姜 炅,董 蕾,宋亞華,王 晶,程 妍,戴社教(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710004;通訊作者,E-mail:daishejiao@163.com)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類模式識(shí)別受體,能夠識(shí)別存在于病原微生物體內(nèi)的病原體相關(guān)分子模式,產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活天然免疫,調(diào)節(jié)獲得性免疫[1]。研究表明TLRs激動(dòng)劑具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用,不僅可以對(duì)抗感染,提高獲得性免疫[2],還可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[3-5]。咪喹莫特(imiquimod,IMQ)是一種人工合成的咪唑喹啉類異環(huán)胺類藥物,是目前最為熟悉的選擇性TLR7激動(dòng)劑[6],被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療外陰疣,光化角化病及淺表基底細(xì)胞癌[7]。咪喹莫特的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制,通過(guò)刺激TLR7激活樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的MyD88依賴途徑分泌INF-α,IL-6、TNF-α等炎癥因子,實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)免疫、治療腫瘤的目的[6,8]。此外咪喹莫特還可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,雖然TLR7不依賴于膜結(jié)合的死亡受體,但是過(guò)度表達(dá)Bcl-2或者抑制caspase信號(hào)途徑的活化都可以抵抗咪喹莫特誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9,10]。近些年的研究發(fā)現(xiàn),咪喹莫特對(duì)一些實(shí)體腫瘤如乳腺癌[11]、髓系白血病[12]、口腔癌[13]等也具有一定的抑制作用,并且咪喹莫特對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用是通過(guò)誘導(dǎo)多種形式的程序性死亡而實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞自噬是不同于細(xì)胞凋亡的另外一種程序性死亡,在介導(dǎo)細(xì)胞增殖和死亡中具有重要作用。大量研究表明一些人類腫瘤出現(xiàn)自噬基因拷貝缺失、表達(dá)水平下調(diào),提示調(diào)控自噬可能成為治療腫瘤的方向之一[14],并且許多抗腫瘤藥物正是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬而在腫瘤的治療中表現(xiàn)出了良好的療效。

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)不同類型的胃癌細(xì)胞株中及胃癌組織中均有TLR7的表達(dá),其激動(dòng)劑咪喹莫特對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出良好的抑制作用并且能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[15]。除此之外,我們的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)咪喹莫特存在誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生其他類型程序性死亡的可能性,為了證實(shí)這一點(diǎn),本研究在先前實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)檢測(cè)藥物干預(yù)前后自噬相關(guān)基因表達(dá)變化探討咪喹莫特抑制胃癌細(xì)胞增殖的深入機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室提供。采用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),常規(guī)加入100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素,37 ℃,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。咪喹莫特購(gòu)自美國(guó)Enzo life Sciences公司;兔抗人LC3抗體、Beclin1抗體分別購(gòu)自美國(guó)Sigma公司及Epitomics公司;mTOR、p-mTOR、p-Akt、p70S6K、GPDH和二抗均購(gòu)自南京巴傲得生物公司;p62兔抗人、Akt鼠抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;本實(shí)驗(yàn)所采用引物由北京奧科生物公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)改變 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板,給予25,50,100 μg/ml咪喹莫特處理24 h,收集干預(yù)組及陰性對(duì)照組(0 μg/ml咪喹莫特)細(xì)胞,提取總RNA,紫外分光光度儀進(jìn)行RNA含量及純度鑒定,建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:37 ℃ 15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)),85 ℃ 5 s(逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng))。合成的cDNA按下述條件進(jìn)行擴(kuò)增:預(yù)變性94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s 35個(gè)循環(huán),延伸72 ℃ 7 min。合成引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白及Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板,給予25,50,100 μg/ml咪喹莫特處理24 h,收集干預(yù)組及陰性對(duì)照組細(xì)胞;聯(lián)合應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素24 h,收集聯(lián)合應(yīng)用組(100 μg/ml咪喹莫特加100 nmol/L雷帕霉素)與100 μg/ml咪喹莫特組及陰性對(duì)照組細(xì)胞,PBS清洗2次,加入蛋白裂解液冰上裂解1 h,提取總蛋白,蛋白定量后分別取30 μg蛋白制備上樣蛋白,8%或10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,先后加入一抗(LC3 1 ∶500,Beclin1 1 ∶1 000,p62 1 ∶500,p-Akt 1 ∶500,Akt 1 ∶200,mTOR 1 ∶500,p-mTOR 1 ∶500,p70S6K 1 ∶500。4 ℃孵育過(guò)夜,TBST清洗3次,對(duì)應(yīng)二抗(山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗1 ∶1 000)。室溫下孵育2 h,TBST清洗3次,PBS清洗1次,暗室中等比例加入化學(xué)發(fā)光液A和B作用1～3 min,進(jìn)行顯影,定影及拍照。

1.2.3 透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 給與100 μg/ml咪喹莫特處理12 h,取干預(yù)組及陰性對(duì)照組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞以1×105/孔接種于6孔板,0.25%胰酶消化干預(yù)后細(xì)胞,1 500 r/min離心15 min,棄上清,1%四氧化鋨固定,隨后依次進(jìn)行脫水、包埋、聚合及染色后,透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板,聯(lián)合應(yīng)用mTOR抑制劑雷帕霉素24 h,收集聯(lián)合應(yīng)用組(100 μg/ml咪喹莫特加100 nmol/L雷帕霉素)與100 μg/ml咪喹莫特組及陰性對(duì)照組細(xì)胞,每孔加入20 μl(5 mg/ml)MTT繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h,棄上清,加入150 μl/孔DMSO室溫震蕩儀上震蕩5 min,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 咪喹莫特誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)改變

不同濃度組咪喹莫特處理24 h,LC3Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白表達(dá)水平上調(diào),與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LC3Ⅱ：F=84.508、P=0.000,F=48.891、P=0.000;Beclin1：F=12.276、P=0.002,F=54.518、P=0.000),且隨濃度增加表達(dá)水平相應(yīng)上升。相反,p62 mRNA及蛋白表達(dá)水平隨濃度增加依次下降,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.786,P=0.000;F=81.208,P=0.000,見(jiàn)圖1)。

與0 μg/ml組相比,*P<0.05圖1 不同濃度咪喹莫特作用后LC3Ⅱ、Bclin 1和p62 mRNA及蛋白表達(dá)水平Figure 1 The mRNA and protein expression levels of LC3Ⅱ,Beclin1and p62 after treatment with imiquimod

2.2 咪喹莫特對(duì)SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照組相比較,干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度腫脹,部分線粒體嵴溶解,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬小體(AVi)常見(jiàn)(見(jiàn)圖2),自噬小體由雙層膜包繞,膜內(nèi)可見(jiàn)到完整的細(xì)胞器及細(xì)胞器碎片。

圖2 透射電鏡下觀察咪喹莫特處理SGC-7901細(xì)胞12 h細(xì)胞自噬情況Figure 2 Autophagy of SGC-7901 cells after treated with imiquimod for 12 h under electron microscopy

2.3 咪喹莫特誘導(dǎo)Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)改變

不同濃度咪喹莫特處理后各組總Akt和mTOR表達(dá)量無(wú)明顯差異,磷酸化Akt和mTOR隨劑量增加表達(dá)水平逐漸下降,其下游蛋白p70S6K表達(dá)也明顯下降。與對(duì)照組相比,聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素組LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)水平明顯上升,細(xì)胞增殖活性下降(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比,***P<0.01;與咪喹莫特組相比,###P<0.01圖3 咪喹莫特通過(guò)Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞發(fā)生自噬Figure 3 Imiquimod induced autophagy in SGC7901 cells through the Akt/mTOR signaling pathway

3 討論

胃癌是世界上排名第4位的最常見(jiàn)的惡性腫瘤,由于其較高的發(fā)病率及死亡率使其成為致死性腫瘤中排名第2位的惡性腫瘤[16]。多數(shù)病人尤其是老年人在發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入中晚期,臨床治療以氟尿嘧啶或鉑類聯(lián)合化療為主,但療效欠佳。近些年,以人表皮生長(zhǎng)因子受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、免疫檢查點(diǎn)等為靶點(diǎn)的靶向藥物治療已成為晚期胃癌的研究熱點(diǎn),雖然最大程度地提高了患者的生存率,控制了瘤組織進(jìn)一步惡化,但術(shù)后復(fù)發(fā)、藥物副作用及遠(yuǎn)期預(yù)后等整體療效仍不能令人十分滿意,因此開(kāi)發(fā)及尋求新的更有效的輔助化療藥物是目前胃癌治療的新方向[17]。

大量研究表明咪喹莫特具有直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用,過(guò)度表達(dá)的Bcl-2或者抑制caspase信號(hào)途徑的活化都可以抵抗咪喹莫特誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。體外培養(yǎng)人皮膚鱗癌細(xì)胞SCL-1,150 μg/ml咪喹莫特可以明顯抑制SCL-1細(xì)胞增殖,早期凋亡比率上升,Fas基因表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)cl-2基因表達(dá)下調(diào)[18]。除此之外,咪喹莫特能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬及自噬性死亡,而凋亡相關(guān)基因未見(jiàn)明顯改變[19]。在對(duì)咪喹莫特抑制前列腺癌細(xì)胞增殖作用的研究中發(fā)現(xiàn),咪喹莫特通過(guò)線粒體依賴途徑誘導(dǎo)了TRAMP-C2細(xì)胞的直接凋亡[20]。上述研究表明咪喹莫特可以通過(guò)多種途徑影響不同類型的腫瘤細(xì)胞發(fā)生不同形式的細(xì)胞死亡。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),采用不同濃度組咪喹莫特作用于SGC-7901細(xì)胞12～24 h,咪喹莫特對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間及濃度依賴性[15]。100 μg/ml咪喹莫特在作用12 h時(shí)即可明顯抑制細(xì)胞增殖活性,但咪喹莫特誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生的凋亡效應(yīng)在藥物干預(yù)至少12 h之后,因此我們猜測(cè)咪喹莫特作用胃癌細(xì)胞早期可能先誘導(dǎo)發(fā)生了其他形式的死亡如Ⅱ型程序性死亡即自噬,然后進(jìn)一步誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡。

到目前為止透射電鏡被認(rèn)為是鑒定自噬的金標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)透射電鏡觀察咪喹莫特處理12 h SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)存在大量囊泡性結(jié)構(gòu),在30 000倍視野下可以觀察到這些囊泡結(jié)構(gòu)多為雙層膜包裹的細(xì)胞器如線粒體形成的AVi,在本階段沒(méi)有觀察到明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。而我們之前的研究表明,咪喹莫特處理24 h凋亡現(xiàn)象發(fā)生明顯增多,細(xì)胞皺縮、核凝聚、邊集,部分細(xì)胞可觀察到典型的凋亡小體出現(xiàn)[21]。由此可見(jiàn),咪喹莫特可以同時(shí)誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬,并且自噬現(xiàn)象發(fā)生早于凋亡。

除了透射電鏡外,檢測(cè)自噬相關(guān)基因的改變也是鑒定是否發(fā)生自噬的途徑之一。自噬的啟動(dòng)和運(yùn)行包括自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成,自噬體與溶酶體的結(jié)合,自噬溶酶體的酸化、降解等過(guò)程均需要保守的自噬相關(guān)基因產(chǎn)物(Atg)的參與,LC3Ⅱ定位于自噬體內(nèi)外膜,一直結(jié)合在自噬體膜上,直到自噬體與溶酶體融合,因此LC3Ⅱ被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)自噬現(xiàn)象發(fā)生的標(biāo)記物,LC3Ⅱ含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱。Beclin1是另外一種和自噬關(guān)系密切的自噬基因,它是酵母Atg6/Vps30的同系物,在抑制腫瘤、延緩衰老、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用,同時(shí)定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Beclin1是誘發(fā)自噬的重要因子,Beclin1通過(guò)與Ⅲ型PI3K和UVRAG結(jié)合形成復(fù)合體調(diào)節(jié)其他Atg基因在自噬體形成中的定位,從而啟動(dòng)自噬過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度咪喹莫特作用SGC-7901細(xì)胞24 h,LC3Ⅱ和Beclin1 mRNA及蛋白水平明顯上調(diào),且隨濃度增加表達(dá)水平相應(yīng)上升,而p62表達(dá)水平隨咪喹莫特濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),進(jìn)而進(jìn)一步證實(shí)咪喹莫特確實(shí)可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬。

調(diào)控自噬的信號(hào)途徑有很多種,其中Akt/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控自噬最主要的途徑之一[22]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中,Akt/mTOR信號(hào)通路失調(diào)是一個(gè)頻發(fā)事件,腫瘤中通常存在自噬能力下降和Akt/mTOR通路上調(diào),因此目前針對(duì)該通路的抗腫瘤藥物也逐漸被開(kāi)發(fā)出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),咪喹莫特可以使Akt和mTOR的磷酸化減少,其下游的信號(hào)分子p70S6激酶p70S6k表達(dá)下調(diào),提示咪喹莫特可以負(fù)向調(diào)控該信號(hào)通路以發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,使用mTOR選擇性的抑制劑雷帕霉素抑制該通路的活性不僅可以使SGC-7901細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步下降,而且可以促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達(dá)上調(diào),提示Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)了咪喹莫特誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬及自噬性死亡。

綜上所述,咪喹莫特可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬,其機(jī)制是部分抑制Akt/mTOR信號(hào)通路,激活自噬相關(guān)蛋白表達(dá)及自噬體的形成,從而達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜,單一環(huán)節(jié)的治療效果有限,復(fù)合治療具有更明顯的優(yōu)勢(shì),TLRs激動(dòng)劑具有用量小、副作用少,與多種化療藥物合用有助于減輕用藥負(fù)擔(dān),增加藥物療效,因此TLRs激動(dòng)劑在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中都具有一定的潛在開(kāi)發(fā)意義[23]。本研究在以往科研工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了TLR7激動(dòng)劑咪喹莫特抑制人胃癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,為日后進(jìn)一步深入的研究奠定了理論基礎(chǔ),同時(shí)為胃癌的治療提供了可能的新方向。