何純剛， 黃沁園， 鐘世彪， 陳利生， 肖和衛(wèi)， 李 雷

結(jié)直腸腺瘤性息肉(colorectal adenomatous polyps,CAP)是結(jié)直腸癌的癌前病變,其癌變過程涉及多基因、多階段的變化。研究結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展及癌變機(jī)制具有重要意義。研究表明DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要的作用，然而基因甲基化在結(jié)直腸腺瘤中的作用機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期研究采用全基因組甲基化芯片分析了結(jié)直腸腺瘤低甲基化譜，并篩選出低甲基化標(biāo)志物，但尚未對基因啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化基因狀況進(jìn)一步闡述。鑒此，本研究旨在對結(jié)直腸腺瘤基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化標(biāo)志物進(jìn)行篩選，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及早期診斷提供依據(jù)。

1 對象與方法

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研究對象 選擇2013年1月至2014年12月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院及廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的進(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤患者9例(腺瘤組)，男4例，女5例，中位年齡53歲；病變部位為結(jié)腸7例，直腸2例；病理類型：絨毛狀腺瘤2例，管狀絨毛狀腺瘤3例，管狀腺瘤4例，術(shù)后病理證實(shí)均無癌變。另選擇經(jīng)腸鏡排除炎癥性腸疾病、癌前病變及癌的患者20例作為對照組，男9例，女11例，中位年齡60歲。所有研究對象知情同意參與，研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(科研國自-2013-017號)。

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DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化 腺瘤組于內(nèi)鏡下切除結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本(直徑≥2 cm)，對照組取結(jié)直腸黏膜標(biāo)本(結(jié)腸黏膜13例，直腸黏膜7例)。組織DNA的提取嚴(yán)格按照QIAamp DNA mini kit(Qiagen,Hidden,Germany)試劑盒說明書進(jìn)行。提取到的DNA質(zhì)量檢測、定量、DNA亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化按照Zymo EZ DNA Methylation kit試劑盒(Zymo Research,CA,USA)說明書進(jìn)行。

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450K甲基化芯片分析 所有經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA樣本均采用450K甲基化芯片(Illumina,San Diego,CA,USA)分析，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。每個(gè)樣本重復(fù)3次，芯片應(yīng)用Illumina HiScan SQ scanner(Illumina,San Diego,CA,USA)進(jìn)行掃描。具體操作由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司協(xié)作完成。

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數(shù)據(jù)分析

1.4.1 原始數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用genomestudio(genomestudio software 2011.1，Illumina)軟件進(jìn)行芯片原始數(shù)據(jù)的提取、質(zhì)量控制分析、校正。每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度用AVG_Beta值(數(shù)值為0～1)來表示，Δβ代表腺瘤組與對照組CpG位點(diǎn)的差異甲基化程度(數(shù)值為-1～1)。Δβ>0.17判定為高甲基化，Δβ<-0.17判定為低甲基化。Δβ絕對值越大，其差異甲基化程度越高。根據(jù)初步篩選結(jié)果，進(jìn)一步縮小篩選范圍，將Δβ值設(shè)為≥|0.4|進(jìn)行二次篩選。對篩選出來的低甲基化標(biāo)志物在基因組中的分布進(jìn)行描述性分析。

1.4.2 進(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤基因啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化譜分析 根據(jù)Δβ值初步篩選出啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化標(biāo)志物(包括TSS1500、TSS200、5′UTR及1st exons)。對篩選出來的標(biāo)志物分布情況進(jìn)行描述性分析。

1.4.3 基因啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化標(biāo)志物的功能分析應(yīng)用DAVID在線分析方法(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，對差異的啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)對應(yīng)的基因進(jìn)行GO分析及KEGG_Pathyway分析。GO包括三大功能注釋類別：生物過程、細(xì)胞成分、分子功能。通過KEGG_Pathyway分析差異甲基化標(biāo)志物可能參與的信號通路。通過GO分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中所包括的差異基因個(gè)數(shù)，并用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)GO條目中差異基因富集的顯著性。計(jì)算的結(jié)果會返回一個(gè)富集顯著性的

P

值，

P

<0.05表示差異基因在該GO條目中出現(xiàn)了富集。通過KEGG_Pathyway分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)信號通路條目中所包括的差異基因個(gè)數(shù)，并用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法計(jì)算每個(gè)信號通路條目中差異基因富集的顯著性，

P

<0.05提示差異基因在該信號通路中出現(xiàn)富集，可能參與了該信號通路的作用。根據(jù)GO分析及KEGG_Pathyway分析的結(jié)果結(jié)合生物學(xué)意義從而挑選用于后續(xù)研究的基因。

2 結(jié)果

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進(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化基因篩選結(jié)果 450K甲基化芯片共可檢測的甲基化位點(diǎn)為485 577個(gè)，根據(jù)Δβ值≥|0.17|，整個(gè)基因組中共發(fā)現(xiàn)65 535個(gè)(13.50%)差異甲基化標(biāo)志物。在基因啟動(dòng)子區(qū)(包括TSS1500、TSS200、5′UTR及1st exons)共發(fā)現(xiàn)22 160個(gè)(33.81%)差異甲基化標(biāo)志物，見圖1。啟動(dòng)子區(qū)高甲基化標(biāo)志物12 795個(gè)(57.74%)，低甲基化標(biāo)志物9 365個(gè)(42.26%)，高甲基化位點(diǎn)在TSS200、5′UTR及1st exons中均明顯高于低甲基化位點(diǎn)，見圖2。進(jìn)一步將Δβ值設(shè)為≥|0.4|，在基因啟動(dòng)子區(qū)共發(fā)現(xiàn)1 870個(gè)差異甲基化標(biāo)志物，分別為1 524個(gè)啟動(dòng)子高甲基化標(biāo)志物和346個(gè)啟動(dòng)子低甲基化標(biāo)志物，其中包含929個(gè)啟動(dòng)子差異甲基化基因。根據(jù)Δβ值進(jìn)行排名，其中腺瘤組啟動(dòng)子區(qū)差異(高/低)甲基化程度排名前20位的基因見表1。

圖1 結(jié)直腸腺瘤中差異甲基化標(biāo)志物在基因結(jié)構(gòu)中的分布圖

圖2 結(jié)直腸腺瘤中差異(高/低)甲基化標(biāo)志物在啟動(dòng)子中的比較圖

表1 啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化程度排名前20位基因

啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)基因啟動(dòng)子低甲基化相關(guān)基因LRRC4,NPY,DCLK1,CLIP4,PRKAR1B,ZNF542,FLI1,LOC389333,ITGA4,GATA5,KHDRBS2,FAM115A,CNRIP1,PTPRT,GAS1,CD34,MIR34B,BTG4,MIR34C,KCNIP4OR2M3,CHRM2,C7orf16,MACROD2,POLD3,HPVC1,LRRIQ4,TNR,OR56A1,TCN1,SVIL,ACMSD,SEC23B,SMAD3,C7orf66,SPAG4L,RBMXL2,KRT20,ANXA2,PIGB

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GO分析及KEGG_Pathyway分析結(jié)果 對929個(gè)啟動(dòng)子差異甲基化基因進(jìn)行GO分析及KEGG_Pathyway分析。GO分析結(jié)果顯示，在生物過程功能注釋類別中，差異甲基化基因主要富集前5位的條目有：化學(xué)性突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞命運(yùn)確定和細(xì)胞黏附。在分子功能注釋類別中，差異甲基化基因主要富集前5位的條目有：細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、HMG盒域綁定。在細(xì)胞成分功能注釋類別中，主要富集前5位的條目有：質(zhì)膜、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜的組成成分、突觸后膜、細(xì)胞連接。見表2。KEGG_Pathyway分析結(jié)果顯示，啟動(dòng)子差異甲基化基因主要參與了神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、尼古丁成癮、鈣信號通路、膽堿能突觸和ECM-受體相互作用等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。見表3。

表2 進(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤中啟動(dòng)子差異甲基化標(biāo)志物GO分析結(jié)果

注釋類別 注釋條目基因數(shù)目PFDR生物過程化學(xué)性突觸傳遞34<0.001<0.001神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育33<0.001<0.001細(xì)胞外基質(zhì)組織26<0.001<0.001細(xì)胞命運(yùn)確定12<0.001<0.001細(xì)胞黏附42<0.0010.016分子功能 細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分18<0.001<0.001RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控區(qū)序列特異性DNA結(jié)合31<0.001<0.001序列特異性DNA結(jié)合53<0.001<0.001轉(zhuǎn)錄因子活性77<0.001<0.001HMG盒域綁定8<0.001<0.001細(xì)胞成分 質(zhì)膜266<0.001<0.001蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)41<0.001<0.001質(zhì)膜的組成成分107<0.001<0.001突觸后膜31<0.001<0.001細(xì)胞連接47<0.001<0.001

表3 進(jìn)展期結(jié)直腸腺瘤中啟動(dòng)子差異甲基化基因KEGG_Pathyway分析結(jié)果

代謝通路條目基因數(shù)目PFDR神經(jīng)活性的配體-受體相互作用37<0.001<0.001尼古丁成癮12<0.001<0.001鈣信號通路22<0.0010.028膽堿能突觸15<0.0010.310ECM-受體相互作用13<0.0010.013

3 討論

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結(jié)直腸癌是全球第3大最常見的癌癥類型，也是癌癥相關(guān)死亡的第3大原因。近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病率已排在第3位，因此，做好結(jié)直腸癌的早期防治工作有重要意義。研究表明，“正常-腺瘤-癌-癌轉(zhuǎn)移”是散發(fā)性結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的主要路徑，至少有80%的結(jié)直腸癌由結(jié)直腸腺瘤演變而來。由于腺瘤發(fā)展為癌一般需要7～10年的時(shí)間，因此，患者有機(jī)會發(fā)現(xiàn)和切除晚期腺瘤或早期結(jié)直腸癌，而識別與腺瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的新基因可能有助于更好地理解癌變途徑，從而改進(jìn)結(jié)直腸癌的篩查和預(yù)防工作。

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DNA甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要的作用。啟動(dòng)子甲基化是腫瘤抑制基因表觀遺傳學(xué)改變最常見的類型之一，在某些情況下，它是腫瘤抑制基因失活的機(jī)制。啟動(dòng)子高甲基化可以影響多種細(xì)胞通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。DNA異常甲基化(包括高甲基化及低甲基化狀態(tài))在結(jié)直腸腺瘤及癌中廣泛存在，許多異常甲基化基因被發(fā)現(xiàn)，提示基因表觀遺傳的改變作為頻發(fā)的早期事件可能影響了結(jié)直腸腺瘤向癌轉(zhuǎn)變，同時(shí)也可能成為早期診斷的標(biāo)志物。CpG島甲基化(CpG island hypermethylation,CIMP)目前被認(rèn)為是鋸齒狀通路的主要發(fā)生機(jī)制，約15%的散發(fā)性結(jié)直腸癌由此途徑進(jìn)展而來。

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近年來發(fā)展的甲基化芯片研究技術(shù)在甲基化檢測過程中已經(jīng)體現(xiàn)出了高通量檢測的優(yōu)越性，基于各種原理設(shè)計(jì)的芯片為實(shí)現(xiàn)從整個(gè)基因組到多個(gè)已知特異性基因或甲基化位點(diǎn)的定性、定量檢測奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用芯片技術(shù)這個(gè)高通量手段檢測基因組的甲基化，大大提升了研究效率，為揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、診斷、預(yù)防和治療提供了有效工具。目前，基因甲基化芯片已廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的研究。采用全新的基因組甲基化檢測方法，有利于全面分析結(jié)直腸腺瘤甲基化譜，更進(jìn)一步揭示其在結(jié)直腸腺瘤及癌變過程的作用機(jī)制，同時(shí)新發(fā)現(xiàn)的甲基化標(biāo)志物具有用于腺瘤及結(jié)直腸癌早期診斷的潛力。在本課題組的前期研究中，我們應(yīng)用450K甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)對結(jié)直腸腺瘤低甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析，共篩選出18個(gè)低甲基化基因標(biāo)志物，這些低甲基化標(biāo)志物主要位于基因間隔區(qū)，但在結(jié)直腸腺瘤啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)尚未闡明，故本研究就此進(jìn)行了補(bǔ)充。

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抑癌基因啟動(dòng)子異常甲基化是最重要的甲基化事件之一，往往導(dǎo)致抑癌基因的沉默，在癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究通過芯片數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)的分析方法，重點(diǎn)研究了基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，在基因啟動(dòng)子區(qū)共發(fā)現(xiàn)1 870個(gè)差異甲基化標(biāo)志物，其中1 524個(gè)為高甲基化標(biāo)志物，346個(gè)為低甲基化標(biāo)志物，其中包含929個(gè)啟動(dòng)子差異甲基化基因。在前20位啟動(dòng)子高甲基化基因中有15個(gè)基因有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其中10個(gè)基因在腸癌中檢測發(fā)現(xiàn)，另5個(gè)基因在腺瘤中檢測發(fā)現(xiàn)。在前20位啟動(dòng)子低甲基化基因中有7個(gè)基因有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其中有5個(gè)基因在腸癌中檢測發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)基因在腺瘤中檢測發(fā)現(xiàn)。提示在結(jié)直腸腺瘤整個(gè)基因組中，啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)較低甲基化狀態(tài)更多見，同時(shí)也提示腺瘤中基因啟動(dòng)子高甲基化可能是導(dǎo)致該基因失活的關(guān)鍵，并參與了“腺瘤-癌”的早期轉(zhuǎn)變過程。本研究對929個(gè)基因進(jìn)行了GO、KEGG_Pathyway分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異甲基化基因涵蓋了許多不同的功能群落。GO分析結(jié)果顯示，啟動(dòng)子差異甲基化基因主要在化學(xué)性突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、質(zhì)膜、蛋白質(zhì)類細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜的組成成分等注釋條目中出現(xiàn)富集。KEGG_Pathyway分析結(jié)果顯示，啟動(dòng)子差異甲基化基因主要參與了神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、尼古丁成癮、鈣信號通路、膽堿能突觸、ECM-受體相互作用等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。表明在進(jìn)展期腺瘤的發(fā)展過程，是多種類型基因參與，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共同調(diào)控的，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，通過甲基化芯片分析及生物信息學(xué)分析方法發(fā)現(xiàn)，大量基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在結(jié)直腸腺瘤中發(fā)生了改變，其可能參與了結(jié)直腸腺瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，為進(jìn)一步探討結(jié)直腸腺瘤發(fā)病機(jī)制及早期診斷提供新的思路和線索。