胡鳳艷,方愛莉,賀建東,王志豪(山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學科學院,同濟山西醫(yī)院,山西醫(yī)科大學第三醫(yī)院麻醉科,太原 030032;通訊作者,E-mail:17876811187@qq.com)

腎缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,IRI)是指已經(jīng)缺血的腎臟在部分或完全恢復(fù)血流后出現(xiàn)的損傷加重和腎功能的惡化。麻醉醫(yī)師在臨床工作中經(jīng)常遇到的術(shù)中低血壓、體外停循環(huán)、腎移植等都涉及到腎IRI的問題[1],而腎IRI也是圍術(shù)期急性腎損傷最常見的病因,成為影響患者預(yù)后的重要因素[2]。由糖尿病(diabetes mellitus,DM)代謝紊亂引起的DM腎病是終末期腎功能衰竭的原因之一[3],且DM患者對腎IRI的易感性增加,較正常人有更高的病死率和不良預(yù)后[4,5]。自噬作為機體的一種防御性機制,自噬激活后能減輕各種應(yīng)激狀態(tài)下的細胞損傷,維持器官正常功能,自噬過多則會損傷細胞,導致器官功能的紊亂[6]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是用于研究自噬的標志蛋白之一,包括Ⅰ型和Ⅱ型兩種,由于Ⅱ型的表達與自噬程度呈正相關(guān),本實驗選用LC3-Ⅱ指標。已有研究發(fā)現(xiàn),DM大鼠腎小管上皮細胞存在過度的自噬[7],是引起腎損傷加重的重要原因。而丙泊酚作為一種廣泛應(yīng)用的全身靜脈麻醉藥,具有高度的脂溶性和抗氧化特性,其被證明可通過抑制自噬減輕DM大鼠心肌IRI[8],也可通過抑制自噬保護缺血性損傷的神經(jīng)細胞[9],但丙泊酚對DM大鼠腎臟IRI的影響是否也與自噬有關(guān)目前尚未知,本研究擬探討丙泊酚對DM大鼠腎IRI的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康清潔雄性SD大鼠,體質(zhì)量約200～230 g,2～3月齡,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以后,采用隨機數(shù)字表法,將其分為4組(n=15):假手術(shù)組(sham組)、DM假手術(shù)組(DM+sham組)、DM腎缺血再灌注組(DI/R組)、DM腎缺血再灌注+丙泊酚組(DI/R+P組)。

1.2 DM大鼠模型建立

參照文獻[10]的方法構(gòu)建DM大鼠模型。大鼠禁食10 h后腹腔注射1%鏈脲佐菌素(批號:S0130,Sigma,美國)50 mg/kg,普通動物飼料喂養(yǎng)72 h后尾靜脈采血測量空腹血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L,并出現(xiàn)多飲、多尿、多食和體質(zhì)量減輕,提示建模成功,期間不進行胰島素干預(yù),觀察其行為表現(xiàn),定時測量血糖。

1.3 大鼠腎缺血再灌注模型的建立

參照文獻[11]的方法建立大鼠腎缺血再灌注模型,術(shù)前禁食12 h后,腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 ml/kg麻醉,連接BL-410生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測心電圖,經(jīng)頸正中切開暴露氣管,T形切口氣管插管后連接ALC-V8動物呼吸機機械通氣(潮氣量20 ml/kg,通氣頻率60次/min,吸呼比1 ∶2),用24號套管針行股動/靜脈穿刺置管。采用腹部正中切口,小心游離雙側(cè)腎蒂,無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎動脈,觀察腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)榘底仙?60 min后打開動脈夾再灌注24 h,然后迅速關(guān)閉腹腔。sham組與DM+sham組僅開腹不夾閉。DI/R+P組于再灌注5 min前經(jīng)股靜脈持續(xù)輸入丙泊酚[50 mg/(kg·h)]0.5 mg/ml,持續(xù)120 min。

1.4 腎功能指標測定

再灌注24 h后,經(jīng)股動脈采血獲取血標本,測定血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min),采用山西白求恩醫(yī)院檢驗科全自動生化分析儀(日立公司,日本)檢測。

1.5 HE染色觀察病理切片

隨機抽取各組部分腎組織,制備石蠟切片,后進行脫蠟、梯度濃度酒精脫苯,蒸餾水沖洗后蘇木素染核15 min,0.5%鹽酸酒精分色,伊紅復(fù)染1 min,100%酒精脫水2次,二甲苯透明3次,制成中性樹脂封片,于400倍光學顯微鏡下觀察腎組織HE染色病理學結(jié)果。

1.6 Western blot法測定LC3-Ⅱ蛋白表達水平

取腎臟組織,采用Western blot法測定LC3-Ⅱ蛋白表達水平。按照蛋白提取試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說明,組織打碎后加入細胞裂解液,勻漿離心取上清液,BCA法測定蛋白濃度。80 V電壓凝膠電泳90 min,轉(zhuǎn)膜后TBS漂洗,5%的脫脂牛奶室溫下?lián)u床封閉1 h,之后加入兔抗鼠LC3-Ⅱ抗體(Proteintech,18725-1-AP),4 ℃孵育過夜。加入HRP的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000,武漢博士德生物工程有限公司)。取適量ECL試劑盒(BIO-RAD,1705060)中等體積A液和B液混合,加到目的條帶附近避光反應(yīng)5 min,化學光敏模式曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參,以LC3-Ⅱ條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比反映LC3-Ⅱ的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 制備模型過程中大鼠生存率

在構(gòu)建糖尿病大鼠模型過程中,2只大鼠在腹腔注射腹腔注射1%鏈脲佐菌素后2 h內(nèi)死亡(死亡率4.4%)。在構(gòu)建大鼠缺血再灌注模型過程中3只大鼠在再灌注5 h內(nèi)死亡(死亡率6.7%)。死亡大鼠均以同期同步飼養(yǎng)的普通或糖尿病大鼠替代。

2.2 組織形態(tài)學觀察結(jié)果比較

光鏡結(jié)果顯示:sham組腎組織結(jié)構(gòu)基本正常;DM+sham組腎小管、腎間質(zhì)輕度腫脹,可見少量炎細胞浸潤;DI/R組大量腎小管變性、壞死,細胞脫落,管腔變窄,腎間質(zhì)充血水腫,炎細胞浸潤;經(jīng)丙泊酚輸注處理后,DI/R+P組大鼠腎臟組織炎癥浸潤和充血現(xiàn)象得到緩解,細胞輪廓變得清晰(見圖1)。

圖1 HE染色檢測大鼠腎臟組織Figure 1 Pathological changes of renal tissue by HE staining

2.3 血清Scr、BUN水平和腎臟組織LC3-Ⅱ蛋白表達水平的比較

與sham組比較,DI/R組和DI/R+P組大鼠血清Scr、BUN水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),腎臟組織LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.05);DM+sham組與sham組比較腎臟組織LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.05),而兩組大鼠血清Scr和BUN水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與DM+sham組比較,DI/R組和DI/R+P組大鼠血清Scr、BUN水平升高(P<0.05),腎臟組織LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高(P<0.05);與DI/R組比較,DI/R+P組大鼠血清Scr、BUN水平降低,LC3-Ⅱ蛋白表達水平降低(P<0.05,見表1和圖2)。

表1 各組大鼠血清Scr、BUN和腎臟組織LC3-Ⅱ表達水平的比較

圖2 Westernblot檢測大鼠腎臟組織中LC3-Ⅱ的表達Figure 2 Expression of LC3-Ⅱ in renal tissue of rats by Western blot

3 討論

腎臟是微循環(huán)極為豐富的器官,且具有較大的能量需求,對IRI極為敏感,而DM可加重腎臟IRI[4]。本研究結(jié)果表明,DI/R組和DI/R+P組較sham組血清Scr和BUN水平升高,病理性損傷加重,說明缺血再灌注對大鼠腎臟造成了一定程度的損傷。既往研究表明,靜脈麻醉藥丙泊酚對正常大鼠腎臟IRI具有保護作用[11],在DM大鼠中是否也有相同保護作用尚未得到證實。本研究觀察了其對DM大鼠腎臟IRI的作用,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),DI/R+P組經(jīng)過丙泊酚輸注處理后血清Scr和BUN水平較DI/R組降低,腎臟病理學損傷減輕,說明丙泊酚可減輕DM大鼠腎IRI。

自噬作為生物體內(nèi)普遍存在的一種防御性機制,生理條件下,自噬的順利進行有利于維持細胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài),進而保障人體各項生命活動的順利進行。但細胞遭到強刺激時可引起自噬過度,從而使組織細胞損傷加重,甚至引起細胞死亡[6]。研究發(fā)現(xiàn),DM患者體內(nèi)存在胰島素抵抗和胰島素分泌不足,可能會導致對自噬的抑制作用減弱,且DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與其體內(nèi)存在的過度自噬有關(guān)[12],我們的實驗結(jié)果也證實了這一點。本研究測定了反映自噬水平的微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)的水平,研究結(jié)果表明,DM+sham組相比sham組LC3-Ⅱ蛋白表達增高,但兩組的血清Scr和BUN水平卻無差異,因兩組均為假手術(shù)組,DM病程短,其導致的腎臟損害遠較缺血再灌注引起的對腎的損傷輕微。而缺血再灌注的過程同樣會導致自噬的增強從而發(fā)生細胞損傷[13]。本研究結(jié)果表明,DI/R+P組和DI/R組LC3-Ⅱ蛋白表達較兩個假手術(shù)組均上調(diào),證明了自噬在參與糖尿病腎IRI中的重要作用。

丙泊酚因其具有起效快、半衰期短、不良反應(yīng)少等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。且丙泊酚具有與抗氧化劑丁化羥基甲苯以及內(nèi)源性抗氧化劑α-生育酚相似的化學結(jié)構(gòu),其被證實對人體和大鼠器官具有明顯的保護作用[14,15],丙泊酚在細胞自噬的發(fā)生中也具有重要的調(diào)控作用[16]。本研究研究結(jié)果表明,DI/R+P組較DI/R組LC3-Ⅱ蛋白表達水平下調(diào),推測丙泊酚可能通過降低DM腎缺血再灌注時LC3-Ⅱ蛋白的表達水平,而發(fā)揮其對DM大鼠的腎保護作用。這也表明丙泊酚可以用于臨床麻醉中預(yù)防糖尿病患者腎臟IRI。然而,腎IRI的機制是復(fù)雜的。有研究認為炎癥、細胞內(nèi)MAPK通路、激活KATP通道等信號通路也參與了腎IRI[17],丙泊酚是否可以直接或間接地影響這些途徑尚有待研究。

綜上所述,丙泊酚可減輕DM大鼠腎IRI,其機制可能與丙泊酚抑制DM機體細胞內(nèi)過度自噬有關(guān)。