崔潤芝，史正剛，霍曼，趙志英，談慧媛，尉苗苗，馮鵬，尚菁

（甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000）

兒童孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種異質性的兒童神經發(fā)育障礙性疾病，多起病于嬰幼兒時期，2013年美國頒布的《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第5版（DSM-V）列出其有社會溝通與交往障礙以及重復刻板行為兩大核心缺陷，這些癥狀嚴重影響他們在學校、工作和其他生活領域的正常運轉能力。隨著社會生活環(huán)境和家庭結構的變化，其患病率逐年上升，世界衛(wèi)生組織（WHO）通過在占人口16%的國家進行研究，估計全球兒童ASD 患病率為0.76%［1］。最新的美國疾控中心報告顯示，2018年美國8 歲兒童的ASD 總患病率為1/44（2014年為1/59，2016年為1/54），且男女比例為4.2∶1［2］。復旦大學王藝教授團隊研究［3］顯示，ASD 在我國兒童中的患病率為0.7%。ASD在其病因和表型上都是異質性疾病，這種異質性使得對其發(fā)病機制的研究非常有難度。有研究結果表明［4］，ASD 的潛在病理、生理學可能與氨基酸、反應性氧化應激、神經遞質和微生物群-腸-腦軸的改變等有關。目前已有許多研究為ASD 患者的氧化應激（oxidative stress，OS）水平升高和抗氧化能力降低提供了證據。因此，本文主要從氧化損傷標志物論述OS與ASD之間的關系。

1 氧化應激

氧化應激（OS）被認為是促氧化劑和抗氧化劑之間的失衡狀態(tài)導致活性氧（ROS）或活性氮（RNS）過量而引起的細胞損傷［5］。其特征是產生過多的自由基，抗氧化劑水平下降，氧化劑/抗氧化劑比例失衡，即生物體內ROS和內源性抗氧化劑的產生不平衡［6］。各種疾病及正常的衰老過程都會增加OS，并產生ROS，導致細胞氧化還原系統(tǒng)發(fā)生改變，最終導致組織損傷和細胞死亡［7］。普通成年人大腦約占體質量的2%～3%，占總血流供應的20%，大腦以大約1.5 mmol/（min·g）的速率利用氧氣，腦的氧耗量占機體總氧耗量的23%，由于其高氧狀態(tài)，致使大腦特別容易受到ROS 的影響［8］。所以，主要精神疾病的發(fā)病機制都與OS 密切相關，比如阿爾茨海默?。?］、唐氏綜合征［10］、抑郁癥［11］等。

另外許多遺傳和環(huán)境因素在ASD 的病因學中起著至關重要的作用，但尚未形成共識。有學者認為，ASD 可能因遺傳和環(huán)境因素之間的相互作用引起，而OS 在兩者之間起橋梁作用［12］。在涉及ASD 發(fā)病機制的許多因素中，OS已被認為是最具臨床證據性的潛在機制［13］，特別是在發(fā)育的早期階段［14］。

2 氧化損傷標志物與ASD的相關性

ASD 在神經生物學中被認為與氧化應激有關，如活性氧和脂質過氧化水平的增加，以及氧化應激其他指標的增加。因ASD 患兒細胞內和細胞外的谷胱甘肽水平失衡和谷胱甘肽儲備能力下降，確診患兒被認為更容易受到氧化應激的影響。多項研究表明，氧化還原失衡和氧化應激是ASD 病理、生理的重要組成部分［15］。當氧化劑超過抗氧化防御時，生理系統(tǒng)就會遭受OS，導致生物分子及功能出現障礙，身體中的脂質、蛋白質、核酸等都會受到氧化損傷。目前存在許多用于檢測尿液、血液、呼吸和器官組織樣品中的氧化副產物的分析方法。氧化脂質及其蛋白質化合物通常用作氧化生物標志物。血液和尿液是人體生理、病理過程（包括大腦）的整合物質和客觀反映，因受醫(yī)學倫理學限制，相關的氧化損傷標志物客觀上不能在腦組織中得到測量。因此，學者們對氧化應激狀態(tài)標志物的研究只局限在外周。本文只論述血液和尿液中常見的氧化損傷標志物。

2.1 脂質過氧化（LPO）標志物

脂質過氧化（LPO）由自由基與多不飽和脂肪酸連鎖反應引起，導致產生具有劇毒的LPO 和烴聚合物。LPO 水平通常使用硫代巴比妥酸反應物質（TBARS）測定法測量其最終產物丙二醛（MDA）和類似物的濃度［16］來評價。LPO的常見標志物是丙二醛（MDA）、4-羥基壬烯醛（HNE）和F2-異前列腺素。LPO 增加與線粒體功能障礙、神經元損傷、血小板活性異常和ASD血流改變有關［17］。使用TBARS 檢測的研究［18］發(fā)現，與健康對照組（n= 19，30，26）相比，ASD 兒童（n= 19，30，27）的LPO 增加。一些報告表明，ASD 患者其他LPO 標記物水平增加，證實了ASD 患者OS 水平的增加。JAMES 等［19］和AL-GADANI 等［20］報道，與發(fā)育正常的非ASD 兄弟姐妹相比，ASD 兒童血液中的LPO 更高。在健康人中，LPO 通常由紅細胞中存在的各種抗氧化酶的活性聯合控制，在ROS 產生過多的情況下，如自閉癥，控制效能欠佳。研究發(fā)現［18］，與對照組相比，ASD 患者組的紅細胞TBARS 水平增加了2～3 倍，這表明ASD 患者膜結構中的LPO 水平可能增高，因此盡管抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性增加，氧化應激仍然存在。

2.1.1 丙二醛

丙二醛（MDA）是自由基攻擊細胞膜產生的LPO，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性，能夠反映機體LPO 水平，從而間接地反映體內受到OS 損傷的程度。MDA 在體外影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶的活性，被用作LPO 標記物。高水平的MDA 被認為是6 歲以上ASD 兒童氧化應激的生物標志物［21］。一項研究表明［22］，15 名ASD患者中有13 名（87%）患者的血漿MDA 含量高于正常人。YUI 等［23］研究發(fā)現ASD 組血漿MDA-LDL 水平、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸（DHA）水平及DHA/花生四烯酸比值均顯著高于對照組，血漿SOD 水平顯著低于對照組，并認為DHA和血漿MDA-LDL水平之間的這種聯系可能有助于ASD患者的行為。

2.1.2 F2-異前列腺素

F2-異前列腺素是細胞膜上花生四烯酸受活性氧自由基作用發(fā)生脂質過氧化反應而產生的一系列類似前列腺素F2 的化合物，被認為是OS 和LPO 的可靠生物標志物［24］。在尿液中排泄的F2-異前列腺素及其代謝物是化學上穩(wěn)定的化合物［25］，并對膳食攝入的脂質不敏感。其中，8-異前列腺素F2α（8-isoPGF2α）由于其穩(wěn)定性，是LPO 的一個特別可靠的指標。體液中F2-異前列腺素的測定被認為是在體內通過自由基途徑測定LPO的可靠的生物標志物［26］。MOSTAFA等［27］研究表明，ASD 兒童血漿F2-異前列腺素水平顯著高于健康對照組，血漿谷胱甘肽過氧化物酶水平顯著降低。88.64%的ASD 兒童由于血漿F2-異前列腺素升高和/或谷胱甘肽過氧化物酶減少而發(fā)生OS。

2.1.3 乙酰-賴氨酸加合物

乙酰-賴氨酸加合物（hexanoyl-lysine adduct，HEL）是一種新型LPO 修飾的賴氨酸殘基。HEL 是通過氧化-6 脂肪酸（如亞油酸或花生四烯酸）氧化修飾而形成的［28］。HEL 可以作為LPO 初期階段的一個有用的生物標記物［29］。ASD 患兒的尿HEL 水平也被發(fā)現升高［30］，YUI 等［31］認為ASD 患兒的HEL 水平升高與抗氧化能力下降有關。IMATAKA 等［32］研究了19 名ASD 患者［年齡（10.8±5.2）歲］和10 名年齡匹配的健康對照組［年齡（14.2±7.0）歲］的尿液和血漿生物標志物與行為癥狀之間的關系，使用異常行為檢查表（ABC）評估行為癥狀，與對照組相比，ASD組尿TAC水平顯著降低，尿HEL水平顯著升高。

2.2 蛋白質氧化

蛋白質作為ROS 的主要靶點之一，在自由基及相關氧化物的作用下，使血漿或細胞中的蛋白質與某些特定的氨基酸殘基發(fā)生反應，導致蛋白質發(fā)生功能與結構上的改變［33］。自由基-蛋白質反應在體內可引起與許多病理過程相關的細胞結構的廣泛損傷，如LPO、蛋白質及核酸等的氧化損傷。估計人血漿內參與過氧化氫反應的抗氧化物有10%～50%是蛋白質［34］，因此蛋白質氧化研究成為研究氧化應激及其損傷的重要內容之一。目前的研究表明，由ROS/RNS 引起的蛋白質氧化的損傷及衰老與阿爾茨海默病、帕金森氏病、ASD等疾病的發(fā)生均有關。

2.2.1 蛋白質羰基

蛋白質羰基（PCO）是目前應用最多的蛋白質氧化損傷標志物。ROS能通過各種氧化機制將蛋白質轉換成羰基衍生物，故其成為反映蛋白質氧化損傷的敏感指標之一［35］。在對氨基酸殘基的修飾中，PCO 的形成是蛋白質氧化的早期標志。YENKOYAN 等［36］測定了ASD 患者血漿中的高級氧化蛋白產物（AOPP）、PCO 水平等，證明了自閉癥患者蛋白質氧化、DNA 損傷、炎癥和線粒體超氧化物產生標志物升高之間存在關系的早期假設［37］。有報道稱，阿曼蘇丹國自閉癥兒童的氧化應激指標NO、MDA 和蛋白羰基等水平升高，抗氧化蛋白如銅藍蛋白、轉鐵蛋白等水平降低［38-39］。

2.2.2 二酪氨酸

酪氨酸是蛋白質氧化的主要結果之一。二酪氨酸（DT）是一種酪氨酸二聚體，由酪氨酸自由基衍生而來，由ROS、金屬催化氧化、紫外線照射和過氧化物酶形成。DT 曾被認為是蛋白質氧化的良好指標［40］。當在尿液中測量時，它對氧化應激相關的病理條件呈現高敏狀態(tài)［41］。DT作為待研究的生物標記物前景廣闊，這一標志物的添加使研究氧化狀態(tài)在人類健康和疾病中作用的現有工具多樣化。ANWAR 等［42］觀察38 例ASD 患兒和31 名年齡匹配的健康對照組，測定血漿和尿液中的蛋白糖化、氧化等加合物，結果與健康對照組相比，ASD 患兒血漿蛋白中DT 含量增加。研究指出［28］，ASD 診斷與更高水平的DT 表達相關，已被證實是兒童和青少年診斷ASD最具影響力的預測因子。

2.3 核酸氧化

8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）被公認為是DNA 氧化損傷的主要標志物。8-羥基-2'-脫氧鳥苷［43］是由羥基自由基，單線態(tài)氧和直接光動力作用形成的氧化損傷DNA的產物，可在組織、血清、尿液等標本中檢測。8-OH-dG已被驗證為動物模型中OS的生物標志物，但至目前尚未在人體研究中顯示。既往研究也證實它是OS 引起DNA 損傷的敏感生物標志物［44］。DNA 修復能力的個體差異對尿液中8-OH-dG水平的影響仍然不確定，個體內變異性也未知，但這一生物標志物可以被用作監(jiān)測工具。有研究結果提示，25（OH）D、CYP1B1、hs-CRP和8-OH-dG作為ASD早期診斷的生物標志物的可能性，且應聯合使用使診斷價值最高化，但目前仍需進一步研究來評估這一假設［45］。

2.4 其他氧化損傷標志物

近年來，EFE 等［46］將動態(tài)硫醇/二硫化物穩(wěn)態(tài)（DTDH）作為一種新的血漿氧化應激生物標記物，調查了60 名3～10 歲ASD 兒童和54 名正常兒童的血漿DTDH 參數，研究氧化劑-抗氧化劑內穩(wěn)態(tài)受損在ASD 發(fā)病機制中的作用，結果顯示ASD 兒童DTDH 紊亂，ASD患兒血漿二硫化物水平顯著升高，而血漿天然硫醇和總硫醇水平顯著降低。結果表明OS 增加與抗氧化能力降低和ASD之間存在合理關系。

自閉癥中更多OS 的間接標志物包括內源性抗氧化酶（如GSH-Px、SOD）和谷胱甘肽降低、抗氧化營養(yǎng)素降低、有機毒素和重金屬升高、黃嘌呤氧化酶和細胞因子升高以及NO 的增加等。其中關于內源性抗氧化酶及谷胱甘肽方面的研究報道較多，如GU 等［47］通過觀察認為，與對照組相比，自閉癥組GPx活性明顯降低（P＜0.05）；PANGRAZZI 等［48］在討論氧化應激如何支持大腦炎癥和ASD 樣行為時發(fā)現，與健康對照組相比，ASD 患者的SOD、過氧化氫酶、GPx 和GSH 水平較低；WANG 等［49］研究發(fā)現血清SOD 水平的降低可能與我國2～6 歲兒童ASD 的病理生理發(fā)展有關，可作為ASD 的獨立危險指標；也有研究報道為保護機體免受氧化應激影響GSH-Px、SOD 水平可能會代償性升高［18］。氧化生物標志物在ASD 臨床管理中的應用已經開始，各種血液、尿液、糞便和呼吸測定法檢測得出的氧化損傷標志物結果及水平可用于確定最佳劑量和營養(yǎng)素與其他干預措施的組合。FRUSTACI 等［50］研究發(fā)現，NO、MDA、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽及其前體、氨基酸、維生素、TBARS 和氧化還原酶是最受檢查的相關參數。但OLESOVA 等［51］指出，ASD 和非ASD 組間的代謝組譜僅在學齡兒童中有統(tǒng)計學意義，而在學齡前兒童中沒有統(tǒng)計學意義。

3 中醫(yī)藥治療ASD與OS的相關性

中醫(yī)古籍中并無“自閉癥”或“孤獨癥”病名的明確記載，但據相關癥狀記載，ASD可被歸入“語遲”“郁病”“無慧”“童昏”等范疇，且認為自閉癥病位在腦，與心、肝、腎三臟密切相關，多因先天胎稟不足，后天失于調養(yǎng)，以致精血不足，腦髓失充而發(fā)病。

現代藥理學研究已證實，中藥有效成分可通過清除自由基、抑制脂質過氧化氫和調節(jié)抗氧化酶水平來增強細胞內SOD、CAT、GSH-Px 等活性、抑制ROS、MDA、LDH 等的釋放，有學者從這一角度對單味藥及復方有效成分進行了梳理［52］，相關單味藥有補虛藥（地黃、淫羊藿、人參、刺五加），行氣活血藥（川芎）；中藥復方有地黃益智方、地黃飲子、加味四逆散等。楊培樹等［53］研究發(fā)現當歸、黃芪、丹參、雞血藤水提物能降低大鼠血管平滑肌細胞上清液中MDA 及NO 的含量，具有抗OS 作用，并可通過協(xié)同作用發(fā)揮療效。惠香香等［54］運用數據挖掘分析中藥調控機體OS的用藥特點，發(fā)現有效成分50 種，臨床用藥以補虛藥和活血化瘀藥為主，丹參、川芎、紅花、黃芪、當歸、人參、甘草位居前7 位。在配伍用藥上，江曉宇等［55］采用重用熟地黃的引火湯加味聯合行為干預治療ASD 患兒；葉劍飛等［56］用通竅活血湯、地黃飲子、開心散等組成的抗閉1 號治療ASD 患兒；馬丙祥教授［57］重用黃芪合四君子湯治療心脾虧虛證ASD 患兒，后加用四逆散輔助治療；樊亞妮等［58］用白芍、甘草、遠志、人參、茯苓、當歸、川芎等制成靜帥康膠囊、聰腦益智膠囊輔助治療ASD 屬心肝火旺證者，經治療后，患兒相關癥狀均較前明顯好轉。史正剛教授［59］亦在早期研究中發(fā)現，參麥加味湯可降低新生大鼠缺氧缺血性腦病腦組織中的MDA 含量，提高SOD含量，增強腦組織內自由基清除酶類的活力。

研究發(fā)現，針刺治療多種疾病的氧化應激拮抗作用可通過抑制炎性細胞活化、改善線粒體呼吸功能、減少鐵離子超載、增強內源性抗氧化酶（如SOD、CAT 及GSH-Px）活性、減少細胞大分子（如脂質、蛋白質及DNA）的氧化損傷、調節(jié)與ROS 產生或消除相關的信號通路（Cyt C 和Nrf2 通路）等多種途徑增強清除自由基能力以調控機體穩(wěn)態(tài)。袁青等［60］從BNIP3介導的線粒體自噬機制出發(fā)，推斷針刺對細胞自噬表達的增強可能是其治療兒童腦病的機制之一。陳麗容等［61］通過動物實驗發(fā)現針刺興奮法可降低缺血、缺氧性腦損傷幼鼠腦組織中MDA、NO水平，提高GSH-Px水平，促進腦組織內代謝產物的清除，保護腦神經功能。程巖巖等［62］認為，“逆針灸”能通過提高血管性癡呆模型大鼠SOD的含量，降低ROS及MDA的含量而對模型大鼠起到抗氧化作用。KHONGRUM 等［63］研究發(fā)現激光針灸神門穴（HT7）可通過改變丙二醛、谷胱甘肽過氧化物酶活性水平而改善丙戊酸自閉癥大鼠模型的自閉癥癥狀。樵成等［64］對42 例心脾兩虛證ASD 患兒采用針藥聯合治療驗證了通過抗OS治療ASD的可能優(yōu)勢所在。

中醫(yī)藥治療ASD臨床應用廣泛，中藥對機體OS的相關調控作用已被證實，且在治療ASD的配伍用藥上與現代藥理學研究高度呼應，但大部分中藥配伍湯劑治療ASD是否通過抗OS發(fā)揮作用仍不明確；針刺治療療效顯著，但對針刺通過調節(jié)氧化損傷標志物來治療ASD的臨床研究和動物實驗較少。未來亟需大量動物實驗及臨床研究從這兩方面出發(fā)來精確驗證這一觀點。

4 小結

本文綜述了氧化應激導致脂質過氧化、蛋白質氧化、核酸氧化而使機體代謝產生丙二醛、F2-異前列腺素、乙酰-賴氨酸加合物、蛋白質羰基、二酪氨酸、8-羥基-脫氧鳥苷等氧化損傷標志物，以及新的血漿氧化應激生物標記物動態(tài)硫醇/二硫化物穩(wěn)態(tài)（DTDH），這些標志物都是自由基過量，抗氧化劑水平下降，氧化劑/抗氧化劑比例失衡的結果。亦闡述了當前中醫(yī)藥在治療ASD上所體現的抗OS作用，并指出了未來亟需攻堅的方向。

OS在ASD 發(fā)展中的作用已經研究了幾十年，越來越多的證據表明，ASD 的發(fā)病機制與氧化損傷產物的堆積和抗氧化代謝紊亂有關。通過比較ASD 患者與健康人OS 血液尿液，發(fā)現了大量標記物，且發(fā)現大多數標記物之間存在異質性，這是臨床實踐探討的熱點。由于缺乏ASD 的實驗室檢測金標準，使其早期診斷和初步干預都具有挑戰(zhàn)性，目前的診斷方法主要靠對患者行為的臨床評估，西醫(yī)治療上利培酮與阿立哌唑已獲美國食品和藥物管理局批準用于臨床治療，但長期大量使用的副作用明顯［65-66］，尚無其余特定療法。ASD 患兒家長經常轉向有限的或無支持證據的治療，包括行為、藥理和替代療法，但替代治療的有效性證據目前仍無定論。更令人擔憂的是，ASD 患兒家長可能會考慮接受無效的、侵入性的甚至有害的治療。故從代謝組學出發(fā)，確定潛在的生物標志物，用于早期診斷ASD，并將其用于指導確定最佳劑量和營養(yǎng)素與其他干預措施的組合，監(jiān)測臨床個體治療的指標［52］，來早期評估和治療抗氧化狀態(tài)以增加改善ASD 患兒預后的可能性，更快地推斷ASD 的發(fā)病機制、治療方案及早期預防，顯得尤為重要。由此可見，大規(guī)模嘗試研究抗氧化劑在自閉癥中的作用也應引起學者廣泛關注，相關內容仍需深入的證據、臨床報告和研究。中醫(yī)藥在治療ASD 上療效明顯，針刺發(fā)揮作用的相關機制已得到探析，但目前關于針刺治療調節(jié)OS代謝產物的研究主要集中在阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥、腦卒中后抑郁等神經精神系統(tǒng)疾病上，對ASD 的針對性研究較少；內治法配伍用藥上雖與現代藥理學研究高度呼應，但具體機制仍不明確，今后可從上述兩方面出發(fā)，以分子生物學及機體生化為切入點，同時進行大量動物實驗及臨床研究，為中醫(yī)藥治療ASD提供循證醫(yī)學依據，以期為ASD的預防、診斷及治療提供新方法及新方向。