g于離心管中，加4 g無(wú)水硫酸鈉，加入1%乙酸乙腈溶液8 mL，渦旋30 s，冰水浴超聲提取20 min，10 000 r·min-1離心 3 min，轉(zhuǎn)移上清液，再次往樣品加入8 mL1%乙酸乙腈，重復(fù)提取，轉(zhuǎn)移上清液并進(jìn)行合并，水浴40 ℃氮吹至近干，加入1 mL20%甲醇水溶液，渦旋1 min，加入50 mg PSA和 50 mg C18，10 000 r·min-1離心 3 min，過(guò) 0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。T3柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；進(jìn)樣量：2.0 μL；流速：0.2 mL·min-1，柱溫箱：40 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸-2 mmol·L-1乙酸銨溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫梯度

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI+）；MRM模式；氣簾氣30.0 psi；碰撞氣：9 psi；離子化電壓：4 500 V，源溫度：550 ℃；霧化氣壓力、輔助加熱氣壓力均為55 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本 文 考 察 了 色 譜 柱 C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、RP18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 和 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）對(duì)目標(biāo)化合物分離度的影響。RP18柱對(duì)化合物磺胺類同分異構(gòu)體的分離度較C18柱和T3柱差，磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪沒(méi)有完全分離；T3柱對(duì)磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶的分離優(yōu)于C18柱。同時(shí)硝基咪唑、喹諾酮類在T3柱上均具有較好的分離效果。最終選擇色譜柱 T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）為分析色譜柱，見(jiàn)圖1。

圖1 不同色譜柱中3種磺胺的分離情況

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將1.0 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入串聯(lián)質(zhì)譜儀，根據(jù)46種化合物相對(duì)分子質(zhì)量及其帶電方式，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到母離子峰。對(duì)離子源電壓及噴霧氣壓進(jìn)行調(diào)整至各化合物響應(yīng)值穩(wěn)定后，對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到46種化合物的子離子碎片信息，同時(shí)優(yōu)化碰撞能量及RF透鏡電壓，選取2個(gè)特征離子進(jìn)行分析，得到最優(yōu)的質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 46種化合物質(zhì)譜參數(shù)

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.3 C18和PSA的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考查C18、PSA及C18和PSA聯(lián)合使用對(duì)樣品凈化后回收率影響。QuEChERS常用的凈化填料主要有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C18）、石墨化炭黑（Graphitized Carbon Black，GCB）等，GCB主要用于農(nóng)藥殘留凈化，去除色素，C18主要作用于去除基質(zhì)中脂肪干擾物，PSA主要作用于去除基質(zhì)中脂類及糖類物質(zhì)。本文對(duì)比50 mg PSA和50 mg C18的凈化效果。結(jié)果顯示，對(duì)于蝦中的磺胺類，C18的凈化效果整體優(yōu)于PSA，C18的平均回收率為81%，PSA的平均回收率為69%，C18去除雜質(zhì)能力更好。魚、蝦中C18和PSA對(duì)其他化合物的凈化效果相當(dāng)，采用混合分散固相萃取吸附劑的凈化效果更好。最終選擇50 mg PSA+50 mg C18作為凈化填料。

2.4 線性范圍、線性方程及檢出限

標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)配標(biāo)法，46種化合物在2～100 ng·mL-1具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.99。以3倍信噪比為方法檢出限，46種化合物的檢出限為0.6～6.0 μg·kg-1，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 46種目標(biāo)化合物的線性、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

（續(xù)表3）

2.5 加標(biāo)回收及精密度

對(duì)陰性樣品魚進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平為5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、50 μg·kg-1， 每 個(gè) 水 平 6 個(gè) 平行，測(cè)得魚中硝基咪唑類的回收率在60%～91%，磺胺類的回收率在60%～119%，喹諾酮類的回收率在60%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤7%（n=6），滿足要求。

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)魚、蝦等水產(chǎn)品食品中磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類中46種獸藥殘留的分析方法。樣品經(jīng)1%乙酸乙腈溶液提取，加入PSA和C18進(jìn)行凈化，使用T3色譜柱進(jìn)行分離，可以減少樣品雜質(zhì)的干擾。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行了比較和優(yōu)化，極大地提高了多種獸藥殘留的檢測(cè)效率，滿足水產(chǎn)品中多種類獸藥風(fēng)險(xiǎn)篩查及安全監(jiān)測(cè)的需要。