張 穎，黃世敬，陳 朝，陳宇霞

抑郁癥為情感障礙性疾病，主要表現(xiàn)為健忘、失眠、情緒低落及焦躁不安等，中、重度抑郁導(dǎo)致病人生活和社會工作能力明顯下降，尤其是重度抑郁的自殺傾向和行為給家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和思想負(fù)擔(dān)，給社會造成不良影響，其發(fā)病高，發(fā)病機(jī)制仍不明晰，且治療周期長、易復(fù)發(fā)、病人的依從性差，故抗抑郁癥的防治目前成為醫(yī)學(xué)界重要的關(guān)注點(diǎn)之一[1]。本研究擬采用慢性不可預(yù)見性溫和刺激(CUMS)方法復(fù)制抑郁癥模型，采用基因芯片技術(shù)對小鼠海馬組織進(jìn)行基因檢測，尋找異常差異表達(dá)基因，探討海馬神經(jīng)組織的功能變化及病理損傷，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和蛋白免疫印跡法(Western Blot)確認(rèn)基因芯片結(jié)果，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證刺猬相互作用蛋白(HHIP)對海馬神經(jīng)元的干預(yù)作用，為進(jìn)一步揭示抑郁、焦慮癥的發(fā)病機(jī)制及提高臨床診療水平提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 C57BL/6N小鼠50只，雄性，體質(zhì)量18～21 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。無特定病原體(SPF)級、室溫25 ℃、濕度46%飼養(yǎng)。自由活動，標(biāo)準(zhǔn)飲食、飲水。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，根據(jù)體質(zhì)量采用分層法隨機(jī)分為兩組，對照組20只，模型組30只。對照組分為兩籠，每籠10只。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 Agilent Mouse Gene Expression(Agilent，028005)，Bcl-2抗體(Santa cruz，Sc-492)，Bax抗體(Abcam，ab135240)，HHIP抗體(Abcam，ab39208)，Beta actin(中杉，TA-09)，胎牛血清(Gibco，26050070)，胰蛋白酶(Gibco，LP0042)，質(zhì)粒DNA大鼠抽提試劑盒(Tiangen，DP117)，DMEM(Gibco，11965118)，腺相關(guān)病毒純化試劑盒(Biomiga，V1469-01)，LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑(Hanbio Biotechnology，HB-TRCF-1000)，enonase(Signa，E1014)，Trizol RNA抽提試劑(Invitrogen，15596026),引物(GAPDH-F：TCATTGACCTCAACTACATGG，GAPDH-R：CGCTCCTGGAAGATGGTG，HHIP-F：TCAAGGAGCCTTACTTGGACA，HHIP-R：CAGGCTTAGCAGGCCCCT)，PC12細(xì)胞(ATCC)，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，0.45 μmol/L，26.5 cm×3.75 m(Millipore，IPVH00010)，Horseserum(GIBCO，16050114)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(Thermo，31460)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(beyotime，A0216)，GAPDH Antibody(FL-335)，GoScriptTMReverse Transcription System (PROMEGA，A5001)，GoTa?qPCR Master Mix(PROMEGA，A6001)，無RNase水(Thermo Fisher，AM9856)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent Scanner掃描儀(Agilent，G2505C)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(ABI，9700)，實(shí)時定量PCR儀(BIO-RAD，CFX96)，0.2 mL PCR管(Axygen，PCR-02-C)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，ChemiDoc XBS+)，超純水制備系統(tǒng)(Millipore，Milli-Q)，紫外分光光度計(ThermoFisher，NanodropND-2000)，Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent，2100)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司，DK-8D)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，3111)，倒置熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)(上海彼愛姆光學(xué)儀器有限公司，BM-38X)，倒置顯微鏡(上海普丹光學(xué)儀器有限公司，PM-500)，倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器總公司，XDS-1B)，冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5417R)，超速離心機(jī)(日立，CP70NE)。

1.3 抑郁模型的建立 建立慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激模型，抑郁模型組孤養(yǎng)造模：①冰水游泳3 min；②足底電擊2 min，自制電擊，1 mA，30 mV，每次電擊10 s，間隔時間隨機(jī)；③夾尾2 min；④傾斜24 h；⑤潮濕墊料24 h；⑥黑白顛倒24 h；⑦禁食禁水24 h；⑧異物干擾24 h。8種刺激隨機(jī)應(yīng)激持續(xù)35 d，進(jìn)行行為檢測，處死動物，剝離海馬組織，進(jìn)行微列陣基因芯片、差異基因HHIP PCR和蛋白檢測及驗(yàn)證。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)檢測

1.4.1.1 糖水實(shí)驗(yàn) 蔗糖加純凈水配成1%的蔗糖水，第1天每籠1瓶糖水24 h；第2天糖水、純凈水各1瓶飲水24 h，糖水位置不變；第3天小鼠禁水24 h；第4天200 g的1%蔗糖水和純凈水各1瓶按原來位置擺放24 h，后稱糖水和純凈水的飲水量，計算糖水百分比=糖水/(糖水+純凈水)。

1.4.1.2 走格實(shí)驗(yàn) 自制50 cm×50 cm×40 cm走格木箱，箱底有25個10 cm×10 cm方格，箱內(nèi)面為白色，用黑色劃成方格。安靜環(huán)境，將小鼠放入中間格，觀察小鼠穿越格子數(shù)和抬頭次數(shù)，穿越格子以小鼠3只腳同時進(jìn)入一個格子計算，抬頭以兩條前腿同時抬起計算。

1.4.1.3 懸尾實(shí)驗(yàn) 自制6個獨(dú)立空間立式木箱，空格內(nèi)頂部有釘粘貼小鼠尾巴，小鼠懸尾倒置，適應(yīng)2 min后使用泰盟懸尾軟件(TST-100 Tail Suspension Test Video Analysis System)監(jiān)測小鼠靜止和抬頭活動時間4 min。

1.4.2 微陣列芯片方法檢測海馬組織差異表達(dá)基因 取海馬組織抽提總RNA，利用NanoDrop定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100檢測RNA完整性。采用Agilent Mouse Gene Expression(8×60 K)芯片雜交，去磷酸化、變性、標(biāo)記、純化、雜交和洗脫后，Agilent Scanner對雜交結(jié)束后的芯片進(jìn)行掃描。提取芯片掃描原始信號值，進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和探針過濾。進(jìn)行PCA、聚類、靶基因本體(GO)、通路分析。

1.4.3 HHIP基因檢測 各組選取12只小鼠海馬組織樣本，進(jìn)一步進(jìn)行HHIP基因及蛋白的驗(yàn)證，HHIP引物設(shè)計使用ncbi-primer方法進(jìn)行。

1.4.3.1 提取樣本總RNA ①取50 mg海馬組織，加入1 mLTrizol RNA抽提試劑，研磨震蕩；②每1 mL Trizol 對應(yīng)加入200 μL氯仿，振蕩，12 000×g離心10 min，取上層水相移至新離心管；③加入等體積異丙醇，混勻靜置10 min；④ 12 000×g離心10 min，去除上層水相，保留RNA沉淀；⑤用70%乙醇清洗RNA 2次；⑥去除上清，RNA沉淀室溫開蓋晾干；⑦根據(jù)RNA沉淀量，對應(yīng)加50～100 μL RNase-free水溶解RNA。

1.4.3.2 濃度測定 取2 μL RNA，用Nanodrop儀進(jìn)行RNA濃度測定。

1.4.3.3 反轉(zhuǎn)錄 取0.5 μg RNA作為模板，與反轉(zhuǎn)錄引物和無RNase水混勻，70 ℃作用5 min。立即放入冰水混合物中冷卻5 min，離心機(jī)離心10 s，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在冰上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄混合物配制。

1.4.3.4 實(shí)時定量PCR檢測 取反轉(zhuǎn)錄的cDNA做模板，按照定量試劑說明書，利用CFX-96熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時定量檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

1.4.4 Western Blot檢測

1.4.4.1 蛋白抽提 加入含蛋白酶抑制劑的預(yù)冷RIPA細(xì)胞裂解液，冰上孵育30 min，13 000×g ，4 ℃離心取上清。

1.4.4.2 二喹林甲酸(BCA)法 按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明測定蛋白濃度。

1.4.4.3 Western Blot實(shí)驗(yàn) ①根據(jù)蛋白分子量配制10%分離膠，濃縮膠濃度為5%，蛋白樣品上樣；②電泳：濃縮膠恒壓90 V約20 min，分離膠恒壓120 V，預(yù)染蛋白Marker確定電泳時間；③轉(zhuǎn)膜：300 mA恒流，0.45 μm孔徑PVDF膜轉(zhuǎn)膜；④麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色；⑤封閉：將膜浸沒于5%BSA-TBST(100 mL TBST中含5 g BSA)的緩沖液中，水平搖床孵育1 h；⑥一抗孵育：5%BSA-TBST稀釋一抗，水平搖床孵育過夜，次日TBST洗3次；⑦二抗孵育：5%BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP和山羊抗鼠IgG(H+L)和兔抗山羊IgG(H+L)HRP 1∶1 000，室溫孵育1 h；⑧洗膜：TBST洗膜3次；⑨增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)滴加至膜的蛋白面反應(yīng)3 min，拍照。

1.4.5 HHIP包裝慢病毒 病毒包裝系統(tǒng)：三質(zhì)粒系統(tǒng)，pAAV-RC，pHelper，pHBAAV-CMV-MCS-ZsGreen。包裝細(xì)胞株：AAV-293細(xì)胞。菌株：大腸桿菌菌株Stbl3，用于擴(kuò)增腺相關(guān)載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。構(gòu)建好的慢病毒載體和輔助質(zhì)粒進(jìn)行大量抽提；包裝細(xì)胞株AAV-293細(xì)胞培養(yǎng)并傳代；確認(rèn)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%的匯合率即可進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染、純化，-80 ℃保存。

1.4.6 HHIP慢病毒感染PC12細(xì)胞 PC12細(xì)胞正常培養(yǎng)并傳代，分為3組：空白組、NTC組(NTC為病毒載體中插入一段無義序列，是陰性對照)、基因沉默組(HHIP病毒沉默組)?；虺聊M每孔加入相應(yīng)10 μL病毒，混勻，置二氧化碳孵箱培養(yǎng)48 h收樣檢測感染成功率。

1.4.7 Bcl-2/Bax蛋白檢測 6孔板細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，采用Q-PCR、Western Blot法檢測Bcl-2/Bax蛋白(PCR檢測方法同1.4.3.4，蛋白抽提及檢測方法同1.4.4)。

1.4.8 Annexin V-FITC流式檢測細(xì)胞凋亡數(shù) 6孔板細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入胰酶消化細(xì)胞至細(xì)胞變圓脫落，加入收集的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，1 000×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。加入PBS輕輕重懸細(xì)胞，1 000×g 離心5 min，棄上清，加入250 μL稀釋的Binding Buffer重懸細(xì)胞。取細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。孵育完成后于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測Annexin V-FITC與 PI染色比例。

2 結(jié) 果

2.1 抑郁模型小鼠行為學(xué)檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組糖水實(shí)驗(yàn)糖水量減少；懸尾實(shí)驗(yàn)懸尾后小鼠不動時間減少，活動時間增多；走格實(shí)驗(yàn)穿越格數(shù)及直立次數(shù)均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示CUMS方法可導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生抑郁并伴有焦慮狀態(tài)。詳見表1。

表1 抑郁小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (±s)

2.2 微陣列芯片基因檢測結(jié)果 對照組和模型組各取3只小鼠海馬組織，H3、H5、H16為對照組；H32、H34、H38為模型組，進(jìn)行基因芯片檢測。抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行芯片雜交，掃描信號值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，PCA分析提示對照組和模型組樣本分布在二維空間的不同區(qū)域，同組樣品分布較集中，基因具有同類聚集性及相關(guān)性。兩組間P<0.05且差異倍數(shù)兩倍以上，將P值的負(fù)對數(shù)-log10(P-value)為縱坐標(biāo)，log2(fold change)為橫坐標(biāo)做出火山圖，顯示出差異表達(dá)基因mRNA 447個，其中下調(diào)281個，上調(diào)166個，說明二組所選樣本具有代表性。詳見圖1、圖2。

圖1 差異mRNA聚類熱圖及表達(dá)譜芯片樣本PCA分布

圖2 火山圖

對篩選到的所有差異mRNA進(jìn)行GO、通路富集分析。GO分析結(jié)果可見模型小鼠海馬組織神經(jīng)元系統(tǒng)發(fā)育和動作電位的調(diào)節(jié)，神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育與分化，神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，神經(jīng)元再生，細(xì)胞通訊等方面功能異常。通路分析結(jié)果顯示，下調(diào)基因與神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、軸突導(dǎo)向、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及Wnt通路、細(xì)胞通訊等功能相關(guān)，與下調(diào)基因的GO分析具有很高的關(guān)聯(lián)性。詳見圖3、圖4。

圖3 GO分析結(jié)果

圖4 通路分析結(jié)果

圍繞抑郁、焦慮查找相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)并構(gòu)建差異基因網(wǎng)絡(luò)圖，可見Hedge hoy(HH)信號通路中3個基因Shh、HHIP及Claudin11均在下調(diào)基因中，此3種基因均為HH信號通路成分，提示HH信號通路可能參與了本實(shí)驗(yàn)小鼠抑郁焦慮海馬組織神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化和再生的發(fā)生，并參與了海馬組織神經(jīng)血管單元間的耦聯(lián)作用。詳見圖5。

圖5 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 HHIP基因及蛋白檢測結(jié)果 與對照組比較，模型組HHIP 基因及蛋白表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，此結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。詳見表2。

表2 抑郁模型小鼠HHIP 基因及蛋白表達(dá)變化 (±s)

2.4 HHIP慢病毒感染驗(yàn)證 為了進(jìn)行HHIP沉默及補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)，分別包裝了HHIP沉默慢病毒與過表達(dá)HHIP慢病毒(對應(yīng)對照分別為沉默對照病毒與對照過表達(dá)控制病毒)。結(jié)果顯示，沉默病毒可明顯降低細(xì)胞內(nèi)源性HHIP基因表達(dá)水平(shRNA1組)，而補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)可扭轉(zhuǎn)這種沉默(shRNA1+HHIP組)。詳見圖6。

圖6 HHIP慢病毒感染驗(yàn)證

2.5 HHIP慢病毒感染PC12細(xì)胞后細(xì)胞凋亡變化

2.5.1 PC12細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)變化 對照組(沉默對照和過表達(dá)對照)比較，HHIP沉默后PC12細(xì)胞抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)降低，促調(diào)亡因子Bax表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而補(bǔ)救組(shHHIP+HHIP組)可逆轉(zhuǎn)因HHIP沉默所導(dǎo)致的抑凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)降低，促凋亡因子Bax表達(dá)增加。詳見圖7、圖8。

圖7 HHIP慢病毒感染后PC12細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)條帶圖

圖8 HHIP慢病毒感染后PC12細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比較

2.5.2 PC12細(xì)胞凋亡變化 HHIP沉默PC12細(xì)胞后，PC12細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)增加。詳見圖9、圖10。

圖9 各組PC12細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)比較

圖10 各組PC12細(xì)胞凋亡流式圖

3 討 論

HH信號通路由Hammerschmidt等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，隨后又在脊椎動物中被證實(shí)[2]。HH信號通路對胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化增殖、細(xì)胞極化等過程有重要的調(diào)控作用，在胚胎發(fā)育期間，大腦皮層所有的旺盛神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生幾乎都與HH信號通路相關(guān)，尤其調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的極性方面[3]。

海馬體是大腦中與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的主要區(qū)域，多種感覺聯(lián)合通過皮層傳遞信息匯聚到海馬回路中的神經(jīng)元，刺激突觸傳導(dǎo)沖動[4]。HH信號通路表達(dá)異?？烧T導(dǎo)海馬神經(jīng)損傷的發(fā)生與發(fā)展，海馬神經(jīng)元樹突中音猬因子(sonic hedgehog，SHH)配體的激活參與了跨神經(jīng)元的信號通路，特別是CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元，使抑郁癥模型動物出現(xiàn)功能障礙及病理損傷[5]，這與本課題組前期的研究結(jié)果[6]一致。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，HH信號通路低表達(dá)的大鼠腦缺血模型中，腦組織疏松，神經(jīng)元減少，抑郁、焦慮等情感行為異常[7]。另有研究顯示，其信號通路低表達(dá)介導(dǎo)了抑郁焦慮癥神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)減少[8]，可見HH信號通路與抑郁、焦慮密切相關(guān)。本研究基因芯片結(jié)果顯示，HH信號通路中主要成員HHIP、Shh及Claudin11表達(dá)均降低，模型動物海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能減弱及神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間信息連接障礙，可見HH信號通路參與了本實(shí)驗(yàn)抑郁焦慮癥的發(fā)生。

基因芯片結(jié)果還提示，海馬組織神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育與分化、神經(jīng)元再生等生物功能區(qū)域障礙，通路分析結(jié)果顯示與神經(jīng)活性相關(guān)的配體-受體、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、細(xì)胞通訊、軸突導(dǎo)向、MAPK通路及WNT通路等功能活動異常，可見，此模型動物海馬組織神經(jīng)血管單元包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的耦聯(lián)功能受損，神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞間信息傳遞功能障礙，神經(jīng)血管單元失穩(wěn)態(tài)可能是導(dǎo)致小鼠抑郁焦慮發(fā)生的原因，HH等信號通路參與其發(fā)生機(jī)制，介導(dǎo)了海馬組織神經(jīng)血管單元聯(lián)通性失常。

相互的蛋白HHIP是HH信號通路的組成部分，也是通路的靶基因，對HH通路發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控[9]。HH信號通路激活HHIP，HHIP與負(fù)向調(diào)控元件的12次跨膜蛋白(patched)競爭性結(jié)合HH通路配體，HH配體與跨膜蛋白受體結(jié)合減少，跨膜蛋白抑制正向調(diào)控元件的7次跨膜蛋白Smothened(SMO)被解除釋放SMO、融合同源物(果蠅)抑制因子(suppressor of fused homolog，SUFU)，與GLI家族鋅指蛋白3發(fā)生分離，GLI3表達(dá)增加，促使鋅指蛋白1(gliomaassociated oncogene homolog 1)、GLI3共同進(jìn)入細(xì)胞核，啟動調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡[10]。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動物海馬組織HHIP基因和蛋白下調(diào)，包裝HHIP慢病毒，進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默HHIP基因后PC12細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，促凋亡因子Bax表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)增加?？梢奌HIP低表達(dá)誘導(dǎo)了模型動物腦組織海馬組織神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，其所在HH信號通路也可能參與了抑郁癥的發(fā)生及腦組織的病理改變，其高表達(dá)是否對抑郁癥腦組織海馬組織具有保護(hù)和修復(fù)作用還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。