李元新，陳伯祥，趙子惠，成偉偉，楊 明 ，蒙 琦

(甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平涼 744000)

豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)引起的仔豬一種以急性腹瀉為特征的急性腸道傳染病。主要特征表現為厭食、嘔吐、腹瀉、水樣和糊狀糞便等癥狀，病程后期嚴重脫水導致仔豬死亡。在室溫環(huán)境中，病毒的感染力可保持7～9個月。豬輪狀病毒病潛伏期為16～24 h，該病不僅在我國大范圍流行，而且發(fā)病率和死亡率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。由于臨床癥狀和流行病學表現與豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬流行性腹瀉 (PED) 非常相似，在實際生產中往往難以診斷而錯失最佳治療時機，從而導致仔豬大面積死亡。因此，掌握豬輪狀病毒病檢測技術對該病的診斷和防治均具有重要意義。本文就豬輪狀病毒病的臨床和實驗室診斷技術及其優(yōu)缺點進行全面綜述，旨在為本病的監(jiān)測和綜合防控提供技術支持。

1 臨床及病理診斷

1.1 臨床診斷

對于養(yǎng)殖基礎薄弱，經濟條件差的養(yǎng)殖戶來說，臨床診斷是他們常用的一種診斷方法，該方法主要根據養(yǎng)殖經驗對仔豬出現的嗜睡、嘔吐、腹瀉、食欲減退，并伴有腹瀉，初期糞便水樣、糊狀、半固體狀或似乳清樣，之后逐漸變?yōu)橐环N黃綠色和灰白色等臨床癥狀來判斷。雖然在一定程度上可以診斷并治療該病，但由于病原未知，存在巨大的潛在風險。

1.2 病理剖檢診斷

豬輪狀病毒病在解剖后可以明顯地看到消化道炎癥，由于感染豬輪狀病毒后，仔豬胃腸功能減弱，表現胃部存有大量乳凝塊，小腸部的糞便顏色變暗發(fā)黑，腸部淋巴結腫脹嚴重。通過鏡檢觀察，發(fā)現小腸絨毛萎縮變短，空腸和回腸表現為微絨毛變少，上皮細胞從柱狀變成扁平狀。

2 實驗室診斷

2.1 病毒的分離鑒定

目前診斷豬輪狀病毒病經典技術方法是病毒分離鑒定。將病料處理后接種于適宜細胞，傳代并根據細胞病變狀況來判定PoRV陰陽性，該法雖然直觀，但存在試驗時間長、操作步驟多，價格偏高等不足。國內學者已成功分離出了豬A群輪狀病毒毒株。庫旭鋼等(2012)從腹瀉仔豬采集糞便樣本經處理接種在MA-104細胞上，通過分離鑒定最終判定為豬輪狀病毒。張賀偉等(2014)將腹瀉仔豬的糞便處理后接種于篩選的該毒株的最適細胞系MA-104上，經過分子生物學鑒定和遺傳學分析，成功分離出了豬A群輪狀病毒毒株。但該法過程繁瑣，耗資較大，目前基層已應用較少。

2.2 電鏡觀察診斷

應用電鏡觀察時發(fā)現，輪狀病毒粒子的形狀看起來像車輪，對采取的病料用磷鎢酸來感染處理，在電鏡下找到特征性的病毒粒子，測定直徑，再拍照保存。最后根據所得病毒顆粒的直徑大小是否符合病毒顆粒直徑范圍來判斷檢測結果的陰陽性。直接電鏡法主要主要用來檢測動物糞便，免疫電鏡法主要用于動物血清檢查，雖然該方法操作簡單、直觀高效，較病毒的分離鑒定在人員操作上要求不高。但所使用的電鏡設備價格昂貴，不適宜在基層進行大規(guī)模推廣。

2.3 血清學診斷

2.3.1 免疫熒光檢測(IFA) 利用IFA檢測豬輪狀病毒是將患病豬糞便或病死豬腸道內容物經處理后制成涂片，經固定、染色，用熒光顯微鏡觀察，這種方法在診斷輪狀病毒中應用最普遍，但對操作人員的實驗技術和樣品質量的要求均比較嚴格。

2.3.2 酶聯免疫吸附試(ELISA) ELISA方法作為經典的病毒檢測方法，因其操作方法簡單，能對大批量樣品進行檢測，污染小且檢出率高等特點，近幾年在基層和各實驗室已普遍應用，特別是對基層獸醫(yī)部門進行大量樣品檢測和流行病學調查帶來了方便。近年來，為達到方便使用，提高檢出效率，以便更好地適應于基層，許多科研工作者在方法上做了大量的創(chuàng)新研究。孟柳等建立了的間接ELISA，利用純化的豬輪狀病毒的VP6蛋白成功檢測到了豬輪狀病毒血清抗體。同樣，陳淑華等以豬群輪狀病毒VP6基因表達的蛋白作為抗原，建立起的間接ELISA方法能夠快速檢測出其IgG抗體，總符合率可達91.5%以上，在豬輪狀病毒病流行病學調查上應用較廣，在豬群抗體水平的監(jiān)測上也有所應用。黃小波等利用雙抗體夾心ELISA方法成功檢測到了豬輪狀病毒。各種ELISA方法因其高效、簡單而被廣泛應用于基層獸醫(yī)部門的樣品的檢測，但由于該方法重復性不夠強，因而具有一定的局限性。Zhu JY Yang等利用在大腸桿菌中表達的PoRV VP6基因在兔體內產生抗體，建立一種能區(qū)分PoRV和其他豬病毒的鑒別ELISA方法， 抗VP6血清抗體可作為PoRV檢測的良好診斷試劑。Nagesha H S 等通過酶免疫分析利用VP7特異性單克隆抗體直接對豬輪狀病毒進行血清分型，采用單克隆抗體進行血清型環(huán)評試驗，將細胞培養(yǎng)適應的豬輪狀病毒和糞便輪狀病毒分為血清型G3、G3/5、G4和G5。該單克隆抗體證實并擴展了多克隆抗血清的血清分型結果。因此，這些單抗是豬輪狀病毒血清分型的潛在試劑。使用亞群特異性單克隆抗體，發(fā)現G3、G3/5和G5血清型含有亞群I抗原，而G4輪狀病毒含有亞群II或亞群I抗原。

2.3.3 膠體金免疫層析技術(GICA) GICA是一種高效的免疫學測定方法，結合了膠體金標記技術和免疫層析技術的優(yōu)點重新組合而建立起來。其基本原理是通過微孔膜滲透作用和毛細現象，使抗原抗體在固相膜上結合并迅速反應，然后利用膠體金標記抗體直接顯色來判斷陰陽性。為使該項技術在輪狀病毒檢測應用中發(fā)揮作用，也有研究者研制出了檢測豬輪狀病毒的膠體金試紙條。該方法整個過程僅需15 min左右，但也存在一些不足，如樣品質量難以控制、靈敏性差、難以定量等。

2.4 分子生物學診斷方法

2.4.1 RT-PCR 診斷 RT-PCR是一種實驗室常用的分了生物學診斷技術，它可以利用少量的核酸樣品能準確地檢測到RNA序列。張雙翔等根據豬輪狀病毒VP6和VP7不同的基因序列，成功設計出了2對RT-PCR特異性引物，建立起針對不同靶基因的豬輪狀病毒快速檢測方法，均有明顯的特異性。張維誼等建立的豬輪狀病毒RT-PCR檢測方法在PoRV、TGEV)、PEDV的病毒檢測試驗中發(fā)現，后兩者均表現為陰性，體現出了很強的特異性。該方法與傳統(tǒng)的血清學和免疫學方法相比，能夠快速檢測到組織中是否有病毒感染。但由于該方法需要特定的儀器設備和試劑，在基層難以推廣應用。

2.4.2 多重RT-PCR技術 多重RT-PCR技術是病毒鑒別診斷的重要技術手段，它可以將設計好的多對引物在一次反應中同時擴增，避免了逐一分離病毒的復雜程序。任玉鵬等建立起的能同時進行檢測豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬群輪狀病毒(GAR)的多重 RT-PCR鑒別檢測方法，均能很好的檢測出該三種病毒的陽性結果，同時豬薩佩羅病毒(PSV)、豬博卡病毒(PBoV)、豬環(huán)曲病毒(PToV)、金黃色葡萄球菌(SA)豬鏈球菌2型(SS2)、豬源大腸桿菌(E. coli)、豬源沙門氏菌(S.choleraesuis)、空腸彎曲桿菌(Cje)檢測結果均為陰性，證明該法具有較強的靈敏性和特異性。王睿敏等對豬流行性腹瀉病毒 (PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV) 、豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬輪狀病毒 (PRoV)建立了多重 RT-PCR檢測方法，并且用該方法對2017年至2018年從廣西各地采集的270份腹瀉樣本進行了檢測，結果都驗證了該方法可行有效，對豬病毒性疾病的流行病學調查意義重大，應用前景廣闊。

劉海源等針對建立PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設計了特異性引物，建立了PEDV-TGEV-RV的多重PCR方法，PEDV、TGEV和RV的保守基因M、N和VP7分別設計了特異性引物，分別擴增出預期的311 bp、763 bp和516 bp的目的片段，成功建立同時檢測豬三種常見病毒感染的多重PCR方法。通過敏感性和特異性的試驗，發(fā)現本方法對PEDV、TGEV、RV的最高敏感度分別為30 pg，TGEV的最高敏感度為18 pg，RV的最高敏感度為42 pg，并通過對其他常見幾種病原進行PCR擴增，發(fā)現本方法特異性良好，可以應用于臨床樣品檢測。利用該檢測方法對2015年到2016年來自山東省濟南、泰安、萊蕪等發(fā)病豬場的并對412份臨床病料進行檢測，結果表明PEDV、TGEV和RV的陽性率分別為22.3%、7.28%和1.46%，PEDV與TGEV、PEDV與RV、TGEV與RV雙重混合感染陽性率分別為5.34%、1.94%和2.91%，PEDV、TEGV和RV三重感染陽性率為4.85%。Kerlei C. Médici等采用RT-PCR方法檢測A組輪狀病毒，采用一致引物擴增VP4基因的876 bp (P型)和VP7基因的1062 bp (G型)， 利用輪狀病毒B12組8號基因(NSP2)的434 bp擴增產物和輪狀病毒C組5號基因(VP6)的270 bp擴增產物的半巢式PCR方法鑒定了非典型輪狀病毒。

2.4.3 實時熒光定量RT-PCR 技術 實時熒光定量PCR技術(Real-Time Quantitative PCR)。它是將RT-PCR技術與光譜技術相結合的一種核酸定量檢測技術。具有敏感性高、特異性強、重復性好、全封閉反應、定量準確等特點。與常規(guī)RT-PCR相比，實時熒光定量RT-PCR克服了假陽性和污染環(huán)境問題。陳小飛等根據GenBank中近些年來豬輪狀病毒A群 VP6的序列分析，選取保守區(qū)域設計引物，成功構建立了TB Green熒光定量PCR 檢測方法。對陽性標準質粒的檢測下限為106拷貝/μL，敏感性是普通RT-PCR的3.54倍，在這個方法的應用過程中采集了91份臨床病料來檢測，結果發(fā)現40份病料呈陽性。對豬呼腸孤病毒(MRV)、豬瘟病毒(HC)、巴氏桿菌(PM)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬捷申病毒(PTV)、鏈球菌(SS)以及豬等孢球蟲(I.suis)檢測均為陰性。陳如敬等根據豬輪狀病毒的 VP6 基因特征設計具有特異性的引物和探針，經過優(yōu)化反應條件，建立了一種檢測豬輪狀病毒的 TaqMan 實時熒光定量RT-PCR 方法，最低可檢測 192拷貝/μL。對該方法的應用中采集了79份病料，檢測結果發(fā)現了6份樣品是陽性，說明了該方法特異性強，靈敏性高。但由于該方法對操作人員專業(yè)技術水平的要求較高，并需要一定的儀器設備，在一般實驗室難以普及應用。Elizabeth C.M. Marconi等〗以RV的NSP5基因的一段保守序列為靶向基因建立了SYBR-Green實時聚合酶鏈式反應(PCR)。 A組輪狀病毒(RVA)是人類和幾種動物腹瀉的最常見原因之一。運用該方法與采用SYBR-Green實時聚合酶鏈反應(Real-Time polymerase chain reaction, PCR)，以牛nadh - desrogenase - 5 mRNA為外源內參，靶向擴增非結構蛋白5 (non - structural protein 5, NSP5)基因的137 bp片段，對常規(guī)PCR對 65份豬糞便標本中的RVA進行診斷。 65份樣本進行了檢測(25份常規(guī)PCR和基因測序檢測呈陽性)。 總體一致性(kappa)為0.843，表明各項試驗的一致性“非常好”，相對靈敏度為100% (25+Real Time PCR/25+ Conventional PCR)，相對靈敏度為87.5% (35- Real Time PCR/40- Conventional PCR)。分析結果表明，該方法具有較高的重復性(變異系數≤1.42%)。因此，該方法是一種快速、靈敏的豬RVA診斷方法。

2.4.4 逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP) RT-LAMP近些年來被廣泛應用于動物疫病病原基因檢測，它也是一種快速等溫核酸擴增技術，與RT-PCR法相比，RT-LAMP法省去了RT-PCR法中的預變性、變性、退火步驟即可循環(huán)擴增，反應產物判定不需要電泳，肉眼就能夠判定。該方法極大地縮短了檢測時間，結果可自動判讀，臨床實用性高，應用前景更加廣闊。據文獻報告，其最低可檢出10基因拷貝。胡興義等就已經利用此方法建立起了豬輪狀病毒逆轉錄環(huán)介導等溫核酸擴增(RT-LAMP)技術，結果對203份豬腹瀉樣本檢測，檢出陽性樣本16份，靈敏度能達到1.0×102拷貝/μL。該方法在恒溫條件下進行，無需特殊儀器，適合應用于基層養(yǎng)殖場。

3 PoRV 防控

目前防控 PoRV的疫苗主要有減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等。中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所馮力等人研制成功TGE-PED-RV三聯活疫苗，防治豬病毒性腹瀉病方面發(fā)揮了重要作用。史月明等研制成功的油乳劑滅活疫苗 , 免疫仔豬可以刺激機體產生免疫應答和保護性抗體。Oneal 等 將 RV 的核酸亞單位片段VP2/6- VLPs、VP2/4/6-VLPs 與霍亂毒素混合研制出亞單位疫苗，免疫動物后可使受試動物得到良好保護。目前國內學者利用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了多種形式的 VLPs(6/7-VLPs、2/6/7-VLPs、2/4/6/7- VLPs)，發(fā)現這些 VLPs 都具有較好的免疫保護效果。使我國豬病毒性腹瀉病得到精準防控，極大的減少了經濟損失。針對 PoRV 目前還沒有特異性治療藥物，主要采取疫苗預防，藥物治療，做好消毒，注意保暖，營養(yǎng)均衡等措施達到防控的目標。

4 結語

對于豬輪狀病毒病，僅僅依據臨床癥狀和剖檢變化來作出判斷是具有一定局限性的，只有結合實驗室診斷才能最終確診該病的發(fā)生，但各種實驗方法又不能完全滿足檢測的實際需要。例如，電鏡觀察診斷操作簡便，直觀高效，但由于實驗儀器電鏡價格昂貴，無法在基層單位推廣使用；免疫學方法能夠檢測豬輪狀病毒感染、發(fā)生、發(fā)展的過程，但由于抗體只在感染至特定時期才出現，所以ELISA等抗體檢測方法具有一定局限性；實時熒光定量PCR、RT-LAMP、RT-PCR、多重RT-PCR等分子生物學技術在豬感染豬輪狀病毒早期就可以檢測到病毒核酸，對于豬輪狀病毒早期檢測具有重要作用，但對操作技術要求相對較高。國內外關于豬輪狀病毒病的研究雖然起步較晚，卻引起了學者的廣泛關注，并取得了許多豬輪狀病毒病診斷技術方面的成果。由于各種診斷方法均有優(yōu)缺點，因此要根據診斷的目的和要求，并結合實際條件選擇合適的診斷方法。目前市場上已有多家公司根據不同的診斷技術提供了多種豬輪狀病毒病的檢測試劑盒，為該病的快速診斷提供了有力保障。為了實現診斷方法的便捷性和診斷試劑的商品化，應將各種診斷方法有機地結合起來，取長補短，從而達到最佳的檢測效果，實現對豬輪狀病毒感染及時、快速檢測。相信將來隨著分子生物學方法和免疫學技術的不斷發(fā)展，豬輪狀病毒病的診斷技術會愈加高效、便捷。同時，對豬輪狀病毒病采取綜合防控措施，能大大減輕該病的發(fā)生，促進養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展。