王朝輝，彭 敏，鄭維興，楊延康，劉應(yīng)琪，靳澤榮*

（1.四川敏恩檢測(cè)技術(shù)有限公司，四川成都 610000；2.成都圣恩生物科技股份有限公司，四川成都 610000）

花 椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是 蕓 香科、花椒屬植物，因其獨(dú)特的“麻味”口感而被譽(yù)為“八大味”之一；其原產(chǎn)于中國西南地區(qū)（四川、云南、貴州和甘肅等地），人們通常所說的花椒也專指果皮部分，本文所提花椒也指這一部分[1-2]。

花椒的麻味主要由酰胺類物質(zhì)產(chǎn)生，主要成分為鏈狀不飽和脂肪酰胺（包括山椒素、花椒素等），具有強(qiáng)烈的刺激性[3-5]。目前花椒麻味物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、氣相色譜法和紫外分光光度法[6-7]。王洪偉等[8-12]對(duì)以上3種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明紫外分光光度法檢出限高于兩種方法，但在回收率、精密度等方面無明顯差異，并且紫外分光光度法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、成本低、適合大量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此大多企業(yè)實(shí)驗(yàn)室均采用紫外分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，由于產(chǎn)生麻味的酰胺類物質(zhì)有較強(qiáng)的揮發(fā)性，不易提純及保存，故一般通過檢測(cè)其吸光度值，結(jié)合系數(shù)折算計(jì)算含量[13-19]。2020年9月1日實(shí)施了《花椒及花椒加工產(chǎn)品 花椒酰胺總含量的測(cè)定 紫外分光光度法》（GH/T 1290—2020），在此之前實(shí)驗(yàn)室使用的為參考各文獻(xiàn)制定的行業(yè)內(nèi)部的檢測(cè)方法，兩種方法流程及計(jì)算間有一定的差異。本文對(duì)花椒麻味物質(zhì)檢測(cè)前處理方式、兩種不同的紫外分光光度法檢測(cè)麻味物質(zhì)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)比，研究其差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒顆粒、花椒粉，四川翠宏食品有限公司；花椒精油，晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；甲醇，成都市科龍化工試劑廠；針頭式過濾器（0.22 μm），天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；ME204電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；600Y多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；SB25-12DTDN超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 方法一（行業(yè)內(nèi)部檢測(cè)方法）

（1）花椒顆粒/花椒粉樣品處理。將花椒顆粒用粉碎機(jī)適當(dāng)粉碎，過20～30目篩，準(zhǔn)確稱取0.5～1.0 g花椒粉末（可依據(jù)麻度大小適量稱?。┯?50 mL具塞三角瓶中，加入約50 mL甲醇溶液，置于水溫40 ℃超聲波清洗機(jī)中提取30 min，用中性濾紙將提取液過濾，收集濾液于100 mL容量瓶中并定容至刻度。

（2）花椒精油類樣品處理。準(zhǔn)確稱取0.1 g左右的液體產(chǎn)品于100 mL三角瓶中（依據(jù)推測(cè)麻度大小適量稱?。尤爰s50 mL甲醇溶液，放入攪拌子，蓋上三角瓶塞，穩(wěn)定攪拌約30 s，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，收集甲醇提取液并定容至100 mL。

1.3.2 方法二（行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法）

（1）花椒顆粒/花椒粉樣品處理。將花椒顆粒用粉碎機(jī)粉碎后過20目篩，混勻；稱取1 g（精確至0.000 1 g）樣品于燒瓶中，加甲醇50 mL，超聲萃取0.5 h，待提取液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，移取上清液10 mL于50 mL容量瓶定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測(cè)。

（2）花椒精油樣品處理。稱取0.2 g（精確至0.000 1 g）液體樣品于具塞燒瓶中，加甲醇50 mL，超聲萃取0.5 h，待提取液冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測(cè)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 方法一測(cè)定方法

準(zhǔn)確移取中間濾液1 mL于另一100 mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，以甲醇作空白對(duì)照，測(cè)量樣品在254 nm波長下的吸光度值（吸光度值在0.2～0.8最佳），將吸光度值帶入折算公式計(jì)算得出麻味物質(zhì)含量。

1.4.2 方法二測(cè)定方法

以甲醇為參比，測(cè)定樣品液在270 nm處的吸光度，吸光度超出儀器測(cè)定范圍的樣品液用甲醇稀釋后測(cè)定。將吸光度值、稀釋倍數(shù)帶入折算公式計(jì)算得出試樣中麻味物質(zhì)總量。

1.5 結(jié)果計(jì)算

樣品中花椒麻味物質(zhì)含量的計(jì)算公式為

式中：X為樣品中花椒麻味物質(zhì)含量，mg·g-1；A為樣品溶液吸光度；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；E為吸光系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 過0.22 μm有機(jī)濾膜對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

選取不同批次的青花椒顆粒、花椒顆粒、花椒粉和花椒精油進(jìn)行處理后不過0.22 μm有機(jī)濾膜，檢測(cè)樣品的吸光度值；再將樣品過0.22 μm有機(jī)濾膜，檢測(cè)樣品的吸光度值；分別計(jì)算其麻味物質(zhì)含量，再將各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行獨(dú)立雙樣本T檢驗(yàn)，對(duì)比過濾膜和不過濾膜對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[20]。分析數(shù)據(jù)見表1和表2。

表1 不同基質(zhì)使用兩種方法進(jìn)行過濾膜/不過濾膜對(duì)比檢測(cè)結(jié)果

表2 不同基質(zhì)使用兩種方法進(jìn)行過濾膜/不過濾膜對(duì)比T檢驗(yàn)分析結(jié)果

方法一和方法二測(cè)試溶液是否過0.22 μm有機(jī)濾膜上機(jī)檢測(cè)的結(jié)果差異很小，P值為0.770～0.996，均大于0.05，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均為不顯著，表明過濾膜的步驟對(duì)麻味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果無顯著影響。

2.2 過篩對(duì)檢測(cè)的影響

對(duì)于花椒顆粒樣品，方法一和方法二均為碎樣后過篩檢測(cè)，但觀察發(fā)現(xiàn)花椒顆粒的皮更易粉碎，內(nèi)殼相對(duì)較難粉碎，而麻味物質(zhì)主要存在于花椒果實(shí)的皮中，因此花椒顆粒樣品過篩后檢測(cè)的結(jié)果是否能代表整顆花椒的麻味物質(zhì)含量需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)選取10批次的青花椒顆粒和紅花椒顆粒分別使用方法一和方法二進(jìn)行不過篩和過篩處理后檢測(cè)，計(jì)算結(jié)果見表3。同時(shí)對(duì)4組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立雙樣本T檢驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果見表4。

由表3和表4可知，方法一和方法二過篩后的麻味物質(zhì)檢測(cè)值和過篩前的檢測(cè)值無明顯增加或下降的變化規(guī)律，P值均大于0.05，表明數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異，在不同批次的花椒顆粒的檢測(cè)中，過篩對(duì)檢測(cè)結(jié)果無顯著的影響。

表3 花椒顆粒使用不同檢測(cè)方法進(jìn)行過篩/不過篩對(duì)比檢測(cè)結(jié)果

表4 花椒顆粒使用不同檢測(cè)方法進(jìn)行過篩/不過篩對(duì)比T檢驗(yàn)分析結(jié)果

2.3 不同方法檢測(cè)結(jié)果的差異性

分別對(duì)不同批次的青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉和花椒精油進(jìn)行兩種方法的處理并檢測(cè)，以方法一檢測(cè)值減去方法二檢測(cè)值表示相對(duì)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法行業(yè)內(nèi)部檢測(cè)方法檢測(cè)值的增加值，再除以行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)值表示其増比值，計(jì)算結(jié)果見表5。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立雙樣本T檢驗(yàn)分析，分析兩種方法間的差異性，計(jì)算結(jié)果見表6。

表5 不同基質(zhì)使用兩種方法檢測(cè)對(duì)比結(jié)果

（續(xù)表5）

表6 不同基質(zhì)使用兩種方法檢測(cè)對(duì)比T檢驗(yàn)分析結(jié)果

方法一所測(cè)得的麻味物質(zhì)含量均高于方法二的測(cè)試結(jié)果，麻味物質(zhì)含量增加值較為一致，増比受樣本本身麻味物質(zhì)含量大小影響，由于花椒精油自身麻味物質(zhì)含量較高，増比相對(duì)其他3種基質(zhì)更低。使用雙樣本獨(dú)立T檢驗(yàn)分析結(jié)果為青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉3種基質(zhì)的P值分別為0.000、0.018、0.000，均小于0.05，表明這3種基質(zhì)下兩種方法檢測(cè)結(jié)果存在顯著性差異，花椒精油基質(zhì)的P值為0.259，大于0.05，表明此基質(zhì)下兩種方法的檢測(cè)結(jié)果不存在顯著性差異。

2.4 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性

以方法二檢測(cè)結(jié)果為因變量Y、方法一檢測(cè)結(jié)果為自變量X，對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸計(jì)算以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，結(jié)果見表7。計(jì)算得出相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，線性相關(guān)系數(shù)較好，總樣本的相關(guān)系數(shù)為0.999 1，線性良好。以方法一檢測(cè)結(jié)果通過總樣本的線性回歸方程計(jì)算方法二的檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)值，對(duì)方法二的實(shí)測(cè)值及預(yù)測(cè)值進(jìn)行雙樣本配對(duì)T檢驗(yàn)分析[21]，驗(yàn)證預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的差異，見表8。P值為0.994，大于0.05，表明回歸計(jì)算后的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值無顯著性差異。

表7 不同基質(zhì)及總樣本兩種方法檢測(cè)結(jié)果的線性回歸計(jì)算

表8 方法二實(shí)測(cè)值/回歸計(jì)算預(yù)測(cè)值雙樣本配對(duì)T檢驗(yàn)

3 結(jié)論

本文對(duì)兩種基于紫外分光光度計(jì)對(duì)花椒麻味物質(zhì)檢測(cè)方法的過濾膜、過篩處理過程對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響進(jìn)行了驗(yàn)證分析，同時(shí)對(duì)兩種方法之間的差異進(jìn)行分析，并對(duì)青花椒顆粒、紅花椒顆粒、花椒粉和花椒精油4種常見基質(zhì)分別進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明，過濾膜對(duì)兩種檢測(cè)方法、不同基質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果均無顯著影響；過篩對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果也無顯著影響，但過篩后結(jié)果可能精密度更高，使檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定；兩種方法在精油基質(zhì)下檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異，在花椒顆粒、花椒粉基質(zhì)下存在顯著差異；方法間的差異具有一定相關(guān)性；以總樣本分析，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好，因此可以認(rèn)為兩種方法對(duì)麻味物質(zhì)的檢測(cè)均可行，但兩者之間還存在一定的差異，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析及不同樣品對(duì)比時(shí)最好選取其中一種檢測(cè)方法持續(xù)使用。本研究可為麻味物質(zhì)檢測(cè)方法的簡(jiǎn)單化、一致性以及可對(duì)比性研究提供一個(gè)新的的思路。