曾端香，王蓮英

（1國家林業(yè)和草原局管理干部學(xué)院，北京 102600；2北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083）

0 引言

牡丹(Paeonia suffruticosa)以花朵碩大、花型多姿、花色豐富而顯雍容華貴、富麗端莊，被譽為“國香天色”，明清時期為國花，至今仍受國人推崇，為中國十大名花之一[1]。隨著育種技術(shù)的發(fā)展，牡丹芍藥組間雜交后代品種（統(tǒng)稱Itoh雜種）優(yōu)勢顯著，它們不僅集中了雙親的優(yōu)點，而且多數(shù)品種還具有宜人的香味，被稱為“牡丹芍藥的未來”，組間雜交為牡丹芍藥育種開創(chuàng)了一條新途徑，所以牡丹雜交育種及胚培養(yǎng)技術(shù)將是解決牡丹新優(yōu)品種擴繁的有效途徑[2]。

組織培養(yǎng)已經(jīng)成為園藝園林植物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)和快速繁殖苗木的主要形式。但牡丹組培中仍存在組培苗生根難、褐化和玻璃化現(xiàn)象嚴重、移栽階段植株感病嚴重和死亡率高等問題[3-5]，成為牡丹組培的瓶頸。因為組織培養(yǎng)是在無菌條件下進行的，種苗與菌根真菌接觸的機會大為減少，甚至到了苗圃馴化培育階段也還常得不到菌根真菌的幫助，導(dǎo)致苗木生長狀況較差，抵抗力較弱，成活率較低[6]。已有研究通過牡丹胚培養(yǎng)解決組培中褐化和縮短繁育周期，取得了一定進展[2,7-8]。

AM真菌（簡稱AMF）的主要功能之一是改善植物的礦質(zhì)營養(yǎng)，被譽為“生物肥料”。AM真菌能顯著增加植物對土壤中P、Zn、Cu的吸收，對N、K、Mg、S、Mn等的吸收也有促進作用[9-13]。不同氮肥用量條件下、小麥秸稈存在與否，AM真菌均能夠改善玉米根系特性，增強氮素吸收能力，改善穗部性狀，增加玉米籽粒產(chǎn)量[14]，接種AM真菌可以提高草莓對氮、磷、鉀、鈣等礦質(zhì)元素的吸收，從而緩解復(fù)合鹽脅迫對草莓的傷害[15]。曾端香等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)AM真菌能顯著改善‘鳳丹’菌根化容器苗對礦質(zhì)元素的吸收，3種AM真菌接種劑量均提高了‘鳳丹’容器苗P、K、Ca、Mg、Fe的增長，對N、Zn的增長不明顯，但降低了Mn的含量；Gg+Gm混合接種劑對N、P、Ca、Mg、Fe含量升高顯著地高于其他處理。Pieriek[18]認為，向根際引入有益微生物是克服組培苗逆境脅迫的一種重要機制，盡早對組培苗進行高效菌根真菌的人工接種，實現(xiàn)種苗菌根化，能減輕移栽對組培苗造成的脅迫，在移栽或定植后發(fā)揮功能。

筆者對牡丹新優(yōu)雜交系種子進行胚培養(yǎng)，得到胚根苗無菌體系，篩選胚培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組合，對胚根苗進行AM真菌接種獲得菌根化組培苗，探索AM真菌對牡丹組培苗生長發(fā)育和礦質(zhì)元素吸收的影響，從而進一步研究AM真菌影響牡丹組培苗生長發(fā)育的作用機理，以期為AM真菌在牡丹組培中的應(yīng)用和牡丹組培快繁工廠化育苗提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為采自牡丹芍藥育種基地（河南）的珍稀及急需擴繁保存的牡丹遠緣雜交系種子，雜種系單株代號為‘Z1-10-3’（花色橘紅）、‘Z1-WM’（花色紅紫）。接種的AM真菌菌種由北京市農(nóng)林科學(xué)院中國AM真菌種質(zhì)資源庫(BGC)提供；菌種1#為Glomus geosporum，BGC 507(GZ-01)；菌 種 2#為Glomus mosseae，BGC(XJ-01)。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹組培苗瓶內(nèi)接種AM真菌試驗 采用董昌金[19]的差別滅菌法進行AMF孢子表面滅菌，然后分別對牡丹組培苗進行瓶內(nèi)接種AMF。每瓶接種4～6個孢子，每處理15～20瓶，重復(fù)3次；以不接種AM真菌為對照(CK)。每周觀察統(tǒng)計1次AM真菌孢子侵染、萌發(fā)情況，以及組培苗生長情況。

1.2.2 牡丹胚根苗AM真菌侵染指標(biāo)測定和菌根結(jié)構(gòu)觀測

（1）墨水醋染色法制片。①固定取根。洗凈，將根剪成1 cm長根段，F(xiàn)AA(formation glacial ascetic and ethand)液固定。②透明。洗去FAA液，將根放在10%的KOH中，水浴鍋90℃加熱1 h，或30～32℃室溫（恒溫箱）放置；倒去KOH，清水漂洗數(shù)次，至水中不呈黃色。③軟化。清洗后的根中加入堿性雙氧水，室溫下至根軟化；倒去堿性雙氧水，清水漂洗（較老和深色根系采用此步驟；幼嫩根系此步驟可省去）。④染色。透明后用墨水醋在電熱板上煮開3 min染色。⑤脫色。用自來水（加幾滴醋酸化）沖洗至少20 min；⑥制片。將小塑料瓶中染色、分色后的根段倒入培養(yǎng)皿中，將根段分散均勻，隨機選取30條根段，分別排放在載玻片上，滴加30%的甘油1滴，加蓋蓋玻片。

（2）觀測。在Olympus顯微鏡100～400倍下觀察各制片中根段菌根的侵染情況，根據(jù)每條根系菌根結(jié)構(gòu)按表1分級標(biāo)準(zhǔn)記錄。

表1 菌根侵染分級標(biāo)準(zhǔn)

（3）計算。菌根侵染率(F)計算如式(1)，菌根侵染強度(M)計算如式(2)。

式中，n5表示5級侵染的根段數(shù)，n4表示4級侵染的根段數(shù)，n3表示3級侵染的根段數(shù)，以此類推。

1.2.3 牡丹菌根化組培苗礦質(zhì)營養(yǎng)元素的測定 全N采用凱氏定氮法測定，全P采用釩鉬黃比色法測定，K、Ca、Mg、Zn、Cu、Mn等礦質(zhì)元素采用原子吸收光譜法測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用DPS專業(yè)版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，并采用Duncan進行多重比較，采用SPSS 21進行方差分析、Excel 2019進行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種AM真菌牡丹胚培養(yǎng)胚根苗菌根侵染情況

由表2可知，‘Z1-WM’、‘Z1-10-3’組培苗瓶內(nèi)接種AM真菌均能實現(xiàn)侵染，而未接種的對照均沒有侵染；對于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率(95.96%)和侵染強度(33.33)極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg、Gm和CK，Gg的侵染率(90.78%)和侵染強度(28.45)極顯著大于Gm和CK。對于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接種的侵染率(93.12%)極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，同時Gm的侵染率(89.87%)極顯著(P=0.01)高于Gg的侵染率(65.45%)；Gg+Gm的侵染強度最高為31.23，但與Gm之間沒有顯著差異，但均極顯著高于Gg和對照。不同品種對接種AM真菌的侵染反應(yīng)不同，這與菌根真菌對宿主植物具有一定的選擇性有關(guān)[9]。

表2 瓶內(nèi)接種不同種類的AMF對雜交系牡丹組培苗菌根侵染統(tǒng)計分析

2.2 AM真菌對牡丹組培苗礦質(zhì)元素N、P、K吸收的影響

圖1表明，AM真菌接種劑對牡丹‘Z1-10-3’的礦質(zhì)元素N、P、K的相對含量值均比對照有顯著提高，以P的含量增幅最大，Gg+Gm、Gg和Gm處理的P含量分別是對照的1.634、1.582、1.272倍；其次是K的含量，其變化趨勢與N含量變化趨勢一致，增幅略高于N含量。

圖1 AMF對牡丹‘Z1-10-3’組培苗礦質(zhì)元素N、P、K相對含量的影響

不同種類的AM真菌接種劑對牡丹組培苗N、P、K含量的影響效果不同，接種Gg+Gm的組培苗的N含量是對照CK的1.472倍，顯著高于單一接種劑Gg和Gm，但這兩者之間沒有顯著差異；P含量是對照CK的1.634倍，顯著高于Gm處理，但與Gg處理之間沒有顯著差異；K含量是對照CK的1.473倍，顯著高于Gg。Gg處理的N、P、K含量與對照相比增長率分別為29.2%、58.2%、38.0%。Gm處理的N、P、K含量與對照相比增長率分別為34.0%、27.2%、45.3%。AM真菌改善了牡丹組培苗的N、P、K的吸收，從而提高了其生長量，與生長量的提高呈現(xiàn)正相關(guān)。

研究表明，AM真菌可以通過合成谷氨酰胺的途徑同化NH4+，為根外菌絲直接吸收銨提供了依據(jù)，從而促進了N的吸收；菌根菌絲能夠吸收和利用NH4+-N[20]；Ho 等[21]發(fā)現(xiàn)，Glomus mosseae的孢子能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而且菌根植物地上部和根系中硝態(tài)氮還原酶的數(shù)量和活性都較無菌根植物高，說明菌根植物有同化利用硝酸鹽的能力。AM真菌龐大的菌絲網(wǎng)在吸收養(yǎng)分的同時也吸收和儲存了水分，它將根際土壤中的磷和其他礦質(zhì)元素、水分等吸收傳遞給宿主植物，從而達到互惠共生關(guān)系，菌根促進植物生長，它能增加難移動養(yǎng)分特別是磷的吸收。

2.3 AM真菌對牡丹組培苗礦質(zhì)元素Ca、Mg吸收的影響

從圖2可知，Gg+Gm顯著提高了牡丹‘Z1-10-3’組培苗的Ca含量，是對照的1.21倍，顯著高于Gg和CK，但與Gm處理之間沒有顯著差異，Gg對Ca含量增加亦不顯著。AM真菌降低了Mg的含量，以混合接種劑Gg+Gm降低的幅度最小，但與單一接種劑Gg、Gm之間沒有顯著性差異。

圖2 AMF對牡丹‘Z1-10-3’組培苗礦質(zhì)元素Ca、Mg相對含量的影響

有研究表明，蘋果幼苗接種AM真菌首先提高了根K、Ca和Mg的含量，隨后地上部分這些元素的含量也顯著高于對照[22]。凡是發(fā)生矮化的桃樹，其菌根發(fā)育極差，葉片的K、Ca和Mg水平也低。但也有研究者指出，AM真菌不影響植物體內(nèi)Ca和Mg的含量甚至降低這些元素的含量。Granger[23]將蘋果鉆木組培苗即試管苗接種Glomus versiforme，對葉片的Ca、Mg和Zn含量無影響。Bartschi比較了葡萄菌根根系與非菌根根皮層細胞內(nèi)礦質(zhì)元素的分布，認為菌根真菌對K、Mg、Ca和Na的影響極小[9]。

AM真菌對植物的Ca和Mg含量影響不一致的原因可能是試驗的立地條件、AM真菌與植物種類的不同以及大多數(shù)分析結(jié)果來自植物不同器官。事實上，菌絲吸收的礦質(zhì)養(yǎng)分只有通過真菌-根表面，從菌絲體進入到寄主植物根部再從根部運輸?shù)降厣喜浚拍軐闹髦参锏臓I養(yǎng)狀況和植株生長產(chǎn)生促進作用[9]。

2.4 AM真菌對牡丹組培苗礦質(zhì)元素Fe、Mn和Zn吸收的影響

圖3反映了AM真菌對牡丹組培苗的Fe、Mn和Zn含量的變化規(guī)律。AM真菌顯著提高了Fe的含量，接種Gg+Gm的牡丹組培苗Fe含量是對照的1.312倍，高于單一接種劑，Gg和Gm處理的Fe含量分別是對照的1.263和1.250倍，但三者間無顯著差異；不同的AM真菌處理的Zn含量基本保持略微有所增加，但差異不顯著；AM真菌卻顯著地降低了Mn的含量。

圖3 AMF對牡丹‘Z1-10-3’組培苗礦質(zhì)元素Fe、Mn和Zn相對含量的影響

AM真菌對植物礦質(zhì)元素的吸收、利用與土壤中的P、Cu、Zn等元素存在著一定的相互關(guān)系，在含磷量過多的土壤里植物吸收的Cu和Zn反而減少，甚至?xí)霈F(xiàn)缺素癥狀，可能由于P的含量大量增加導(dǎo)致了Zn的增長不明顯，一般以土壤含磷量中等水平下的AM真菌吸收Cu、Zn等微量元素最高[24]。AM真菌對土壤中因重金屬的存在而形成對植物的危害也具有明顯的抗御能力，在介質(zhì)中重金屬過量的情況下AM真菌的侵染常能減少宿主對其吸收，從而增強植物的抗性。研究表明，真菌能減輕植物在重金屬上壤中的受害程度，在Mn含量高出15倍的土壤中接種AM真菌后，不但提高了植物對Mn的抗性，而且促進了植物的生長，菌根具有較強的絡(luò)合重金屬能力，當(dāng)上壤中重金屬含量過高時菌根可增強宿主植物對這些重金屬離子的耐受性，從而減輕植物遭受重金屬污染的程度[25-26]。

研究結(jié)果表明，對牡丹組培苗而言，礦質(zhì)元素Zn、Mg和Mn的含量與生長規(guī)律并不完全一致，即營養(yǎng)生長較好，部分礦質(zhì)元素含量不一定高，可能原因包括：（1）隨著生長量的增加，由于“稀釋效應(yīng)”使其部分礦質(zhì)元素濃度持平或呈下降趨勢；（2）對部分礦質(zhì)元素，不同菌種的敏感性不同；（3）某些礦質(zhì)元素間可能存在拮抗作用[27]。

3 結(jié)論與討論

AM真菌能顯著促進牡丹菌根化組培苗的生長與發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)對雜交系牡丹胚培養(yǎng)的胚根苗在瓶內(nèi)接種3種不同的AM真菌，其侵染率和侵染強度均具有顯著的影響，這為牡丹菌根化苗的培養(yǎng)提供了參考依據(jù)。

AM真菌顯著提高了牡丹組培苗的N、P、K的含量，其中以Gg+Gm混合接種劑增效作用最強。接種Gg+Gm的N含量比對照增長了47.2%，P含量比對照增長了63.4%，K含量比對照增長了47.3%；Gg處理的N、P、K的增長率分別為29.2%、58.2%和38.0%；而Gm處理的N、P、K的增長率分別為34.0%、27.2%和45.3%。與文紀(jì)鑾等[28]對組培非洲菊幼苗接種Glomus屬菌種以后，菌根苗根部含P量高，接種Glomus etuncatum的枝條K含量明顯增加一致。AM真菌顯著提高了牡丹組培苗Ca、Fe的含量，對Zn的增加不明顯，保持略微有所增加，但降低了Mg、Mn的含量。

本研究發(fā)現(xiàn)3種不同的AM真菌接種劑均顯著地促進了牡丹組培苗的礦質(zhì)元素N、P、K、Ca、Fe的吸收。Gnekow等[29]研究發(fā)現(xiàn)AM真菌能顯著增加蘭科、杜鵑科植物對土壤中P、Zn、Cu的吸收，對N、K、S、Mg等的吸收也有一定的促進作用，本研究結(jié)果與其有一致的地方，但與其中AM真菌對Mg、Mn元素的作用結(jié)論相反，接種AM真菌降低了牡丹組培苗對Mg、Mn的吸收。

對于AM真菌的作用機理，有研究認為通過改變宿主植株的根系形態(tài)和菌絲網(wǎng)絡(luò)的形成，擴大植株對養(yǎng)分吸收范圍；釋放有機酸、磷酸酶和質(zhì)子等根系分泌物改變土壤結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，與根際微生物共同作用降解土壤中難溶性磷酸鹽；誘導(dǎo)相關(guān)磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的特異性表達，提高植株對磷的轉(zhuǎn)運能力而促進其吸收[30]。由于P在土壤中移動性較小，磷酸鹽擴散較慢，而根毛長度一般不超過1 mm，因此，一般植物根際磷虧缺區(qū)小于2 mm，而菌絲可以伸展到根外8 cm的空間吸收磷，這是宿主植物的根所無法達到的；而叢枝真菌菌絲可以從土壤溶液中直接吸收磷酸鹽離子，并提供給宿主植物。鉀是植物需量最大的元素之一，在土壤中的移動性雖比磷強，但在一般生長條件下往往在根吸收的周圍能很快形成一個虧缺區(qū)，土壤供鉀水平不能滿足植物生長的需要時菌絲可以到鉀虧缺區(qū)外吸收根系吸收不到的鉀并運輸給植物，對改善植物的鉀營養(yǎng)有一定作用[31]。未來可以擴大牡丹供試區(qū)域品種，深化AM真菌機理研究。