賈羲，付智慧，茹慶國(guó)，聶安政?

（1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052；2. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008）

細(xì)辛來(lái)源于馬兜鈴科植物華細(xì)辛（Asarum sieboldiiMiq.）、北細(xì)辛［Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var. mandshuricum（Maxim.）Kitag.］或漢城細(xì)辛（Asarum sieboldiiMiq. var. seoulense Nakai）的干燥根和根莖，后兩種習(xí)稱“遼細(xì)辛”。細(xì)辛最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要功效為解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲，臨床多用于風(fēng)寒感冒、頭痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵、風(fēng)濕痹痛、痰飲喘咳等［1-3］?！侗静菥V目》中提及“細(xì)辛不過(guò)錢，過(guò)錢命相連”［4］，細(xì)辛的毒性便開始受到關(guān)注，細(xì)辛中所含馬兜鈴酸具腎毒性，長(zhǎng)期攝入可致使腎小管功能受損，甚至有誘發(fā)腎癌的風(fēng)險(xiǎn)，印證了細(xì)辛的腎毒性［5-9］。《中華人民共和國(guó)藥典》將細(xì)辛用量限制在1～3 g，但在臨床中為了達(dá)到特定療效，常常超劑量使用，如國(guó)家中醫(yī)藥管理局推薦的新冠肺炎防疫通用方清肺排毒湯中，細(xì)辛用量為6 g，而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)辛煎劑的中毒劑量為6～15 g。作為毒效并存的藥物，臨床如何基于療效與毒性把握細(xì)辛用量？因此，筆者擬基于細(xì)辛的抗炎、鎮(zhèn)痛作用與腎毒性作用初步探討細(xì)辛的“量-毒-效”關(guān)系，旨在為細(xì)辛的臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)辛水煎液的制備

細(xì)辛購(gòu)買于河南尚華堂藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)：201001），經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院王娟教授鑒定為馬兜鈴科植物華細(xì)辛（Asarum sieboldiiMiq.）的根及根莖。稱細(xì)辛1 200 g，加蒸餾水6 000 mL煎煮60 min，過(guò)濾，將藥渣再加水3 000 mL煎煮60 min，再次過(guò)濾，將2次濾液合并，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，小鼠給藥前將水煎液分別以蒸餾水稀釋至1.2、0.6、0.3、0.15 g/mL（生藥量）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠（清潔級(jí)）180只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各90 只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0004。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度（23±1）℃，濕度（45±5）%，標(biāo)準(zhǔn)12 h光照/12 h黑暗節(jié)律，普通清潔級(jí)鼠飼料與飲水。

1.1.3 試劑及儀器

二甲苯（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：20150508）；冰醋酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：920827）；地塞米松（北京索萊寶科技有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H44020701）；蘇木素-伊紅染液（德國(guó)Sigma公司）；打孔器（上海澤雅科教儀器有限公司，型號(hào)：INS500075-5）；電子天平（上海力辰儀器科技有限公司）；BX53顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d 后，取60 只（雌雄各30 只），按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、陽(yáng)性藥組以及細(xì)辛水煎液劑量1、2、3、4組，共6組，每組10只。陽(yáng)性藥組小鼠灌胃1.5 mg/kg地塞米松，細(xì)辛水煎液劑量1、2、3、4組小鼠分別灌胃24、12、6、3 g/kg 的細(xì)辛水煎液，對(duì)照組小鼠給予蒸餾水，各組給藥量均為20 mL/kg。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h 后小鼠腹腔注射1%的醋酸0.2 mL，觀察并記錄15 min 內(nèi)每組小鼠扭體次數(shù)。

1.2.2 耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

小鼠分組與灌胃情況同醋酸扭體實(shí)驗(yàn)。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃1 h 后將0.05 mL 二甲苯均勻涂抹于小鼠右耳的兩面，左耳對(duì)應(yīng)位置涂抹等體積的生理鹽水，0.5 h 后脫頸椎處死小鼠，將小鼠左右兩耳剪下，疊放對(duì)齊，用打孔器在左右耳相同部位打孔，取下稱重。

腫脹度（g）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量

1.2.3 熱板法實(shí)驗(yàn)

小鼠分組與灌胃情況同醋酸扭體實(shí)驗(yàn)。每日灌胃1 次，連續(xù)灌胃給藥7 d，于末次灌胃30、60 min 后分別測(cè)量并記錄小鼠痛閾值。

1.2.4 腎臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色

每批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取同一位置腎臟組織固定在4%多聚甲醛中，分別采用70%、75%、80%、90%、95%乙醇和無(wú)水乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明處理后用石蠟進(jìn)行包埋。包埋好的腎臟組織以4 μm 厚度標(biāo)準(zhǔn)切片，進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理，分別以無(wú)水乙醇及95%、80%乙醇進(jìn)行復(fù)水，然后用純水浸泡5 min 后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，脫水后中性樹膠封片，風(fēng)干，光學(xué)顯微鏡下觀察組織小鼠腎臟病理形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同分組之間進(jìn)行單因素方差分析比較組間差異；各組方差齊性條件下采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較，各組方差不齊情況下采用Dunnett's T3 法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠耳廓腫脹度變化情況比較

陽(yáng)性藥組小鼠耳廓腫脹度較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05）；細(xì)辛水煎液劑量1、2、3、4組腫脹度較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠耳廓腫脹度比較（±s）

表1 各組小鼠耳廓腫脹度比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別對(duì)照組陽(yáng)性藥組細(xì)辛水煎液劑量1組細(xì)辛水煎液劑量2組細(xì)辛水煎液劑量3組細(xì)辛水煎液劑量4組腫脹度（g）0.025 3±0.002 8 0.021 3±0.002 5*0.016 5±0.004 3**0.012 5±0.001 2**0.014 2±0.002 4**0.016 9±0.003 7**n 10 10 10 10 10 10劑量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)變化情況比較

小鼠在造模后15 min，陽(yáng)性藥組、細(xì)辛水煎液劑量1、2 組扭體次數(shù)較對(duì)照組顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），其余各組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別對(duì)照組陽(yáng)性藥組細(xì)辛水煎液劑量1組細(xì)辛水煎液劑量2組細(xì)辛水煎液劑量3組細(xì)辛水煎液劑量4組扭體次數(shù)（次）19.80±2.00 13.80±2.00**14.20±2.24**17.30±1.70*18.60±2.00 19.80±2.00 n 10 10 10 10 10 10劑量—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.3 各組小鼠痛閾值變化情況比較

給藥后30 min，陽(yáng)性藥組、細(xì)辛水煎液劑量1組小鼠痛閾值較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其余各組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥后60 min，各給藥組痛閾值較對(duì)照組均顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠痛閾值比較（±s）

表3 各組小鼠痛閾值比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別n 劑量對(duì)照組陽(yáng)性藥組細(xì)辛水煎液劑量1組細(xì)辛水煎液劑量2組細(xì)辛水煎液劑量3組細(xì)辛水煎液劑量4組痛閾值（s）給藥后30 min 16.54±2.02 18.85±1.55*22.75±3.56**15.82±3.55 17.13±1.04 15.32±1.29給藥后60 min 13.81±1.03 21.11±1.43**25.22±3.30**20.30±3.31**19.04±1.74**16.96±1.54**10 10 10 10 10 10—1.5 mg/kg 24 g/kg 12 g/kg 6 g/kg 3 g/kg

2.4 各組小鼠腎臟病理變化情況比較

對(duì)照組小鼠腎組織表面被膜由厚薄均勻的致密結(jié)締組織構(gòu)成，腎實(shí)質(zhì)為淺層皮質(zhì)和深層髓質(zhì)，皮質(zhì)髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)中腎小球分布均勻，腎小球中細(xì)胞數(shù)量以及基質(zhì)均勻，腎小管排列緊密，間質(zhì)無(wú)明顯增生，未見明顯的炎性改變；與對(duì)照組相比，小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)、熱板法實(shí)驗(yàn)中細(xì)辛水煎液劑量1、2 組的腎組織均出現(xiàn)大量的腎小管與集合管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞水腫，上皮扁平化細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染；其余各組未見明顯變化。見圖1。

圖1 不同劑量的細(xì)辛水煎液對(duì)小鼠腎組織的影響（HE染色，×200）

3 討論

細(xì)辛始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床應(yīng)用廣泛，《傷寒雜病論》中收載含細(xì)辛的中藥方劑19 首［10］，《備急千金要方》中記載含細(xì)辛方劑6 首［1］，清代共發(fā)現(xiàn)373 首含細(xì)辛的中藥方劑［11］，2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》中共收載含細(xì)辛中藥制劑42 首［12］。自2020年清肺排毒湯（含細(xì)辛6 g）被推薦成為首個(gè)防疫通用方并廣泛應(yīng)用于臨床。但研究顯示，細(xì)辛臨床毒性反應(yīng)眾多［13］，其臨床應(yīng)用安全性受到廣泛關(guān)注。臨床對(duì)細(xì)辛應(yīng)用頗具爭(zhēng)議，有欲取速效而超量使用，亦有因恐懼毒性而棄之不用者，究其原因，都是對(duì)細(xì)辛毒-效關(guān)系的認(rèn)識(shí)模糊。本研究討論不同劑量下的細(xì)辛的毒-效關(guān)系，為細(xì)辛毒-效關(guān)系的深入探討奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床細(xì)辛湯劑用量的把控提供參考。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，24、12、6、3 g/kg劑量的細(xì)辛水煎液均可顯著抑制致炎物引起的小鼠耳廓腫脹，并能明顯降低小鼠耳腫脹度（P＜0.01）；24、12 g/kg 劑量的細(xì)辛水煎液可顯著減少醋酸所致的小鼠疼痛扭體次數(shù)，延長(zhǎng)小鼠扭體潛伏期（P＜0.05 或P＜0.01）；給藥后30 min，24 g/kg 劑量的細(xì)辛水煎液開始顯著提升小鼠痛閾值；給藥后60 min，24、12、6、3 g/kg 劑量的細(xì)辛水煎液均可顯著提升小鼠的痛閾值。連續(xù)給藥7 d 后，24、12 g/kg 劑量的細(xì)辛水煎液可對(duì)小鼠的腎臟產(chǎn)生輕度的損傷，6、3 g/kg 劑量的細(xì)辛水煎液對(duì)腎臟影響較小。上述結(jié)果表明，3～24 g/kg劑量的細(xì)辛水煎液均具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，連續(xù)給予12～24 g/kg劑量的細(xì)辛水煎液7 d可能會(huì)產(chǎn)生輕度腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)辛脂素、甲基丁香酚是細(xì)辛抗炎鎮(zhèn)痛的主要活性成分，而馬兜鈴酸、黃樟醚是細(xì)辛的主要毒性成分，其中馬兜鈴酸是主要的腎毒性成分。本研究結(jié)果提示臨床應(yīng)用細(xì)辛?xí)r，應(yīng)從小劑量開始，療效不佳時(shí)逐漸增加劑量，當(dāng)使用大劑量細(xì)辛?xí)r，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)配伍保護(hù)腎臟的中藥或者抑制馬兜鈴酸溶出的中藥從而達(dá)到減毒之效［14-17］。

本研究基于抗炎鎮(zhèn)痛與腎毒性初步探討了細(xì)辛水煎液“量-毒-效”關(guān)聯(lián)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)12 g/kg 細(xì)辛水煎液連續(xù)給藥7 d即可使腎臟組織發(fā)生病理變化，印證了細(xì)辛的腎毒性。基于此，筆者認(rèn)為：①應(yīng)在6～12 g/kg 范圍內(nèi)設(shè)置多種濃度細(xì)辛水煎液劑量組，深入闡釋細(xì)辛“量-毒-效”關(guān)系；②可基于肝、腎、肺毒性多維聯(lián)合闡釋細(xì)辛的“量-毒-效”關(guān)系；③應(yīng)基于不同的給藥療程闡明細(xì)辛水煎液“時(shí)-毒-效”關(guān)系；④采用液質(zhì)聯(lián)用明確細(xì)辛水煎液“毒-效”成分，基于“毒-效”成分探討細(xì)辛減毒增效方法。