姜莉莉，郭騰達(dá)，宮慶濤，武海斌，孫瑞紅

（山東省果樹(shù)研究所，山東泰安 271000）

0 引言

桃(Prunus persica)屬薔薇科李屬植物，其果實(shí)肉質(zhì)鮮美，富含多種維生素和微量元素，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是全球廣泛栽培的重要核果類果樹(shù)之一[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)桃栽培面積和果品產(chǎn)量穩(wěn)步上升[2]。桃是山東省第二大水果樹(shù)種，產(chǎn)量和面積均居全國(guó)首位，已成為蒙陰等地重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)[3]。‘秋彤’是從美國(guó)引入的晚熟硬溶質(zhì)桃品種，于2014年通過(guò)山東省林木品種審定委員會(huì)審定。該品種果實(shí)大、絨毛短、色澤艷、風(fēng)味甜、耐儲(chǔ)運(yùn)，適于在山東及鄰近產(chǎn)區(qū)栽培[4]。

由于部分地區(qū)栽培管理技術(shù)落后以及苗木跨區(qū)引入等原因，桃樹(shù)病害發(fā)生嚴(yán)重，據(jù)報(bào)道影響桃生產(chǎn)的病原菌多達(dá)90多種[5]。桃樹(shù)瘡痂病是由半知菌亞門(mén)黑星孢屬嗜果枝孢菌(Cladosporium carpophilum)侵染引起，使病果產(chǎn)生“龜裂”現(xiàn)象[6]。桃褐腐病可由3種鏈核盤(pán)菌屬(Monilinia)真菌侵染引起，分別為M.fructicola、M.laxa和M.fructigena，引起果實(shí)腐爛，又稱“果腐病”[7]。桃樹(shù)炭疽病病原為炭疽菌Colletotrichum，包括C.gloeosporioides、C.acutatum和C.truncatum，主要侵染果實(shí)和枝干，病果出現(xiàn)同心環(huán)狀皺縮[8]。桃樹(shù)黑斑病病原為鏈格孢屬真菌(Alternaria alternata)，主要危害果實(shí)桃尖。桃細(xì)菌性穿孔病由黃單胞菌(Xanthomona campestris)侵染引起，主要危害葉片，引起裂紋和穿孔[9]。桃樹(shù)流膠病發(fā)病原因復(fù)雜，葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)是侵染性流膠病的最主要病原菌[10]。桃白粉病的病原菌包括三指叉絲單囊殼菌(Podosphaera tridactyta)和桃單殼絲菌(Sphaerotheca pannosa)，主要危害幼苗葉片[11]。桃軟腐病由接合菌亞門(mén)匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)侵染引起，主要發(fā)生在果實(shí)成熟及儲(chǔ)運(yùn)期。

當(dāng)前對(duì)桃樹(shù)病原菌的研究多采用傳統(tǒng)方法，僅對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離鑒定，無(wú)法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行整體分析。高通量測(cè)序是近年來(lái)分析微生物多樣性的熱門(mén)技術(shù)，具有測(cè)序深度高、可鑒定低豐度物種信息等優(yōu)點(diǎn)，能夠更準(zhǔn)確地反映微生物的真實(shí)組成和分布[12]。本研究擬通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分析晚熟桃“秋彤”在萌芽期、花期、幼果期、硬核期、果實(shí)膨大期及成熟期不同部位的真菌和細(xì)菌群落組成及多樣性，為‘秋彤’桃的科學(xué)管理及病害節(jié)藥防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)選址于山東省臨沂市蒙陰縣垛莊鎮(zhèn)寶增果品專業(yè)合作社(118°7′8″E，35°34′1″N)，為山地果園，‘秋彤’為當(dāng)?shù)刂髟云贩N之一。隨機(jī)選取3個(gè)‘秋彤’種植地塊，每地塊為1個(gè)重復(fù)，面積不小于200 m2，每個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選取5株桃樹(shù)進(jìn)行取樣。

供采樣桃樹(shù)采用常規(guī)栽培管理，不套袋處理。2019年3月9日噴施80%代森錳鋅800倍液（陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國(guó)）有限公司）、0.15%梧寧霉素（武漢埃格瑞生物技術(shù)工程有限公司）600倍液和3.2%甲維鹽·氯氰微乳劑（海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）用于防治褐斑病、腐爛病和食心蟲(chóng)等；4月24日噴施30%苯甲·吡唑酯懸浮劑（上海生農(nóng)生化制品股份有限公司）3000倍液和40%毒死蜱水乳劑（陜西韋爾奇作物保護(hù)有限公司）2000倍液防治褐斑病、蚧殼蟲(chóng)和蚜蟲(chóng)等；5月19日噴施21%噻蟲(chóng)嗪懸浮劑（天津施普樂(lè)農(nóng)藥技術(shù)發(fā)展有限公司）4000倍液和25%滅幼脲懸浮劑（河北中天邦正生物科技股份公司）2000倍液防治蚜蟲(chóng)、食心蟲(chóng)和卷葉蛾等；7月5日噴施20%吡唑醚菌酯可濕性粉劑（海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）2000倍液和20%氟硅唑可濕性粉劑（海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）3000倍液防治炭疽病等；8月1日噴施40%唑醚·咪鮮胺水乳劑（陜西韋爾奇作物保護(hù)有限公司）2500倍液防治炭疽病等。

分別于2019年3月7日（萌芽期，germination stage，Ger）采集桃樹(shù)枝條(branch，Bran)和花蕾(bud)，于4月9日（花期，flower，F(xiàn)l）采集花朵(flower，F(xiàn)l)、枝條和葉片(leaf，Le)，于5月13日（幼果期，young fruit，Yo.Fr）、6月16日（硬核期，hardcore，Hard）、7月26日（果實(shí)膨大期，fruit growth，F(xiàn)r.Gr）和8月23日（成熟期，mature，Mat）采集果實(shí)(fruit，F(xiàn)r)、枝條和葉片。

以蘸有0.2 mol/L磷酸緩沖液的無(wú)菌拭子擦取枝條、葉片和果實(shí)表面的微生物，將拭子置于無(wú)菌離心管中，干冰保存送樣。將采集到的15枚桃花蕾和花朵分別置于25 mL無(wú)菌磷酸緩沖液中，50 Hz超聲處理20 min后取出花蕾和花朵，浸提液以0.22 μm濾膜過(guò)濾后，將濾膜置于無(wú)菌離心管，干冰保存送樣[13]。真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高通量分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司代理完成。

1.2 測(cè)序分析

采用CTAB方法提取樣本的基因組DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，使用無(wú)菌水將樣本DNA濃度調(diào)整至1 ng/μL。

以上述基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異性引物和Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中16SV4區(qū)引物為515F和806R，ITS1區(qū)引物為ITS1-1F-F和ITS1-1F-R。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，根據(jù)濃度進(jìn)行等量混樣，以1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳進(jìn)行純化，以GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)回收產(chǎn)物。

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(Thermofisher)構(gòu)建文庫(kù)，經(jīng)過(guò)Qubit定量和檢測(cè)合格后，進(jìn)行Ion S5TMXL(Thermofisher)上機(jī)測(cè)序。

1.3 高通量數(shù)據(jù)分析

對(duì)reads進(jìn)行低質(zhì)量剪切，截去Barcode和引物序列，去除嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)。以Uparse(7.0.1001)軟件對(duì)各樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，將一致性高于97%的序列聚類為OTUs，選取頻數(shù)最高的序列作為代表性序列。用Mothur方法與SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析，獲得分類學(xué)信息，并分別在界、門(mén)、綱、目、科、屬和種7個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。以數(shù)據(jù)量最少的樣本為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，并以此進(jìn)行后續(xù)的α-多樣性分析（Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree指數(shù)）和β-多樣性分析（NMDS和LEfSe分析）。

使用 Qiime軟件計(jì)算 Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage和PD_whole_tree指數(shù)，使用R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線和NMDS圖，使用LEfSe軟件進(jìn)行LEfSe分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣本測(cè)序深度與數(shù)據(jù)質(zhì)控

由圖1可以看出，隨著測(cè)序深度的增加，各樣本的稀釋曲線末端均逐漸趨于平緩，表明測(cè)序基本飽和，當(dāng)前測(cè)序深度能夠體現(xiàn)各樣本的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成。

圖1 桃不同物候期各部位樣本的16S和ITS稀釋曲線

2.2 ‘秋彤’桃不同物候期細(xì)菌和真菌的α-多樣性指數(shù)比較

由表1可以看出，對(duì)細(xì)菌而言，‘秋彤’桃萌芽期花蕾、花期枝條和葉片、幼果期枝條和葉片的Shannon指數(shù)顯著低于硬核期、果實(shí)膨大期和成熟期各部位；萌芽期花蕾和花期葉片的Simpson指數(shù)均低于硬核期、果實(shí)膨大期和成熟期各部位；萌芽期花蕾、花期葉片、幼果期和成熟期葉片的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均低于其他處理。對(duì)于真菌而言，花期和幼果期各部位的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均高于硬核期；幼果期各部位Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于其他時(shí)期。

表1 桃不同物候期細(xì)菌和真菌的α-多樣性指數(shù)

續(xù)表1

2.3 ‘秋彤’桃不同物候期、部位的細(xì)菌、真菌NMDS分析

由圖2～3可以看出，桃同一物候期不同部位的細(xì)菌、真菌NMDS距離較近，不同物候期間距離較遠(yuǎn)，表明‘秋彤’桃樹(shù)體表面的細(xì)菌、真菌受物候期影響較大，受部位影響較小。

圖2 桃不同物候期、部位的細(xì)菌NMDS分析

圖3 桃不同物候期、部位的真菌NMDS分析

2.4 同一部位不同物候期的細(xì)菌相對(duì)豐度比較

分析‘秋彤’桃花期、幼果期、果實(shí)膨大期和成熟期葉片細(xì)菌差異（圖4）發(fā)現(xiàn)，成熟期的拜葉克林氏菌和甲基桿菌相對(duì)豐度顯著提高，果實(shí)膨大期的鞘脂桿菌、馬賽菌、丙型變形菌和伯克氏菌相對(duì)豐度顯著降低，其他時(shí)期未發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度差異顯著的細(xì)菌。

圖4 桃葉片不同物候期差異顯著的細(xì)菌

分析‘秋彤’桃花蕾和花朵的細(xì)菌差異（圖5）發(fā)現(xiàn)，花蕾的藍(lán)藻細(xì)菌的相對(duì)豐度顯著提高，花朵的腸桿菌、放線菌、擬桿菌、青枯菌、不動(dòng)桿菌、莫拉氏菌、伯克氏菌、丙型變形菌、假單胞菌和變形菌的相對(duì)豐度顯著降低。

圖5 桃花朵和花蕾差異顯著的細(xì)菌

分析‘秋彤’桃枝條不同物候期細(xì)菌差異（圖6）發(fā)現(xiàn)，幼果期藍(lán)藻細(xì)菌相對(duì)豐度較高，成熟期變形菌、鞘脂單胞菌、甲基桿菌和馬賽菌相對(duì)豐度較高，硬核期立克次氏體、沃特氏菌和青枯菌相對(duì)豐度較高，萌芽期根瘤菌、拜葉林克氏菌、甲基桿菌、放線菌、擬桿菌、微球菌、短小桿菌、氣單胞菌、噬纖維菌、薄層菌和黃色單胞菌相對(duì)豐度較高，果實(shí)膨大期泛菌和蜂窩囊菌相對(duì)豐度較高。

圖6 桃枝條不同物候期差異顯著的細(xì)菌

分析‘秋彤’桃果實(shí)不同物候期細(xì)菌差異（圖7）發(fā)現(xiàn)，幼果期藍(lán)藻細(xì)菌相對(duì)豐度較高，成熟期變形菌、根瘤菌、鞘脂單胞菌、微球菌、微桿菌、短小桿菌、擬桿菌、噬纖維菌、柄桿菌、薄層菌、短波單胞菌、生絲單胞菌、動(dòng)孢囊菌、動(dòng)球菌、螺狀菌和氣單胞菌相對(duì)豐度較高，硬核期馬賽菌、紅桿菌和副球菌相對(duì)豐度較高，果實(shí)膨大期立克次氏體、黃桿菌和泛菌相對(duì)豐度較高。

圖7 桃果實(shí)不同物候期差異顯著的細(xì)菌

2.5 同一部位不同物候期的真菌相對(duì)豐度比較

分析‘秋彤’桃葉片不同物候期真菌差異（圖8）發(fā)現(xiàn)，幼果期錘舌菌和白粉菌相對(duì)豐度較高，成熟期外擔(dān)菌相對(duì)豐度較高，果實(shí)膨大期枝孢菌相對(duì)豐度較高，花期糞殼菌、擔(dān)子菌、赤霉菌、擬盤(pán)多毛孢、銀耳目和酵母菌相對(duì)豐度較高。

圖8 桃葉片不同物候期差異顯著的真菌

分析‘秋彤’桃花朵和花蕾的真菌差異（圖9）發(fā)現(xiàn)，花蕾的座囊菌、短梗霉菌、銀耳和擔(dān)孢酵母的相對(duì)豐度顯著提高，花朵的炭角菌、子囊菌、擔(dān)子菌、擬盤(pán)多毛孢、角擔(dān)菌、雞油菌和傘菌相對(duì)豐度顯著降低。

圖9 桃花朵和花蕾差異顯著的真菌

分析‘秋彤’桃枝條不同物候期真菌差異（圖10）發(fā)現(xiàn)，成熟期外擔(dān)菌和赤霉菌相對(duì)豐度較高，硬核期座囊菌、鏈格孢菌、子囊菌、附球菌和亞隔孢殼菌相對(duì)豐度較高，萌芽期枝孢菌相對(duì)豐度較高，花期擔(dān)子菌、傘菌、雞油菌、子囊菌、擬盤(pán)多毛孢和酵母相對(duì)豐度較高。

圖10 桃枝條不同物候期差異顯著的真菌

分析‘秋彤’桃果實(shí)不同物候期真菌差異（圖11）發(fā)現(xiàn)，成熟期擔(dān)子菌相對(duì)豐度較高，硬核期座囊菌、腔菌、子囊菌和鏈格孢菌的相對(duì)豐度較高。

圖11 桃果實(shí)不同物候期差異顯著的真菌

3 結(jié)論與討論

高通量測(cè)序技術(shù)可靈敏地檢測(cè)到低豐度、不可培養(yǎng)的物種信息，能夠更全面客觀地揭示目標(biāo)微生物群落結(jié)構(gòu)，已成為現(xiàn)階段研究微生物群落結(jié)構(gòu)的重要手段[14]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了‘秋彤’桃不同物候期、部位的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，得到了3968663條細(xì)菌clean reads，屬于539個(gè)屬；以及4020830條真菌clean reads，屬于334個(gè)屬。

α-多樣性主要表征局域生境下的物種數(shù)目，也被稱為生境內(nèi)的多樣性[15]。其中Shannon指數(shù)關(guān)注樣品中的分類總數(shù)和每個(gè)分類所占的比例，用于表征物種的多樣性和均勻性。Simpson指數(shù)用于評(píng)估常見(jiàn)物種優(yōu)勢(shì)度[16]。Chao1和ACE指數(shù)可表征群落物種豐度，其中Chao1能夠較好地反映群落中低豐度物種的存在，ACE能夠反映群落總體情況[17]。牛世全等[18]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析河西走廊地區(qū)鹽堿土壤的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)原生鹽堿土的Shannon指數(shù)最小，表明其微生物多樣性低。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于細(xì)菌，‘秋彤’桃萌芽期和幼果期各部位的Shannon和Simpson指數(shù)均低于硬核期、果實(shí)膨大期和成熟期各部位，表明后期的細(xì)菌多樣性高于前期；花期和成熟期葉片的Chao1和ACE指數(shù)均較低，表明其物種豐度較低；對(duì)于真菌，花期和幼果期各部位的Shannon和Simpson指數(shù)均高于硬核期，表明前期的真菌多樣性較高，幼果期各部位Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均高于其他時(shí)期，表明其真菌物種豐度較高。綜合比較可以發(fā)現(xiàn)，隨著‘秋彤’桃物候期的推移，各部位細(xì)菌多樣性提高，真菌多樣性降低，這可能與田間溫濕度條件變化、藥劑管理措施及微生物互作等有關(guān)。

NMDS（Non-Metric Multi-Dimensional Scaling，無(wú)度量多維尺度排序）分析是根據(jù)物種信息，將樣本以點(diǎn)的形式展示在二維平面上，克服了線性模型（PCA、PCoA等）的缺點(diǎn)，能夠更好地反映生態(tài)學(xué)信息[19]。路穎等[20]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了泰山不同造林樹(shù)種掉落物分解對(duì)細(xì)菌群落的影響，NMDS分析表明，細(xì)菌群落多樣性受掉落物化學(xué)性質(zhì)影響較大。葉雯等[21]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了不同種植年限香榧根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征，NMDS結(jié)果顯示，相同種植年限土壤真菌群落距離較近，不同種植年限之間能明顯分開(kāi)，表明其微生物群落結(jié)構(gòu)可隨種植年限的不同而發(fā)生明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，桃同一物候期不同部位的細(xì)菌、真菌NMDS距離較近，不同物候期間距離較遠(yuǎn)，表明‘秋彤’桃樹(shù)體表面的細(xì)菌、真菌受物候期影響較大，受部位影響較小。

農(nóng)事操作包括農(nóng)藥的使用對(duì)果樹(shù)微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大[22-23]。劉曉靜等[24]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析油桃和小白杏采后果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)泛菌屬(Pantoea)為優(yōu)勢(shì)菌群，其中菌株XAAS-P1是導(dǎo)致采后油桃和小白杏軟腐變質(zhì)的主要病原細(xì)菌。王柯等[25]通過(guò)高通量測(cè)序證實(shí)，苦參堿處理可以降低土壤腐皮鐮孢菌、層出鐮孢菌、串珠鐮孢菌和尖孢鐮孢菌的基因拷貝數(shù)，有效緩解平邑甜茶連作障礙。本研究詳細(xì)記錄了‘秋彤’桃各物候期的用藥情況，比較同一部位、不同物候期的細(xì)菌、真菌豐度發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)菌而言，花期花朵和硬核期枝條青枯菌豐度較高，萌芽期枝條和成熟期果實(shí)根瘤菌、噬纖維菌等豐度較高，果實(shí)膨大期枝條和果實(shí)泛菌等豐度較高。對(duì)真菌而言，幼果期葉片白粉菌豐度較高，果實(shí)膨大期葉片和萌芽期枝條枝孢菌（桃瘡痂病病原菌）豐度較高，花期葉片和成熟期枝條赤霉菌等豐度較高，硬核期枝條和果實(shí)鏈格孢菌（桃黑斑病病原菌）等豐度較高。由此可見(jiàn)，在現(xiàn)有管理模式下，晚熟桃‘秋彤’硬核期受黑斑病危害風(fēng)險(xiǎn)較高，硬核期和萌芽期受桃瘡痂病危害風(fēng)險(xiǎn)較高，生產(chǎn)中可使用苯醚甲環(huán)唑、多抗霉素等藥劑進(jìn)行防控。