徐 超，劉 敏，張紅巖，湯茶琴，王潤賢*

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇句容 212400；2.句容市自然資源和規(guī)劃局，江蘇句容 212400）

茶樹是一種具有較強耐酸耐鋁毒性，廣泛種植于熱帶亞熱帶酸性土壤中的植物。土壤是茶園生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物與土壤的化學性質(zhì)、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、循環(huán)利用及污染物的降解等息息相關，對茶樹的生長有著重要影響[1]。茶樹和土壤構(gòu)成一個獨特的生態(tài)系統(tǒng)，土壤肥沃、土質(zhì)深厚、栽培管理技術(shù)科學合理的茶園中土壤微生物較多[2-3]。茶樹輪斑病是由茶擬盤多毛孢菌侵染引起的一種茶樹病害。近年來，茶樹輪斑病的發(fā)病情況呈上升趨勢，已成為限制各地茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。為篩選出對茶樹輪斑病有顯著防治效果的微生物資源，實現(xiàn)茶園常見病害的有效生物防治，本文對江蘇省不同地區(qū)茶園土壤中的微生物進行分離和純化，并分析茶園土壤中的微生物對茶樹輪斑病的防治效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）土壤樣品。2019 年11 月在江蘇省不同地區(qū)的茶園中采用五點取樣法，取每個采樣點10 cm 以下的土壤約100 g 作為研究對象，裝入自封塑料袋中密封，置于冰盒中帶回實驗室并進行低溫保存，備用[4]。2）茶樹輪斑病病原菌，由無錫市茶葉研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤混懸液制備

稱取10 g 土樣加入裝有90 mL 無菌水的三角瓶中振蕩20 min 左右，使土樣和水混合均勻，得到10-1稀釋液；用無菌吸管吸取土壤混懸液1 mL 加入裝有9 mL 無菌水的試管中，適當振蕩使土壤混懸液混合均勻，得到10-2稀釋液；用無菌吸管吸取10-2稀釋液1 mL 加入裝有9 mL 的無菌試管中得到 10-3稀釋液[5]。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

采用200 g 土豆、20 g 葡萄糖、20 g 瓊脂、1 000 mL水配制PDA 培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.3 微生物的分離與純化

在無菌平板上分別標注10-1、10-2、10-3，每個濃度重復3 次。用無菌吸管嚴格按照無菌操作的要求吸取10-3稀釋液1 mL 于對應標注的平板中，同樣的方法吸取10-2稀釋液、10-1稀釋液。再用已滅菌過的玻璃棒將菌液均勻涂抹在平板上，每種稀釋液要單獨使用1 個玻璃棒。將接好的平板放入25 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，并觀察記錄，獲得初分離菌落[5]。用接種環(huán)或接種針于初分離菌落的表面挑取少量菌落，并劃線接種到新的平板上人工培養(yǎng)3～5 d 后，再次挑取少量菌落并轉(zhuǎn)接。按同種的方法重復操作，直至獲得各種微生物的純培養(yǎng)。將獲得純培養(yǎng)的微生物于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 生防菌室內(nèi)拮抗效果測定

將分離純化的微生物與茶樹輪斑病病原菌分別接種在同一個平板的兩側(cè)，放入培養(yǎng)箱（數(shù)顯隔水式303As-3）內(nèi)培養(yǎng)7 d 左右。通過平板對峙實驗，根據(jù)拮抗效果，分析判斷目的微生物的室內(nèi)抗病性。根據(jù)拮抗帶的有無或病原菌的生長狀況，將平板對峙實驗中拮抗效果較顯著的微生物作為備選菌株，制備成液體菌劑并保存，用于茶樹輪斑病的田間防治試驗，將拮抗效果欠佳的菌株直接淘汰。

1.2.5 生防菌田間防治效果測定

在茶樹輪斑病的高發(fā)季節(jié)（7 月），將拮抗效果較顯著的備選菌株制成微生物菌劑，于低溫條件下進行破碎處理，并按1∶14 的比例加水稀釋（每667 m2茶園液體菌劑使用量為1 kg，加水量為14 kg），于傍晚均勻噴施于茶行蓬面。以噴施等量清水（15 kg/667 m2）的茶園作為對照處理。每種處理的茶園面積均為667 m2，設3 組重復。在施用菌劑后的第5 d、10 d、15 d、20 d 分別統(tǒng)計各處理茶園的發(fā)病程度，在每個試驗重復組內(nèi)，隨機選取500 個葉片，按照公式（1）和公式（2）計算分析茶樹輪斑病的感病率、感病指數(shù)。

病株病情的分級標準主要是根據(jù)葉片正反兩面出現(xiàn)病斑的數(shù)量及直徑，初定分級標準為6 級。1）0 級正常。2）Ⅰ級正反兩面有少量病斑。3）Ⅱ級正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積1/4 以下。4）Ⅲ級正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積的1/4～1/2。5）Ⅳ級正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積1/2～3/4。6）Ⅳ級正反兩面有病斑，發(fā)病面積占葉片總面積3/4 以上。

1.2.6 微生物鑒定

對生防效果較好的微生物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，并結(jié)合形態(tài)特征進行微生物鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶園土壤中微生物的差異

如表1 所示，供試茶園土壤中共分離出 64 株細菌、34 種真菌。其中，8-3 樣地中的微生物數(shù)量最多，細菌占70.1%；7-5 樣地中的微生物數(shù)量最少，細菌占83.3%。多數(shù)茶園分離出的微生物數(shù)量在7～10 種，除8-3 樣地外，其余樣地間的微生物數(shù)量差異較小。

表1 不同茶園土壤微生物種類

2.2 茶園土壤微生物的室內(nèi)拮抗效果

根據(jù)室內(nèi)拮抗實驗中拮抗帶的有無或病原菌的生長狀況，初步確立有效生防菌，并進行后續(xù)研究。如圖1 所示，對茶樹輪斑病拮抗作用較強的細菌有3 種，分別為1 號菌株、2 號菌株、3 號菌株，拮抗菌株和病原菌之間分界線較明顯。其中，1 號菌株對病原菌的拮抗效果最好，3 號菌株拮抗效果次之；2 號菌株拮抗效果稍差。對茶樹輪斑病拮抗作用較強的真菌有3 種，分別為4 號菌株、5 號菌株、6 號菌株，病原菌的生長均受到抑制；其中，5 號菌株對病原菌的拮抗效果較好，4 號菌株拮抗效果次之，6 號菌株拮抗效果稍差。

圖1 土壤微生物對茶園輪斑病的室內(nèi)拮抗效果

2.3 茶園土壤微生物的田間防治效果

根據(jù)茶園土壤微生物室內(nèi)拮抗實驗結(jié)果，將平板對峙實驗效果較好的6 種菌株作為備選菌株進行田間防治試驗，以進一步驗證其對茶樹輪斑病的田間防治效果。如圖2 所示，在3 株供試細菌中，1 號菌株效果最好，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為35%和12.0，且感病率和感病指數(shù)的變化趨勢較小；2 號菌株效果次之，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為48%和16.4；3 號菌株效果最差，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為65%和20.4。在3 種供試真菌中，5 號真菌效果最好，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為40%和13.0，且其感病率和感病指數(shù)的變化趨勢較??；4 號真菌效果次之，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為55%和16.4；6 號真菌效果最差，在第20 d 時感病率和感病指數(shù)分別為60%和19.2。

圖2 土壤微生物對茶園輪斑病的田間防治效果

2.4 茶園有效土壤微生物的鑒定

2.4.1 形態(tài)特征

對篩選的微生物進行形態(tài)學觀察，并對其形態(tài)特征進行描述（見表2）。

表2 微生物形態(tài)觀察

2.4.2 分子鑒定

1）生防真菌的分子鑒定。對防治效果較好的5 號真菌進行分子鑒定，ITS 區(qū)全序列擴增并進行測序。經(jīng)比對，該序列與木霉菌序列相似度為100%。結(jié)合5號真菌的形態(tài)學特征，菌落生長迅速，呈不定型棉絮狀或致密叢束狀（見圖3），表面顏色為綠色，確定該真菌為綠色木霉（Trichoderma virens）。

圖3 木霉菌

2）生防細菌的分子鑒定。對拮抗效果較好的1號細菌菌株進行分子鑒定。ITS 區(qū)全序列擴增并進行測序。經(jīng)比對，該序列與伯克霍爾德氏菌序列相似度為100%。結(jié)合形態(tài)學特征，該菌株在PDA 平板上培養(yǎng)，菌落呈淡黃色，菌落隆起，邊緣整齊（見圖4），革蘭氏染色呈陰性，認為該細菌為伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacial）。

圖4 伯克霍爾德氏菌

3 結(jié)論與討論

細菌是生物圈中數(shù)量最多、分布非常廣泛的微生物，占土壤微生物總量的70%～90%[5-6]。有研究表明，1 g 茶園干土中的土壤微生物總數(shù)超1 000 萬個，最多可達5 800 萬個，數(shù)量顯著多于稻田、林地、旱地土壤，說明茶園土壤更適合微生物生長[7]。當前大量研究集中于土壤微生物，但有關茶園土壤有益微生物的研究相對較少。本文通過對江蘇省不同地區(qū)茶園土壤中的微生物進行分離和純化，分析茶園土壤微生物對茶樹輪斑病的防治效果，篩選對茶樹輪斑病生防效果顯著的有益微生物。

試驗結(jié)果表明，土壤肥沃、土質(zhì)疏松、管理水平較高的地區(qū)微生物數(shù)量較多。8-3 樣地周圍栽培了大量的樹木，且土壤表面有機質(zhì)豐富，茶園整體環(huán)境條件較好，適宜土壤微生物的生長繁殖；而7-5 樣地此前是荒地，多年無人管理，經(jīng)開發(fā)后成為茶園，因此該茶園中的微生物數(shù)量最少。不同地區(qū)的茶園由于地理條件、氣候條件、土壤肥力等自然因素及人工栽培管理措施的影響，土壤微生物的種類及數(shù)量會有顯著差異。

有研究表明，木霉菌劑通過產(chǎn)生抗生素、營養(yǎng)競爭、微寄生、細胞壁分解酵素及誘導植物產(chǎn)生抗性等機制，對多種植物病原菌具有拮抗作用，具有保護和治療雙重功效，可有效防治土傳性真菌病害，在苗床使用木霉菌劑，可提高育苗與移植成活率，也可用于防治灰霉病[8]。本次試驗篩選出的5 號真菌綠色木霉對茶樹輪斑病的室內(nèi)拮抗效果、田間防治效果均較好。伯克霍爾德氏菌是一個復合群體，其中一些菌種具有生物防治、促進植物生長、生物修復等功能[9]。本研究分離的1 號菌株伯克霍爾德氏菌對茶樹輪斑病的室內(nèi)拮抗效果、田間防治效果最好，顯著優(yōu)于其他菌株。近年來，化肥與農(nóng)藥的過度使用導致茶園土壤板結(jié)、土質(zhì)變差等問題，對茶葉的生產(chǎn)及茶葉質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。茶園有益微生物能有效促進茶樹生長、改良土壤微環(huán)境、控制病害發(fā)生等。因此，可將本研究獲得的綠色木霉和伯克霍爾德氏菌作為優(yōu)良的微生物資源，制成微生物菌劑，用于茶樹輪斑病的生物防治。