趙妍秋，劉博，魏金花*，李臻*

（1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，延安 716000；2空軍軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，西安 710032；3中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，大同 037000）

正常的精子發(fā)生過程對于維持物種的繁衍穩(wěn)定至關(guān)重要，睪丸生精上皮是正常的精子發(fā)生過程的場所。精子的發(fā)生過程包括精原細(xì)胞的增殖分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的成熟。這些過程受到激素、旁分泌因子、基因和表觀遺傳調(diào)控因子等內(nèi)在因素的參與調(diào)控[1]，同時外界環(huán)境因素，例如輻射，重金屬和有害的化學(xué)物質(zhì)，以及不良生活習(xí)慣也會影響精子發(fā)生過程[2]。其中，環(huán)境溫度的變化對于精子的發(fā)生過程具有重要影響[3]。睪丸的溫度通常保持低于身體核心溫度2~6 ℃，當(dāng)睪丸溫度升高或機(jī)體體溫調(diào)節(jié)障礙時，導(dǎo)致精子生成減少[4]，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡和DNA損傷，影響精子質(zhì)量，造成雄性不育或者生育力降低[5]。

瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid receptor-1, TRPV1）是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)的熱敏通道，可以被高溫（＞43 °C）、細(xì)胞外酸性環(huán)境和辣椒素等配體激活[6]，并且這些因素可以協(xié)同促進(jìn)TRPV1活性[7]。TRPV1屬于非選擇性陽離子通道，對Na+和Ca2+有較高通透性，在口腔和皮膚等器官中參與炎癥和疼痛等過程[8]。除此之外，TRPV1在非感覺神經(jīng)元中有具有重要作用，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡和體內(nèi)多種生理病理過程[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)TRPV1在人和大鼠的前列腺、睪丸、陰莖和膀胱組織中有表達(dá)[10]，但其在小鼠睪丸中的具體細(xì)胞定位尚無系統(tǒng)研究。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）、蛋白免疫印跡、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光雙重染色技術(shù)，檢測TRPV1在小鼠睪丸發(fā)育階段和生精周期的表達(dá)，以及其在小鼠睪丸各生精上皮中的定位情況，為今后深入研究其在睪丸熱應(yīng)激中的功能與作用提供基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物

出生后 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、56 d SPF級C57小鼠各3只，體重（20±10）g成年小鼠20只，均購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2 主要試劑

RNA提取液Trizol plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeS-cript? RT reagent Kit和熒光定量試劑盒SYBR Primix Ex Taq II均購自日本Takara公司；定量PCR所用引物由武漢奧科生物技術(shù)有限公司合成；免疫組織化學(xué)染色試劑盒VECTASTAIN ABC Kit購自美國Vector Laboratories公司；兔抗TRPV1（ab31895）和鼠抗SYCP3（ab97672）購自Abcam公司；鼠抗SOX9(14-9765-95)購自美國Invitrogen公司；鼠抗PLZF（sc-28319）購自Santa Cruz公司；鼠抗β-actin（T0022）購自Affinity公司；山羊抗小鼠IgG（ZB-2305）購自中杉金橋；山羊抗兔IgG（SGA10002）購自AntiProtech公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠和TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Jackson ImmunoResearch 公司。

3 動物取材

小鼠脫頸處死，取一側(cè)睪丸用于提取RNA和蛋白，另一側(cè)睪丸固定于4%多聚甲醛（多聚甲醛4 g，PBS溶液100 mL，加熱攪拌溶解后用10 mmol/L NaOH溶液調(diào)pH為7.4），用于免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色。

4 總RNA提取

采用TRIzol法提取總RNA。收集的睪丸組織加入1 mL TRIzol溶液，充分吹打，冰上裂解5 min。加入0.2 mL氯仿，顛倒混勻，12000 r/min、4 ℃離心15 min；轉(zhuǎn)移上清到新Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻；-20 ℃冰箱放置30 min，13500 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清，加入1 mL 75%乙醇，顛倒混勻，13500 r/min、4 ℃離心10 min；棄上清，離心管開蓋室溫放置直至液體完全揮發(fā)；加入適量DEPC水，溶解RNA沉淀。Nano-Drop-2000分光光度計測定RNA純度和濃度，取吸光度A260/A280=1.8~2.0的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

5 逆轉(zhuǎn)錄PCR

瓊脂糖凝膠電泳法檢測：用PrimeScript? RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行RT-PCR。10 μL基因組DNA去除反應(yīng)體系如下：2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，2 μg RNA，RNase Free dH2O 定容；反應(yīng)條件42 °C，2 min。20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：4 μL 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time），1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，10 μL上一步反應(yīng)液，4 μL RNase Free dH2O；反應(yīng)條件：37 °C 15 min，85 °C 5 s。以 cDNA 為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃5 min，94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，72 ℃ 延伸 10 min，第二步至第4步35個循環(huán)；TRPV1上游引物為：5’-TCTGCTGGAATCCTCGGGTGTAG-3’，下游引物為：5’-CATGCTGGTGTCTGTGGTACTGTAC-3’，預(yù)計產(chǎn)物大小為118 bp；β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物為 5’-GGTGGGAATGGGTCAGAAGG-3’，下游引物為 5’-GTACATGGCTGGGGTGTTGA-3’，預(yù)計產(chǎn)物大小268 bp。使用含有DNA-red核酸染料（IC-6009，CellProTM）的 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)時熒光定量PCR（q-PCR）檢測：使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系如下：10 μL SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2×)，0.8 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)，0.8 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L)，2 μL cDNA，6.4 μL RNase Free dH2O。反應(yīng)條件為 95 ℃ 3 min（1 cycle）；95 ℃5 s，60 ℃ 30s（40 cycle）。通過分析擴(kuò)增曲線和融解曲線確定PCR擴(kuò)增的成功性，根據(jù)得到的CT值，運(yùn)用2-△△CT公式計算TRPV1 mRNA在各組中的相對表達(dá)量。

6 蛋白免疫印跡

用含苯甲基磺酰氟（終濃度1 mmol/L）的RIPA裂解液將收集的睪丸組織中充分裂解，離心得到蛋白樣品；SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，再電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h， TRPV1一抗4 °C孵育過夜，次日山羊抗兔IgG室溫孵育2 h，膜上滴加發(fā)光液（IC-8001, InCellGenE LLC, 美國）后，Clinx化學(xué)發(fā)光儀（ChemiScope 6000，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）對膜進(jìn)行掃描成像。

7 免疫組織化學(xué)染色

取睪丸用4%的多聚甲醛固定過夜，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片。將石蠟切片在二甲苯與梯度降乙醇復(fù)水后，在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）中微波修復(fù)抗原15 min，冷卻至室溫。PBS清洗后，入0.03%甲醇-0.3%過氧化氫中室溫孵育30 min；PBS清洗5 min×5次后滴加與二抗來源相同的正常血清室溫封閉30 min；抗TRPV1一抗4° C過夜孵育，次日切片取出復(fù)溫1 h，PBS清洗5 min×5次；滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育3 h，PBS清洗5 min×5次；ABC復(fù)合物孵育切片1 h，PBS清洗5 min×5次，DAB顯色；自來水沖洗切片，蘇木精復(fù)染1 min。切片脫水、透明、樹膠封片，用VS200玻片掃描儀（Olympus）成像、觀察結(jié)果。

8 免疫熒光雙重染色

將石蠟切片在二甲苯與梯度乙醇中復(fù)水，在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）中微波修復(fù)抗原15 min，冷卻至室溫。PBS清洗5 min×2次，正常血清封閉30 min，TRPV1一抗與SOX9、PLZF和SYCP3分別混合后，滴加到組織切片上，4 °C過夜孵育。次日切片取出復(fù)溫1 h，PBS清洗5 min×5次，TRITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG混合二抗室溫避光孵育3 h，PBS清洗5 min×5次。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞核進(jìn)行染色，用FV1000共聚焦顯微鏡（Olympu）觀察結(jié)果。

9 統(tǒng)計學(xué)分析

qPCR和Western blot結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行光密度值測量，使用GraphPad PRISM9進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 TRPV1在生后發(fā)育小鼠睪丸的表達(dá)變化

按照小鼠睪丸發(fā)育周期，提取7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和56 d的小鼠睪丸RNA和蛋白，應(yīng)用RTPCR和Western blot技術(shù)檢測TRPV1 mRNA和蛋白在小鼠睪丸不同發(fā)育周期的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TRPV1 mRNA在小鼠睪丸發(fā)育初期即表達(dá)，在出生后21 d時顯著增高，在28 d到達(dá)頂峰，之后隨著小鼠發(fā)育至成年逐漸下降（圖1A、B）。TRPV1蛋白在小鼠睪丸發(fā)育階段表達(dá)水平變化模式與mRNA一致（圖1C、D）。

圖1 TRPV1在7—56 d小鼠睪丸的表達(dá)水平檢測。A，TRPV1 mRNA代表性RT-PCR檢測結(jié)果；B，qPCR法檢測的TRPV1 mRNA水平的統(tǒng)計學(xué)分析；C，TRPV1蛋白水平的代表性免疫印跡檢測結(jié)果；D，免疫印跡檢測的TRPV1蛋白水平的統(tǒng)計學(xué)分析。與7 d組比較： *P＜0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001； n=3Fig.1 Detection of TRPV1 expression in the mouse testes during 7 d-56 d developmental stage.A, presentative RT-PCR detection results of TRPV1 mRNA; B, statistical analysis of TRPV1 mRNA level detected by qPCR; C, representative Western blot detection of TRPV1 protein level; D, statistical analysis of TRPV1 protein level detected by Western blot.Compared with 7 d group: *P＜ 0.05, **P＜ 0.01, ***P＜ 0.001; n=3

2 TRPV1在成年小鼠睪丸不同生精上皮周期的定位

為明確TRPV1在小鼠睪丸不同生精周期中的定位,我們利用免疫組織化學(xué)染色法觀察了TRPV1在成年小鼠睪丸不同生精周期的表達(dá)，使用IgG抗體處理組作為陰性對照。結(jié)果顯示TRPV1在生精上皮各個周期的生精細(xì)胞和支持細(xì)胞膜上都有表達(dá)，其中I-III期表達(dá)相對較弱，從IV期開始表達(dá)相對增強(qiáng)，并且在各級生精細(xì)胞中，初級精母細(xì)胞的表達(dá)相對較強(qiáng)（圖2）。

圖2 成年小鼠睪丸生精上皮周期中TRPV1表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測。黑箭，支持細(xì)胞； 白箭，精原細(xì)胞；黑箭頭，初級精母細(xì)胞；白箭頭，圓形精子細(xì)胞；曲尾箭，長型精子細(xì)胞。比例尺，20 μmFig.2 Immunohistochemical detection of TRPV1 expression in the seminiferous epithelia of the adult mouse testes.Black arrow, Sertoli cells; white arrow, spermatogonia; black arrow head, primary spermatocytes; white arrow head, round spermatid; curved tail arrow, elongated spermatid.Scale bar,20 μm

3 TRPV1在成年小鼠睪丸中的細(xì)胞定位

為進(jìn)一步明確TRPV1在生精小管的細(xì)胞定位，我們首先使用睪丸支持細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物SOX9與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果顯示TRPV1與睪丸支持細(xì)胞存在共定位（圖3A）。應(yīng)用精原干細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物PLZF與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，TRPV1同樣在PLZF陽性細(xì)胞上有表達(dá)（圖3B）。以減數(shù)分裂開始的標(biāo)志物SYCP3[11]作為精母細(xì)胞特異性的核標(biāo)志物與TRPV1進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)，TPV1與SYCP3陽性細(xì)胞也存在共表達(dá)（圖3C）。因此，TRPV1在睪丸支持細(xì)胞、精原細(xì)胞和精母細(xì)胞膜上均有表達(dá)。

圖3 TRPV1在成年小鼠睪丸生精上皮支持細(xì)胞（A）、精原細(xì)胞（B）和精母細(xì)胞（C）定位的免疫熒光雙標(biāo)檢測Fig.3 Double immunofluorescence staining for detecting the localization of TRPV1 in the Sertoli cell (A), spermatogonia (B) and spermatocyte (C) of the spermatogenic epithelia of the adult mouse testes

討 論

精子發(fā)生是一個高度復(fù)雜的過程，包括精原干細(xì)胞的分化、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子的變形等過程。小鼠的生精發(fā)育周期為8.6～8.9 d，從精原細(xì)胞發(fā)育至成熟精子細(xì)胞共需39～40 d[12]，精子的形成發(fā)生過程產(chǎn)生任何異常都有可能導(dǎo)致生精失敗。TRPV1作為熱敏蛋白，可以感受滲透壓、pH和電壓等外界刺激，可能參與調(diào)節(jié)精子各項(xiàng)功能，其在男性生殖中的作用需要進(jìn)一步研究探索。我們的研究系統(tǒng)的從TRPV1在小鼠睪丸的表達(dá)定位入手，為進(jìn)一步研究TRPV1在男性生殖系統(tǒng)中的功能打下基礎(chǔ)。

本研究首先通過RT-PCR和蛋白免疫印記檢測發(fā)現(xiàn)，TRPV1在7 d的小鼠睪丸就開始有表達(dá)，21~28 d表達(dá)量顯著增加，之后隨著小鼠發(fā)育至成年逐漸下降。在小鼠發(fā)育到21～28 d這個階段，睪丸中精母細(xì)胞正在進(jìn)行減數(shù)分裂，生精上皮各類細(xì)胞中初級精母細(xì)胞的數(shù)量最多。我們進(jìn)一步的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，TRPV1表達(dá)于睪丸生精上皮的各個時期，從IV期開始表達(dá)相對增加，并且在初級精母細(xì)胞的表達(dá)相對較多，由此提示TRPV1可能在精母細(xì)胞的減數(shù)分裂中發(fā)揮重要作用。精母細(xì)胞對溫度較為敏感，在睪丸溫度達(dá)到37 °C時，只有小部分精母細(xì)胞可以分化達(dá)到粗線期和雙線期；而當(dāng)睪丸溫度升高到38 °C，粗線期和雙線期精母細(xì)胞均無法存活，精母細(xì)胞無法完成染色體的聯(lián)會配對，最終發(fā)生凋亡[13]。Trpv1-/-小鼠在高熱環(huán)境下生殖細(xì)胞凋亡較WT小鼠少，提示TRPV1在熱激活條件下對生殖細(xì)胞起到保護(hù)作用[14]。TRPV1的熱保護(hù)作用以及其在精母細(xì)胞中的高表達(dá)提示其可能與精母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中對溫度的較高敏感性相關(guān)。此外，我們通過對成年小鼠睪丸的免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)TRPV1在成年小鼠睪丸支持細(xì)胞膜上也有表達(dá)。支持細(xì)胞作為生精上皮中唯一的體細(xì)胞，對生精細(xì)胞起支持和營養(yǎng)作用，并為精子的發(fā)生提供有利的微環(huán)境[15]。有研究表明TRPV1可以調(diào)節(jié)大鼠睪丸支持細(xì)胞中的酸感應(yīng)Cl-通道（acid sensing Cl-channel, ASCC）[16]，這也支持TRPV1參與精子發(fā)生過程的調(diào)節(jié)。

除了對生殖細(xì)胞的熱保護(hù)作用，同時也有研究報道TRPV1參與生殖細(xì)胞凋亡過程。Trpv1-/-小鼠平均壽命比WT小鼠長約100 d，并且老年Trpv1-/-小鼠睪丸細(xì)胞凋亡較WT小鼠少[17]；TRPV1的激動劑辣椒素（capsaicin, CAP）可以通過激活TRPV1從而引起精原干細(xì)胞凋亡[18]。TRPV1作為陽離子通道，可以通過調(diào)節(jié)[Ca2+]i信號，誘導(dǎo)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)和細(xì)胞色素c，激活半胱天冬酶，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[19]。因此在不同的激活因素下，TRPV1對生殖細(xì)胞的作用可能截然不同，甚至完全相反。相較于傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡途徑，TRPV1在不同的激活條件下是如何發(fā)揮細(xì)胞凋亡或保護(hù)作用，以及具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。