張海祥,崔鵬程,王晉平(陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,西安 70068;空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉科;陜西省人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科;通訊作者,E-mail:06070789@qq.com)

氣管缺損多是由腫瘤、外傷、長(zhǎng)時(shí)間插管和先天性疾病等所致,通常6 cm以內(nèi)的氣管缺損可通過(guò)斷端吻合完成修復(fù),但修復(fù)大于6 cm的氣管缺損就比較棘手。目前氣管移植被認(rèn)為是修復(fù)大面積氣管缺損的理想方法,臨床上已有同種異體氣管移植成功的報(bào)道[1]。但移植后患者需終身應(yīng)用免疫抑制劑,會(huì)增加腫瘤復(fù)發(fā)和機(jī)會(huì)性感染的概率,對(duì)于患者顯然是不適用的。前期研究[2]已成功應(yīng)用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)脫細(xì)胞方法在同種異體移植中,在不使用免疫抑制劑的情況下,進(jìn)行了同種異體氣管的移植。由于目前供體資源緊缺,開(kāi)發(fā)異種移植迫在眉睫。豬氣管作為一種極好的異種源性氣管移植物,是組織工程氣管重建的主要來(lái)源,尤其是基因敲除豬的問(wèn)世,更是給異種氣管移植帶來(lái)了光明[3]。然而它經(jīng)過(guò)SDS脫細(xì)胞處理后能否在不使用免疫抑制劑的情況下,應(yīng)用于異種移植中尚無(wú)報(bào)道。本研究探討在不使用免疫抑制劑的情況下應(yīng)用SDS脫細(xì)胞方法處理后的異種氣管能否移植成功,以期為組織工程方法治療氣管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用健康家豬9只,體質(zhì)量50～60 kg,雌雄不限。9只健康成年比格犬,體質(zhì)量11～14.5 kg,雌雄不限(實(shí)驗(yàn)所選用家豬均由西安惠品肉業(yè)有限公司提供,比格犬均為第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心所提供,許可證號(hào)20191009)。

1.2 方法

1.2.1 供體豬氣管的收集 準(zhǔn)備裝有高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液(器官保存液)的玻璃瓶和冰塊的轉(zhuǎn)運(yùn)箱。將新鮮宰殺的9只家豬每只取喉以下隆突以上的頸段氣管(約12 cm),去除凈周圍組織后,立即放入裝有器官保存液的玻璃瓶,轉(zhuǎn)運(yùn)箱即刻運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 供體氣管去黏膜處理 將9段豬氣管隨機(jī)分為3組,即1%SDS處理組、3%SDS處理組和3%SDS內(nèi)外處理組。①1%SDS供體氣管內(nèi)去黏膜處理:在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)一步詳細(xì)去除氣管周圍的組織,將其浸泡在安爾碘中1 min消毒滅菌處理,之后反復(fù)用生理鹽水(約2 500 ml)沖洗干凈。在氣管一端塞入膠塞,并用絲線固定。管腔內(nèi)放置一根無(wú)菌細(xì)木棒,以維持氣管直立狀態(tài)。將其放入一個(gè)大試管中,氣管腔內(nèi)用移液槍注入1%SDS溶液,不能溢出。腔外注滿器官保存液,不能流入管腔內(nèi)。放入4 ℃冰箱,每日更換氣管內(nèi)外的溶液,并每日取一氣管環(huán)進(jìn)行甲醛固定。于84 h后,將去黏膜處理后的豬氣管埋植于比格犬的背部。②3%SDS供體氣管內(nèi)去黏膜處理:同上,消毒滅菌并清洗后在氣管腔內(nèi)注入3%SDS溶液進(jìn)行去黏膜處理,14 ℃低溫保存,每日更換相應(yīng)溶液并取一氣管環(huán)固定待檢,于96 h后行氣管異體埋植。③3%SDS供體氣管內(nèi)外去黏膜處理:同上,消毒滅菌并清洗后氣管腔內(nèi)外均充滿3%SDS溶液進(jìn)行去黏膜處理,14 ℃低溫保存,隔日更換溶液并取一氣管環(huán)固定待檢,于120 h后行氣管異體埋植。

1.2.3 去黏膜氣管埋植前準(zhǔn)備 脫細(xì)胞后的氣管放入盛有生理鹽水的密閉容器中,在震蕩床以120次/h的速度振蕩20 min。振蕩完畢后,用2 500 ml生理鹽水反復(fù)沖洗氣管,至沖洗液清亮無(wú)泡沫。氣管兩端各去除3環(huán)(防止兩端有未完全浸泡SDS的氣管組織)后,并取一環(huán)行組織學(xué)檢測(cè),剩余氣管長(zhǎng)約6 cm。在氣管環(huán)間做約1.5 cm的橫行切口,切開(kāi)軟骨環(huán)間的韌帶。將與埋植氣管長(zhǎng)度相等的硅膠管,交錯(cuò)對(duì)稱剪菱形的小口。將硅膠管置于氣管腔內(nèi),絲線縫合固定。

1.2.4 異種異位氣管埋植 將受體動(dòng)物比格犬,體質(zhì)量約11～14.5 kg左右;使用地西泮和陸眠寧(陸眠寧和地西泮均按0.1 mg/kg分別臀部注射,40 min后可按0.05 mg/kg分別追加劑量)肌肉注射比格犬臀部,完全麻醉后,將其俯臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái);剃去背部毛發(fā),備皮;碘伏消毒后鋪無(wú)菌手術(shù)單。于犬背部行L型切口,逐層切開(kāi),掀起背闊肌筋膜;將與硅膠管固定好的氣管用筋膜包繞;逐層縫合固定。

1.2.5 埋植術(shù)后 比格犬麻醉清醒后,將其送回動(dòng)物房。先少量進(jìn)食水,待完全清醒后,再正常喂犬飼料,術(shù)后注意觀察傷口有無(wú)裂開(kāi)、破潰、滲出以及全身的免疫排斥反應(yīng)。

1.2.6 埋植后氣管取材 將發(fā)生排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,使用地西泮和陸眠寧(劑量同1.2.4)肌肉注射比格犬臀部,將其側(cè)臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。觀察切口情況后,碘伏消毒后鋪無(wú)菌手術(shù)單,于氣管埋植處切開(kāi)皮膚、皮下組織,筋膜層,暴露埋植的氣管。觀察氣管的形態(tài),并用相機(jī)拍照。

1.2.7 組織學(xué)檢測(cè) 切取的氣管環(huán)置于10%中性福爾馬林緩沖液中,室溫固定24 h。固定后,用蒸餾水洗滌,梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片厚度4 μm。切片用蘇木精和伊紅染色后,觀察埋植后氣管組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成、細(xì)胞外基質(zhì)的排列等情況。

2 結(jié)果

2.1 氣管的組織學(xué)檢查

使用1%SDS及3%SDS脫細(xì)胞后的氣管,不間斷地采集氣管環(huán)標(biāo)本,行HE染色。通過(guò)觀察,可以發(fā)現(xiàn)在相同的時(shí)間內(nèi)濃度高的處理組脫細(xì)胞效果更徹底。1%SDS處理組7 d時(shí)在氣管黏膜層仍有少許腺體存在(見(jiàn)圖1A)。3%SDS處理組4 d時(shí)氣管黏膜層已經(jīng)幾乎沒(méi)有腺體結(jié)構(gòu),上皮細(xì)胞無(wú)正常結(jié)構(gòu);在第7天時(shí),整個(gè)黏膜下層水腫明顯,黏膜層已沒(méi)有正常的細(xì)胞及腺體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1B)。3%SDS內(nèi)外處理組隔日換液和取樣檢查,結(jié)果顯示,在處理4 d時(shí)氣管黏膜層腺體結(jié)構(gòu)消失,上皮細(xì)胞也無(wú)正常結(jié)構(gòu);第6天時(shí),出現(xiàn)整個(gè)黏膜下層嚴(yán)重水腫,完全沒(méi)有正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1C)。

圖1 氣管SDS脫細(xì)胞后HE染色結(jié)果 (×100)Figure 1 HE staining of tracheal after SDS decellularization (×100)

2.2 埋植后大體觀察

結(jié)合脫細(xì)胞情況,選取合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行異種埋植,所有受體動(dòng)物在埋植后,均出現(xiàn)不同程度精神、食欲差,全身乏力。傷口局部破潰,瘺口形成,膿性分泌物的滲出,埋植氣管的移位等情況,具體情況如下。

2.2.1 1%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后異種埋植情況 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬均于術(shù)后第2天傷口局部腫脹明顯,術(shù)后第4天左右,傷口局部有破潰,可見(jiàn)混濁的膿性分泌物排出(見(jiàn)圖2A),1只犬于術(shù)后第7天取材,氣管軟骨環(huán)明顯軟化,部分被吸收。其余的于術(shù)后第11天取材,氣管形態(tài)完全消失,只見(jiàn)軟骨碎片(見(jiàn)圖2B,C)。

A.埋植部位下方皮膚局部破潰,且有膿性分泌物流出;B.切開(kāi)后只看到硅膠管,氣管形態(tài)完全消失,移位明顯;C.只見(jiàn)到軟骨碎片圖2 1%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 2 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 1% SDS treatment group

2.2.2 3%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后異種埋植情況 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬,其中1只于術(shù)后第2天不明原因死亡,其余的術(shù)后第2天傷口局部無(wú)明顯腫脹;術(shù)后第5天背部埋植的氣管向下滑落,且有瘺口形成,有膿性分泌物流出(見(jiàn)圖3A);術(shù)后第11天取材,見(jiàn)埋植氣管已變成小碎片(見(jiàn)圖3B,C)。

2.2.3 3%SDS氣管內(nèi)外去黏膜 豬氣管去黏膜處理后異種埋植犬,其中1只于術(shù)后第3天不明原因死亡,另1只術(shù)后第4天埋植部位下方破潰(見(jiàn)圖4A),于第7天時(shí)氣管被排出(見(jiàn)圖4B);另1只于術(shù)后11 d取材,發(fā)現(xiàn)埋植氣管形態(tài)較前兩種方法要好,但同樣沒(méi)有完整的氣管形態(tài)(見(jiàn)圖4C)。

A.埋植氣管向下方移位,且有瘺口形成,局部有膿性分泌物流出;B.切開(kāi)后已無(wú)氣管形態(tài),只見(jiàn)硅膠管;C.埋植的氣管已成碎片圖3 3%SDS氣管內(nèi)去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 3 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 3% SDS treatment group

A.埋植部分下方破潰,流膿;B.被排出的氣管;C.11 d取材時(shí)無(wú)完整的氣管形態(tài),但氣管環(huán)部分存在圖4 3%SDS氣管內(nèi)外去黏膜處理后埋植氣管11 d的情況Figure 4 The general situation in 11 d after tracheal implantation in 3% SDS internal and external treatment group

3 討論

隨著人類壽命的不斷延長(zhǎng),慢性疾病和終末期器官衰竭的患者越來(lái)越多。那么如何拯救這些終末期器官衰竭的患者呢?器官移植目前被認(rèn)為是最有效的途徑。然而,人體器官供需不平衡一直是臨床移植的瓶頸。根據(jù)美國(guó)政府關(guān)于器官捐贈(zèng)和移植的信息,截至2019年1月,超過(guò)11.3萬(wàn)名候選者在等待器官移植,而2018年僅進(jìn)行了36 528例移植。在中國(guó),有超過(guò)30萬(wàn)人在等待移植,但每年只有1.6萬(wàn)個(gè)器官可供使用[4]。因此,異種移植可能是填補(bǔ)器官、組織和細(xì)胞供求差距的一種有前途的替代方法。

異種移植最早在1667年從羔羊到人的異種輸血中被提到[5]。動(dòng)物器官的臨床異種移植是從1905年兔腎移植到人身上開(kāi)始記載的[6]。由于非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(NHPs)在進(jìn)化上比其他物種更接近人類,從20世紀(jì)20年代到20世紀(jì)90年代,研究人員進(jìn)行的幾項(xiàng)涉及NHPs腎臟、心臟和肝臟的異種移植試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),NHPs并不適合用于臨床異種移植[7,8],原因包括倫理方面的考慮、跨物種感染傳播給人類的高風(fēng)險(xiǎn)、繁殖困難、器官大小差異等等因素[9]。從20世紀(jì)90年代以來(lái),研究人員一直試圖將豬作為異種移植的源動(dòng)物,豬目前被認(rèn)為是最合適的候選物種。選擇豬作為異種移植器官的原因有豬產(chǎn)仔數(shù)較大,成熟期較短,豬的大小和生理上與人相似,異種人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)較低,以及基因工程技術(shù)易于應(yīng)用于生產(chǎn)抗排異的豬器官[10]。然而,豬和人之間的遺傳差異導(dǎo)致了異種移植的障礙,包括免疫排斥和異種人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)。其中免疫障礙是臨床異種移植的限制因素。由于基因編輯工具和免疫抑制療法的進(jìn)步,以及在豬-非人類靈長(zhǎng)類模型中延長(zhǎng)了異種移植存活時(shí)間,臨床異種移植變得更加可行。

由于氣管與其他器官相比具有非常低的免疫原性[11,12],而且研究發(fā)現(xiàn)它的免疫原性主要位于氣管的黏膜層,軟骨僅具有輕微的免疫原性[13]。前期研究結(jié)果證實(shí),SDS處理的氣管在全程未使用免疫抑制劑的情況下,同種異體埋植是成活的,埋植半年的氣管力學(xué)特性與新鮮氣管相比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[14]。同時(shí),SDS作為大鼠全心灌注脫細(xì)胞的主要藥物[15],還可以在鼠前臂[16]、豬角膜[17]、豬心肌[18]、豬心臟瓣膜[19]、豬小腸[20]、豬腎[21]、人體靜脈[22]、鼠、豬和人類肺[23,24]及人類心臟[25]中達(dá)到脫細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。而且脫細(xì)胞支架由于其微小的抗原潛能,增加了異種移植和異體移植的通用性[26]。但是將此脫細(xì)胞方法應(yīng)用于氣管異種移植的報(bào)道幾乎沒(méi)有。因此本研究首次嘗試將此方法應(yīng)用于氣管異種移植。

本研究采用1%SDS溶液,與同種異體埋植相同的脫細(xì)胞方式[2]對(duì)豬氣管上皮層進(jìn)行了處理,然后行異種埋植。在術(shù)后第2天埋植動(dòng)物的傷口局部腫脹明顯;術(shù)后第4天左右傷口局部有破潰,可見(jiàn)混濁的膿性分泌物排出;1只犬于術(shù)后第7天取材,氣管軟骨環(huán)明顯軟化,部分被吸收。其余的于術(shù)后第11天取材,氣管形態(tài)完全消失,只見(jiàn)3個(gè)軟骨碎片。由于SDS脫細(xì)胞的程度與其濃度是相關(guān)的,本研究嘗試增加SDS的濃度,但在濃度超過(guò)3%時(shí),SDS溶液會(huì)有晶體析出,影響脫細(xì)胞效果。研究盡管也調(diào)整了氣管SDS脫細(xì)胞的方式,從氣管黏膜層局部浸潤(rùn)到全氣管的浸潤(rùn),但是實(shí)體動(dòng)物異種埋植試驗(yàn)證明,單一的脫細(xì)胞方法無(wú)法達(dá)到異種移植免疫排斥的要求。另外,術(shù)后出現(xiàn)膿性分泌物考慮可能是發(fā)生急性排斥反應(yīng)的同時(shí)發(fā)生了炎癥反應(yīng)。異種移植有3種排斥反應(yīng):超急性排斥反應(yīng)(hyperacute rejection,HAR)、急性體液性排斥反應(yīng)(acute humoral xenograft rejection, AHXR)和急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)。異種移植物在幾分鐘到幾小時(shí)內(nèi)被迅速破壞,這一過(guò)程被稱為超急性排斥反應(yīng)(HAR);急性體液性異種移植排斥反應(yīng)(AHXR),也稱為延遲異種移植排斥反應(yīng)[27]。AHXR是一種由體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、活化的內(nèi)皮和炎癥共同引起的現(xiàn)象。急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)與整個(gè)器官移植和細(xì)胞移植都有關(guān)。它會(huì)導(dǎo)致移植后幾天到幾周的排斥反應(yīng)[28]。除了免疫排斥外,炎癥反應(yīng)和凝血功能失調(diào)也變得更加突出,進(jìn)而導(dǎo)致異種移植失敗[29]。

依據(jù)多年來(lái)在SDS脫細(xì)胞喉及氣管組織方面積累的經(jīng)驗(yàn),研究主要以HE染色結(jié)果對(duì)脫細(xì)胞的效果進(jìn)行預(yù)判。脫細(xì)胞的目的是將有免疫原性的細(xì)胞成分從組織中去除,同時(shí)不損傷細(xì)胞外基質(zhì)支架。但是要想達(dá)到這種理想的狀態(tài)可能性非常小,因?yàn)槿魏我环N脫細(xì)胞的方法在去除免疫原性細(xì)胞的過(guò)程中都不可避免地會(huì)損傷到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。研究能做的只是采取某種脫細(xì)胞方法,單一的或聯(lián)合的,使其在脫細(xì)胞過(guò)程中盡可能減少對(duì)ECM的損傷[30]。即便是殘留在ECM中的少部分細(xì)胞成分也會(huì)對(duì)埋植后的受體有排斥作用,判斷脫細(xì)胞有效性的方法之一就是HE染色,當(dāng)然還有更進(jìn)一步的生化及生物力學(xué)等指標(biāo)。本研究從應(yīng)用出發(fā),根據(jù)HE染色結(jié)果,在大動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn),這樣更有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

由于氣管的免疫原性主要位于氣管的黏膜層,軟骨僅具有輕微的免疫原性,在同種異體移植中,軟骨僅表現(xiàn)輕微的免疫原性,并且軟骨的輕微免疫原性可以忽略不計(jì)。因此,通過(guò)脫細(xì)胞處理后,在不需要任何免疫抑制劑的情況下,同種異體移植是成活的。然而本實(shí)驗(yàn)中異種移植的免疫排斥反應(yīng)較同種移植的免疫排斥反應(yīng)更強(qiáng)烈?？赡芘c軟骨的免疫原性在同種異體移植物中表現(xiàn)不明顯,但在異種移植中可能會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)有關(guān),這需要今后進(jìn)一步深入研究。