錢 程 高 振 陳 卓

(1.南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，江蘇 南通 226001；2. 南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院放療科，江蘇 南通 226001;3. 南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院介入科，江蘇 南通 226001)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中預(yù)后不良的重要因素[1]，目前其發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。已有研究表明，腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大、分支增多，并且膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性細(xì)胞增多。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，參與腦缺血再灌注損傷[2-3]。同時(shí)有研究報(bào)道，核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)活化調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞，在脊髓缺血耐受中發(fā)揮著重要作用[4-5]，但是目前尚不明確Nrf2在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮的作用。目前，腦缺血再灌注損傷尚無有效的治療藥物。蟾酥是一味傳統(tǒng)中藥，能治療多種疾病[6-7]。有研究證明，蟾酥注射液具有抑制下丘腦環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)釋放的作用[8-9]。本研究通過對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠進(jìn)行蟾酥預(yù)處理干預(yù)，觀察小鼠腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP和Nrf2的變化，以期為蟾酥的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及設(shè)備

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性C57小鼠60只，平均體質(zhì)量(23±2.65)g，被安置在12 h的光/暗循環(huán)條件下，溫度(22±2)℃，濕度(65±5)%，自由攝食和飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：NT89202135。本研究所用的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及藥物 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司，貨號(hào)：T8877)；GFAP抗體(Abcam公司，貨號(hào)：ab7260)，Nrf2抗體(Abcam公司，貨號(hào)：ab62352)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；RIPA組織蛋白裂解液(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：R0010)；TBST 緩沖液(ThermoFisher，貨號(hào)：37571)；3.5%水合氯醛(克拉瑪爾，上海譜振生物有限公司，貨號(hào):150042)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，貨號(hào)：28718-L)；4%甲醛溶液(Sigma公司，貨號(hào)：47083-U)。蟾酥注射液(江蘇浦金藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z32020694)。

1.1.3 設(shè)備 紅外燈(FHC，Bowdoinham，ME，USA)；激光多普勒血流儀(PeriFlux 5000，瑞典Perimed AB)；圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics Co. USA)；激光共聚焦掃描分析儀(STELLARIS 5，德國Leica)；凝膠成像儀和分析軟件(iBright CL750，ThermoFisher)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將60只C57小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和蟾酥注射液低、中、高劑量組，每組12只。模型組采用線栓法制備腦缺血再灌注模型。術(shù)前禁食不禁水12 h，3.5% 水合氯醛 (1 mL/100 g)腹膜內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定。腹中線頸部縱向切口，暴露右頸總動(dòng)脈(CCA)、右頸外動(dòng)脈(ECA)和右頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。將右ECA的分支結(jié)扎并在距右CCA分叉20 mm處切斷，輕輕插入帶有圓形尖端的肝素阻尼單絲尼龍縫合線至距右ECA 切口20 mm處，用縫合線結(jié)扎以阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)。閉塞2 h后，拔出尼龍縫合線以恢復(fù)血流。用激光多普勒血流儀檢測，局部腦血流量減少至20%并恢復(fù)到基線的80%以上表明造模成功。手術(shù)過程中，用直腸探頭連續(xù)監(jiān)測核心體溫，并用恒溫控制的紅外燈使其保持在(38±0.5)℃。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、切口同模型組，血管分離后不插入線栓，結(jié)扎消毒后縫合皮下組織及皮膚即可。蟾酥注射液低、中、高劑量組分別于缺血前30 min經(jīng)腹腔注射蟾酥注射液1.6、3.2、6.4 mL/kg，其余操作同模型組。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 小鼠神經(jīng)功能 在小鼠再灌注后24 h，采用Longa's評(píng)分法評(píng)定各組小鼠神經(jīng)功能。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損；1分：癱瘓側(cè)前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向癱瘓側(cè)傾倒；4分：無法自主行走，意識(shí)水平下降[10]。

1.3.2 小鼠腦梗死體積 采用TTC染色法檢測。再灌注后72 h立即對(duì)各組小鼠實(shí)施安樂死并斷頭。迅速取出大腦并在-20 ℃下冷凍20 min。然后，將大腦冠狀面按順序切取5個(gè)切片(2 mm厚度)，置于2% TTC溶液中，在 37 ℃ 下避光孵育30 min，然后用10%甲醛固定、拍照，使用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比(%) =梗死面積×厚度/全腦體積×100%。

1.3.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測小鼠腦組織 GFAP 和 Nrf2蛋白表達(dá)水平 取各組小鼠腦組織，稱質(zhì)量，剪碎后，置于玻璃勻漿器中，按比例加入RIPA組織蛋白裂解液，裂解、勻漿、離心，取上清，于-80 ℃ 冰箱保存。取部分蛋白提取液，用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)提取液的濃度。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，分離總蛋白 (50 μg)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，將膜在室溫下用 5%脫脂牛奶封閉1 h，然后加入相應(yīng)一抗 [GFAP抗體(1∶1000 )，Nrf2抗體(1∶1000)],4℃孵育過夜,TBST緩沖液洗滌 3次，將膜與特定的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在 37 ℃下孵育1 h。PBST洗滌后,用凝膠成像儀和分析軟件掃描免疫印跡并分析每個(gè)條帶的相對(duì)密度。最終結(jié)果表示為目標(biāo)蛋白的光密度與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的光密度之比。

1.3.4 免疫熒光法檢測小鼠腦組織 GFAP 和 Nrf2陽性表達(dá) 將腦切片用4%甲醛溶液室溫固定30 min，1% Triton X-100孵育30 min，5%山羊血清37 ℃封閉1 h。然后分別加入GFAP 和 Nrf2抗體，4 ℃下孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌 3 次，加入二抗，37 ℃ 下反應(yīng) 1 h。DAPI(1∶200) 在 37 ℃ 下染色細(xì)胞核10 min，次日4%多聚甲醛固定4 h，用含15%蔗糖的PBS共孵育4 h，去離子水清洗玻片，使用激光共聚焦掃描分析切片，對(duì)每組12只小鼠中每只小鼠5個(gè)不同視野中的陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠再灌注后24 h Longa's評(píng)分比較 再灌注后24 h，模型組小鼠Longa's 評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；蟾酥注射液低、中、高劑量組小鼠Longa's評(píng)分均顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠再灌注后24 h Longa's評(píng)分比較 分，

2.2 各組小鼠再灌注后72 h腦梗死體積百分比比較 再灌注后72 h，模型組小鼠腦梗死體積百分比顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；蟾酥注射液低、中、高劑量組小鼠腦梗死體積百分比均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠再灌注后72 h腦梗死體積百分比比較

2.3 各組小鼠腦組織GFAP、Nrf2蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織GFAP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，蟾酥注射液低、中、高劑量組GFAP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2蛋白表達(dá)比較

2.4 各組小鼠腦組織GFAP、Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腦組織GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)，Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，蟾酥注射液低、中、高劑量組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)。見表4、圖1。

表4 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2陽性細(xì)胞數(shù)比較 個(gè)/高倍鏡視野，

圖1 各組小鼠腦組織 GFAP、Nrf2陽性表達(dá)(免疫熒光染色)

3 討論

目前，腦缺血再灌注損傷已成為神經(jīng)內(nèi)外科研究的熱點(diǎn)，有關(guān)其發(fā)生機(jī)制的研究也很多，特別是有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦缺血再灌注損傷之間的關(guān)系，已有多項(xiàng)研究表明其參與腦缺血再灌注損傷發(fā)生。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元的生成、發(fā)育、再生和分化均有重要作用[11-12]。GFAP是來源于神經(jīng)細(xì)胞的特異性蛋白因子，是膠質(zhì)細(xì)胞特有的骨架蛋白，在維持神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能完整性方面均發(fā)揮著積極作用，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物。腦損傷發(fā)生后，損傷區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，形成膠質(zhì)“瘢痕”，隨后GFAP的表達(dá)增加[13]。因此，腦組織GFAP升高是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的標(biāo)志[14]。Nrf2活化在調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓缺血耐受中發(fā)揮著重要作用[15]，但是與腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的關(guān)系尚不清楚。有研究認(rèn)為，Nrf2 是一種重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，作用于抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，能夠通過抗炎、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成等作用來減輕腦缺血再灌注損傷[16-17]。此外，Nrf2 已被證明可以負(fù)向調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體激活，因此在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。另有研究表明，Nrf2通過調(diào)節(jié)活性氧水平、硫氧還蛋白系統(tǒng)和谷胱甘肽系統(tǒng)來抑制NLRP3 炎癥小體激活，從而降低氧化應(yīng)激水平[18-19 ]。

蟾酥由蟾蜍表皮腺體的分泌物經(jīng)干燥而成，味辛、性溫、有毒，具有清熱解毒、醒腦開竅等功效，其藥理活性強(qiáng)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，蟾酥具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[20]；可增強(qiáng)心搏出量，降低心率，增強(qiáng)心肌收縮力[21]；還具有升壓作用，蟾酥的升壓作用平緩而迅速，維持時(shí)間長，能夠使腦、冠狀動(dòng)脈、腎的血流量增加[22]；蟾酥還具有抗腫瘤作用，對(duì)人體免疫系統(tǒng)以及循環(huán)系統(tǒng)也有很強(qiáng)的保護(hù)作用[23]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)通過改變劑型、聯(lián)合用藥等，使蟾酥的臨床應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，被廣泛用于惡性腫瘤、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、惡性血液病等疾病的治療。蟾酥對(duì)腦缺血再灌注時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，蟾酥注射液預(yù)處理后，各劑量組腦缺血再灌注小鼠Longa's 評(píng)分降低，腦梗死體積百分比縮小，GFAP蛋白表達(dá)及陽性細(xì)胞表達(dá)均明顯降低，Nrf2蛋白表達(dá)及陽性細(xì)胞表達(dá)均明顯升高，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明蟾酥對(duì)腦缺血再灌注小鼠腦功能具有一定的保護(hù)作用。

綜上，本研究結(jié)果初步表明蟾酥對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠腦功能具有一定的保護(hù)作用，可能是通過抑制GFAP 表達(dá)和增加Nrf2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。但是蟾酥是如何調(diào)控GFAP 和Nrf2來使星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)減輕的，尚需進(jìn)一步深入研究。