夏亞男，雙 全*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

棗酒作為一種獨(dú)具特色的水果酒，是以紅棗為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵釀造而成。早在西周時期，為了保存紅棗，人們就想出了一種利用紅棗發(fā)酵釀造棗酒的辦法。棗酒不僅風(fēng)味獨(dú)特、棗香濃郁，而且酒性柔和、營養(yǎng)豐富。紅棗中所含的蘆丁、多糖和其他對人體健康有益的物質(zhì)在發(fā)酵過程中被轉(zhuǎn)化和水解，從而大大提高了其溶解度和吸收率，營養(yǎng)價值也相應(yīng)提高[1-2]。但棗酒的生產(chǎn)主要是基于小作坊模式，未形成標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)工藝及商業(yè)化發(fā)酵劑，加之產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定性，限制了棗酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也影響了紅棗資源的加工利用和資源優(yōu)勢的轉(zhuǎn)化[3-4]。因此，加深對棗酒發(fā)酵的科學(xué)研究，能夠為棗酒產(chǎn)區(qū)充分發(fā)揮資源優(yōu)勢，逐漸形成紅棗區(qū)域性特色支柱產(chǎn)業(yè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

固態(tài)發(fā)酵方式是我國白酒的一種獨(dú)特發(fā)酵模式，它比液態(tài)發(fā)酵會形成更加豐富的微生物菌系，從而引起更加復(fù)雜的微生物代謝活動，所形成的代謝產(chǎn)物，如風(fēng)味也會比液態(tài)發(fā)酵更加濃郁、醇厚[5-6]。而相關(guān)研究也主要集中在白酒酒曲、酒醅及窖泥的成分及微生物菌群結(jié)構(gòu)研究[7-9]，如胡曉龍等[10]采用高通量測序技術(shù)在中溫大曲中檢測到了28個屬，其中腸桿菌屬、乳桿菌屬為大曲樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬。截至目前，缺少對水果類原料固態(tài)發(fā)酵酒酒醅的相關(guān)研究，無法為固態(tài)發(fā)酵紅棗蒸餾酒的生產(chǎn)及工藝優(yōu)化提供指導(dǎo)，而且對白酒酒曲、窖泥等的微生物菌群結(jié)構(gòu)研究大多采用的是16S rRNA高通量測序技術(shù)，只能確定到微生物的屬分類水平，不能確定具體的菌種種類，從而無法明確地為特定菌株篩選、風(fēng)味形成及功能特性研究提供指導(dǎo)。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宏基因組技術(shù)開始逐漸應(yīng)用于食品微生物的研究中。宏基因組學(xué)是一種基于基因序列分析環(huán)境樣品中微生物信息的研究方法[11-12]。它可以快速、準(zhǔn)確地獲取大量的生物學(xué)數(shù)據(jù)和豐富的微生物信息，已成為研究微生物多樣性和群落特征的重要手段。相比于16S rRNA高通量測序技術(shù)，宏基因組技術(shù)不僅可以全面地挖掘出微生物基因組信息，而且能夠進(jìn)行功能及代謝通路的分析，基于這些信息，更便于挖掘菌群的生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、功能特性、相互關(guān)系[13-15]。因此，本實(shí)驗基于宏基因組技術(shù)考察固態(tài)發(fā)酵棗酒酒醅的微生物菌群多樣性，分析其主要代謝通路，并挖掘與風(fēng)味形成相關(guān)的關(guān)鍵功能基因，以期為我國棗酒的品質(zhì)提升及風(fēng)味功能基因的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒醅取自河北省阜平縣董家棗酒廠。原料棗為河北滄州小棗。酒醅制取：取去核紅棗，按棗∶水=1∶1比例浸泡、粉碎后，按1%接種酒曲，在自然窖池中26～28 ℃發(fā)酵14 d，獲得固態(tài)發(fā)酵棗酒酒醅，-80 ℃冷凍，用于后續(xù)實(shí)驗。

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 美國Omega Biotek公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuPolymerase 北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit美國Axygen公司。

NanoDrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；5424R高速臺式冷凍離心機(jī) 美國Eppendorf公司；MiSeq PE300測序儀 美國Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 酒醅樣品DNA抽提

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒用于提取樣品微生物的宏基因組DNA。基因組DNA的提取完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。

1.2.2 宏基因組檢測

構(gòu)造PE庫：連接“Y”形接頭；使用磁珠去除接頭自身連接的片段；使用PCR擴(kuò)增以豐富文庫模板；使氫氧化鈉變性以生成單鏈DNA片段。

橋式PCR：DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)并固定在芯片上；另一端與附近的另一個引物隨機(jī)互補(bǔ)，并且也固定并形成“橋”。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線性化為單鏈。

Illumina HiSeq測序：添加帶有4 種熒光標(biāo)記的修飾的dNTP和DNA聚合酶，每個循環(huán)僅合成一個堿基；用激光掃描反應(yīng)板的表面，讀取每個模板序列第一輪反應(yīng)聚合的核苷酸種類；化學(xué)切割“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”，恢復(fù)3’末端黏性，并繼續(xù)聚合第2個核苷酸；計算每一輪收集的熒光信號的結(jié)果，并獲得模板DNA的序列。

1.2.3 生物信息分析

序列拼接組裝：使用Megahit拼接軟件對clean序列進(jìn)行拼接組裝，根據(jù)不同的kmer大小進(jìn)行組裝，從中選擇最優(yōu)組裝結(jié)果。

基因預(yù)測：使用MetaGeneMark（http://topaz.gatech.edu/GeneMark/meta_gmhmmp.cgi）對拼接結(jié)果中的contig進(jìn)行基因預(yù)測，并將其翻譯為氨基酸序列。

非冗余基因集的構(gòu)建：將所有樣品預(yù)測出的基因序列，用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類，構(gòu)建非冗余基因集。將樣品所有的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進(jìn)行比對，統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣品中的豐度信息，從而構(gòu)建geneprofile。比對軟件：BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）。

宏基因組物種注釋及豐度分析：通過Kraken軟件對測序樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，獲得物種分類及豐度信息。

直系同源群集（Cluster of Orthologous Group，COG）功能注釋：通過與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTp比對，可以獲得基因所對應(yīng)的COG注釋，即得出基因?qū)?yīng)的COG數(shù)，并根據(jù)COG數(shù)進(jìn)行功能歸類。

京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋：運(yùn)用FMAP軟件對獲得基因進(jìn)行KEGG注釋和差異Module分析。

碳水化合物活性酶注釋：通過將基因序列與CAZy（Carbohydrate-Active Enzymes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可以獲得碳水化合物酶類的物種來源、酶功能EC分類、基因序列、蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)等信息。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅微生物多樣性分析

棗酒酒醅樣品中基因組全長128 785 299 bp，包含356 189 條序列，G+C含量為43.46%。對棗酒酒醅基因進(jìn)行物種豐度注釋，共鑒定出微生物37個門、1 247個屬、3 937個種，其中相對含量大于1%的優(yōu)勢菌群在門、屬、種水平的數(shù)量分別為4、5、10 種（圖1）。

圖1 棗酒酒醅樣品微生物群落Circos圖Fig. 1 Circos diagram of microbial community in fermented jujube mash

在微生物門水平上，優(yōu)勢菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、廣古菌門（Euryararchaeota）。其中厚壁菌門（84.60%）為絕對優(yōu)勢菌門，存在較高的相對豐度。這與嚴(yán)超[16]研究的紅棗白蘭地酒醅中優(yōu)勢細(xì)菌門類似。在屬水平上，優(yōu)勢菌屬包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、明串珠菌屬（Leuconos）、片球菌屬（Pediococcus）和鏈霉菌屬（Streptomyces）。其中乳桿菌屬（53.24%）和芽孢桿菌屬（20.51%）含量最高。此結(jié)果與袁帥[17]研究的茅臺酒醅和國臺酒醅中優(yōu)勢菌群相似，其中乳酸菌屬都是優(yōu)勢菌群。

在種分類水平上，相對含量大于1%的優(yōu)勢菌種有10 個，包括布氏乳桿菌（L. buchneri）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、植物乳桿菌（L. plantarum）、類布氏乳桿菌（L. parabuchneri）、副干酪乳桿（L. paracasei）、嗜酸乳桿菌（L. acidipiscis）、短乳桿菌（L. brevis）、耐酸乳桿菌（L. acetotolerans）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、香腸乳桿菌（L. farciminis），相對含量分別為24%、24%、6%、3%、3%、3%、2%、2%、2%、1%。排名前10的菌種中9種屬于乳酸菌，其中8 種是乳桿菌，可見乳桿菌是固態(tài)發(fā)酵棗酒酒醅的絕對優(yōu)勢菌種。

L. buchneri是一種異型發(fā)酵的乳酸菌，在發(fā)酵過程中能將乳酸分解成乙酸和丙二醇，而乙酸等揮發(fā)性脂肪酸是比較有效的抗真菌及霉菌的酸類物質(zhì)，能夠適當(dāng)抑制雜菌的生長，維持發(fā)酵菌的正常生長、代謝等活動[18]。蠟樣芽孢桿菌主要存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處，可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的營養(yǎng)成分，改善生態(tài)環(huán)境，也會因食品貯藏不當(dāng)而導(dǎo)致輕微食物中毒狀況。酒醅中蠟樣芽孢桿菌的存在與窖池泥土的自然發(fā)酵環(huán)境有關(guān)。而固態(tài)發(fā)酵環(huán)境普遍比液態(tài)發(fā)酵模式具備更豐富的微生物菌系，能釀造出更加濃郁的風(fēng)味。如蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶、磷脂酶等的能力較強(qiáng)，有助于風(fēng)味物質(zhì)等代謝產(chǎn)物的生成[19-20]。酒醅中盡管存在少量有害菌，但后期采用蒸醅取酒，獲得酒醅的蒸餾液，并不直接食用酒醅，所以并未引起相應(yīng)安全問題。母應(yīng)春等[21]發(fā)現(xiàn)酒曲中的細(xì)菌優(yōu)勢菌門為變形菌門，優(yōu)勢細(xì)菌屬為紅球菌屬；左乾程等[22]發(fā)現(xiàn)清醬香型白酒酒醅發(fā)酵過程中核心細(xì)菌屬為Lactobacillus、Bacillus、Weissella、Acetobacter等，隨發(fā)酵進(jìn)行，Lactobacillus逐漸成為主導(dǎo)。目前鮮見采用宏基因組技術(shù)檢測棗酒酒醅微生物多樣性的報道，以往研究只確定到酒醅的屬水平，該結(jié)果對微生物種水平的確定豐富了棗酒微生物多樣性的具體類別信息。

棗酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)與酒醅中微生物的生長和代謝密切相關(guān)。這些微生物催化原料不斷進(jìn)行一系列復(fù)雜的反應(yīng)，可以分解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)，形成糖和氨基酸，從而引發(fā)美拉德反應(yīng)，生成棗酒獨(dú)特的風(fēng)味前體物質(zhì)；能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分解為小分子肽，并形成重要的香氣成分，例如醛、醇、酯、酮等，進(jìn)而形成棗酒清爽醇厚的風(fēng)格特征[23-25]。酒醅在酒類生產(chǎn)中扮演了極其重要的角色，其中所含微生物的數(shù)量和種類決定了成品酒的優(yōu)劣。

2.2 常用數(shù)據(jù)庫注釋分析

2.2.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋分析

將基因翻譯獲得的蛋白質(zhì)序列與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，可獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)功能注釋信息（圖2），酒醅樣品中共鑒定到了6 269 個COG功能單元，這些功能單元分屬于23個主要的功能大類，其中相對含量在前8 位的功能大類是氨基酸運(yùn)輸代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，轉(zhuǎn)錄，復(fù)制、重組與修飾，無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換，細(xì)胞壁/膜/被膜生物起源，基因數(shù)分別為746、702、660、520、449、395、388、384個。除微生物基本生命活動外，代謝活動主要以氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主。本研究與Chen Chen等[26]采用宏基因組分析酒曲中微生物多樣性與風(fēng)味形成相關(guān)性的結(jié)果一致，在酒曲所有活性代謝途徑中，膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝和氨基酸代謝最為活躍，而碳水化合物代謝和氨基酸代謝這兩類代謝通路與風(fēng)味物質(zhì)形成密切相關(guān)。

圖2 棗酒酒醅基因COG功能分類Fig. 2 COG Functional classification of genes in fermented jujube mash

2.2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析

棗酒酒醅中238 860 個不同的基因被注釋，從屬于KEGG數(shù)據(jù)庫6大類 43個KEGG 通路中（圖3）。6大類分別是代謝通路（133 173，55.75%）、環(huán)境信息處理（29 448，12.33%)、遺傳信息處理（27 570，11.54%）、細(xì)胞進(jìn)程（18 558，7.77%）、人類疾病（18 291，7.66%）和生命系統(tǒng)（11 820，4.95%）。富集差異表達(dá)基因最多的8個KEGG通路包括碳水化合物代謝（38 526）、氨基酸代謝（22 671）、膜運(yùn)輸（17 493）、輔酶和維生素代謝（14 232）、能量代謝（14 022）、核苷酸代謝（11 979）、信號傳導(dǎo)（11 910）、翻譯（11 457）。其中，碳水化合物代謝及氨基酸代謝是最主要的兩類代謝活動，與COG功能注釋結(jié)果一致。Chen Chen等[26]利用Spearman相關(guān)性分析了特定代謝通路與風(fēng)味形成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)根霉（Rhizopus）、酵母菌（Saccharomycopsis）、Wickerhamomyces和Weissella菌種與氨基酸代謝呈正相關(guān)，而碳水化合物代謝與Rhizopus、Saccharomycopsis、Pediococcus和Weissella有關(guān)。

圖3 棗酒酒醅基因KEGG代謝通路統(tǒng)計Fig. 3 Statistics of KEGG metabolic pathways in fermented jujube mash

2.2.3 基于CAZy數(shù)據(jù)庫的碳水化合物活性酶分析

CAZy數(shù)據(jù)庫可將不同種類的碳水化合物活性酶分為糖苷水解酶、糖基轉(zhuǎn)移酶、多糖裂合酶、碳水化合物酯酶、碳水化合物結(jié)合模塊、輔助模塊酶類6大類蛋白質(zhì)家族。與CAZy數(shù)據(jù)庫比對后，棗酒酒醅樣品中共鑒定出3 824個碳水化合物活性酶（圖4），其中，糖苷水解酶（1 232個）和糖基轉(zhuǎn)移酶（1 238個）類數(shù)量最多，占據(jù)樣品檢測數(shù)據(jù)總數(shù)的70%。其次是碳水化合物酯酶（533個）、碳水化合物結(jié)合模塊（416個）和輔助模塊酶類（157個）。多糖裂合酶（48個）類最少，僅占樣品檢測到酶總數(shù)的0.9%。糖苷水解酶以內(nèi)切或外切方式水解寡糖、多糖等各種含糖化合物的糖苷鍵，生成單糖、寡糖或糖復(fù)合物，因而在寡糖、芳香基糖苷的合成、氨基酸和多肽的糖基化方面發(fā)揮了重要作用。而糖基轉(zhuǎn)移酶在生物體內(nèi)催化活化的糖連接到不同的受體分子，如蛋白、寡糖、脂和小分子上[27-29]。酒醅中豐富的糖苷水解酶及糖基轉(zhuǎn)移酶為單糖、寡糖的形成、轉(zhuǎn)移及進(jìn)一步代謝提供了基礎(chǔ)。

圖4 棗酒酒醅CAZy統(tǒng)計Fig. 4 Statistics of CAZy in fermented jujube mash

2.3 糖代謝基因分析

2.3.1 糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中，甘露醇、果糖、甘露糖和蔗糖可同時由磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（glucose phosphotransferase system，PTS）轉(zhuǎn)運(yùn)，由表1可知，棗酒酒醅中分別發(fā)現(xiàn)控制基因20、17、200、28個，表明發(fā)酵過程中酒醅微生物對不同糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同，發(fā)酵期間菌種對甘露糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)。乳糖和麥芽糖可以通過PTS、ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及透性酶3種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。但是酒醅中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于麥芽糖的PTS及透性酶基因，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中有多糖轉(zhuǎn)運(yùn)和單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩類，未發(fā)現(xiàn)麥芽糖的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因，表明酒醅中微生物對麥芽糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較弱，較難實(shí)現(xiàn)胞外分解。半乳糖醇只能通過PTS進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，酒醅中發(fā)現(xiàn)半乳糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因79 個。葡萄糖酸鹽、果糖和低聚糖也可利用相關(guān)透性蛋白進(jìn)入菌株細(xì)胞內(nèi)，分別檢索到基因2、8、35個。

表1 酒醅糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因分析Table 1 Gene analysis of carbohydrate transport systems in fermented jujube mash

2.3.2D-1-磷酸果糖的轉(zhuǎn)化

果糖經(jīng)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)最終進(jìn)入細(xì)胞后形成D-1-磷酸果糖，而后轉(zhuǎn)化為糖酵解的中間產(chǎn)物D-3-磷酸甘油醛。此過程可通過3 條途徑實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵酶分別是磷酸果糖激酶和2-磷酸果糖醛縮酶，二磷酸果糖醛縮酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶，以及2-磷酸果糖醛縮酶和丙糖激酶3種組合。結(jié)合表1、2，酒醅中含有果糖的PTS，且含有11個二磷酸果糖醛縮酶和32個磷酸丙糖異構(gòu)酶基因，可通過第2種途徑將胞內(nèi)的D-1-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為D-3-磷酸甘油醛。

表2 酒醅中參與糖類轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因分析Table 2 Genes encoding enzymes involved in the conversion of carbohydrates into intermediates in glycolysis pathway

2.3.3 6-磷酸蔗糖的轉(zhuǎn)化

蔗糖經(jīng)PTS轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞后形成6-磷酸蔗糖，之后可在β-呋喃果糖苷酶/6-磷酸蔗糖水解酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為D-6-磷酸葡萄糖和β-D-果糖。結(jié)合表1、2，酒醅中含有果糖的PTS，且編碼了35個6-磷酸蔗糖水解酶的基因，因此酒醅可以利用胞外蔗糖，轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)后，進(jìn)一步生成D-6-磷酸葡萄糖和β-D-果糖。

2.3.4 葡萄糖酸鹽的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖酸鹽可進(jìn)一步形成糖酵解途徑的中間物質(zhì)β-D-6-磷酸果糖，但此過程需要在葡糖酸激酶、6-磷酸葡萄糖酸鹽脫氫酶、磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶和轉(zhuǎn)酮醇酶的催化作用下才能實(shí)現(xiàn)。酒醅中發(fā)現(xiàn)4 種酶的控制基因，基因數(shù)分別為44、64、39、39 個，因此酒醅在發(fā)酵過程中可利用胞外的葡萄糖酸鹽，進(jìn)一步生成β-D-6-磷酸果糖，參與糖酵解途徑。

2.4 氨基酸風(fēng)味形成途徑的基因分析

氨基酸風(fēng)味形成途徑起始于轉(zhuǎn)氨作用，氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮酸，酮酸較不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類，進(jìn)一步脫氫生成醇類，再經(jīng)酯化轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯類，這些代謝物都是食品中重要的風(fēng)味成分。

2.4.1 轉(zhuǎn)氨酶

支鏈氨基酸、芳香族氨基酸和蛋氨酸的轉(zhuǎn)氨作用可以通過不同的轉(zhuǎn)氨酶催化。支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶（branchedchain aminoacid transferase，BcAT）對支鏈氨基酸和蛋氨酸具有活性。如表3所示，在棗酒酒醅基因中，發(fā)現(xiàn)BcAT基因（ilvE）171個，其可以催化支鏈氨基酸。例如，支鏈氨基酸中的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸可通過支鏈氨基轉(zhuǎn)氨酶分別轉(zhuǎn)化為一系列α-酮異己酸、α-酮基-β-甲基戊酸和α-酮基-β-甲基丁酸。其中，據(jù)報道α-酮異己酸是發(fā)酵香腸中的主要風(fēng)味物質(zhì)。在棗酒中，諸如2-甲基丁酸乙酯（汗味）和異丁酸（酸味和甜味）之類的風(fēng)味化合物很可能是通過異亮氨酸或纈氨酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下經(jīng)氨基酸轉(zhuǎn)氨作用生成。

表3 棗酒酒醅基因組中參與轉(zhuǎn)氨作用途徑的酶編碼基因Table 3 Genes encoding enzymes involved in transamination pathway in fermented jujube mash

2.4.2 酮酸轉(zhuǎn)化酶

酮酸可以3種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。第1種方式：酮酸通過氧化脫羧直接轉(zhuǎn)化為羧酸，主要依靠酮酸脫氫酶（ketoacid dehydrogenase，KaDH）、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（phosphotransacetylase，PTA）和酰基激酶（acyl kinase，ACK）。如表3所示，在棗酒酒醅中存在99 個PTA（pta）和189 個編碼ACK（ackA）基因，表明酒醅發(fā)酵過程中可以通過該途徑將支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等）的酮酸轉(zhuǎn)化為甜味的甲基丁酸和異丁酸。第2種方式是通過羧酸脫氫酶將酮酸分解為羧酸。第3種方式是α-酮酸通過α-酮酸脫羧酶轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛。在棗酒酒醅中未發(fā)現(xiàn)編碼羧酸脫氫酶和酮酸脫羧酶的基因，這表明酒醅中的微生物無法進(jìn)行后兩種轉(zhuǎn)化形式，發(fā)酵過程中主要采用第1種酮酸轉(zhuǎn)化方式。

2.4.3 醇和醛脫氫酶

醛脫氫酶和醇脫氫酶可以分別催化醛（醇）類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇類和羧酸類物質(zhì)，控制基因分別為醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，AldDH）和醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，AlcDH）。棗酒酒醅中發(fā)現(xiàn)159個編碼AldDH的基因（AdhE），因此酒醅中的微生物具有催化醛轉(zhuǎn)化為相應(yīng)醇的潛力。例如，它可以催化異戊醛、活性戊醛和異丁醛以生成相應(yīng)的異戊醇、活性戊醇和異丁醇。適量的高級醇給棗酒帶來豐厚的醇和感，使其綿柔利口，此結(jié)果與棗酒中豐富的高級醇含量相一致[30-31]。同時，酒醅中發(fā)現(xiàn)160 個編碼AlcDH的基因，分為adh、adh1、Adh2、AdhP4 種基因類型，其中AdhP（135）基因數(shù)最豐富，表明酒醅中微生物可將醇類轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

傳統(tǒng)棗酒香氣濃郁、風(fēng)味獨(dú)特，與其酒醅中復(fù)雜的微生物代謝活動密不可分。本實(shí)驗基于宏基因組技術(shù)分析棗酒酒醅的微生物多樣性，挖掘糖代謝及氨基酸風(fēng)味形成系統(tǒng)的功能基因。主要結(jié)論如下：

1）酒醅樣品共檢測到356 189 條序列，G+C含量為43.46%。對棗酒酒醅基因進(jìn)行物種豐度注釋，共鑒定出微生物37個門、1 247個屬、3 937個種，其中相對含量大于1%的優(yōu)勢菌群在門、屬、種水平的數(shù)量分別為4、5、10 個；核心菌種是L. buchneri、L. plantarum、L. parabuchneri等。

2）經(jīng)COG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，分別注釋到6 269、238 860 個基因，主要代謝活動為氨基酸代謝和碳水化合物代謝。碳水化合物活性酶中，糖苷水解酶（1 232）和糖基轉(zhuǎn)移酶（1 238）數(shù)量最多，占據(jù)棗酒酒醅碳水化合物活性酶的70%。

3）在糖代謝途徑中，酒醅編碼了甘露醇、果糖、甘露糖、蔗糖和半乳糖醇的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因，檢索到葡萄糖酸鹽、果糖和低聚糖相關(guān)透性蛋白基因，且具備催化胞內(nèi)D-1-磷酸果糖、6-磷酸蔗糖及葡萄糖酸鹽的關(guān)鍵酶基因，具備將其轉(zhuǎn)化為糖酵解中間產(chǎn)物的基因基礎(chǔ)。

4）氨基酸風(fēng)味形成中，酒醅編碼了171個BcAT、288個酮酸轉(zhuǎn)化酶、319 個醇/醛脫氫酶和144個乙酰酯酶的控制基因，氨基酸可經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為相應(yīng)酮酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類，進(jìn)一步脫氫生成醇類，再經(jīng)酯化轉(zhuǎn)化為相應(yīng)酯類，具備形成濃郁酯香風(fēng)味的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗在分析棗酒酒醅菌群結(jié)構(gòu)組成的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確了酒醅主要代謝活動及糖代謝、氨基酸代謝的關(guān)鍵酶基因，后續(xù)需進(jìn)一步對優(yōu)勢菌株進(jìn)行篩選應(yīng)用，分析優(yōu)勢菌株在主要代謝通路中的作用，并進(jìn)一步驗證關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，以期為棗酒的品質(zhì)提升及微生物功能基因庫的挖掘提供理論依據(jù)。