胡立明，張慶成，劉 嵐

1.南昌雙匯食品有限公司，江西 南昌 330115 2.南昌職業(yè)大學(xué) 衛(wèi)生健康學(xué)院，江西 南昌 330500 3.空軍勤務(wù)學(xué)院 航空軍需與燃料系，江蘇 徐州 221006

人體內(nèi)過(guò)多的自由基會(huì)導(dǎo)致心血管、胃腸、內(nèi)分泌、呼吸等系統(tǒng)出現(xiàn)多種疾病[1-2]，消除自由基成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，補(bǔ)充外源性抗氧化劑對(duì)清除體內(nèi)過(guò)多的自由基、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡有重要的意義[3-4]。相比于合成抗氧化劑，源于食物蛋白的抗氧化肽毒副作用低[5]，在抗氧化功能食品的研究與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

麥胚是小麥籽粒的生命源泉，不僅含有豐富而優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素，還含有谷胱甘肽、黃酮類(lèi)物質(zhì)、麥胚凝集素、二十八烷醇、酶等生理活性物質(zhì)，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家們譽(yù)為“人類(lèi)天然的營(yíng)養(yǎng)寶庫(kù)”[6]。不同于外源蛋白酶水解，本實(shí)驗(yàn)室采用內(nèi)源蛋白酶法從麥胚中制備抗氧化肽，以比還原力為考察指標(biāo)，對(duì)混合肽進(jìn)行了分離純化，篩選活性高的部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)為纈氨酸-組氨酸-組氨酸-組氨酸(Val-His-His-His，VHHH)，采用固相有機(jī)合成法合成了純度達(dá)98.2%的VHHH。盡管目前抗氧化肽的活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系尚未完全明晰，但研究表明：肽的分子量大小、氨基酸組成和氨基酸序列都會(huì)影響其生物活性。首先，肽的生物活性與分子量大小有關(guān)，能在體內(nèi)起功能活性作用的肽往往是分子質(zhì)量在1 000 Da以下的小肽[7],而VHHH的分子質(zhì)量小于1 000 Da。其次，氨基酸組成也會(huì)影響其抗氧化活性。VHHH中的纈氨酸和組氨酸常常出現(xiàn)在抗氧化肽中。Ko等[8]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶水解比目魚(yú)蛋白得到的肽溶液具有很強(qiáng)的抗氧化活性，經(jīng)過(guò)分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，得到了氨基酸序列為Val-Cys-Ser-Val和Cys-Ala-Ala-Pr的兩條肽。Damgaard等[9]水解動(dòng)物副產(chǎn)物得到不同大小(大多數(shù)低于3 kDa)和氨基酸組成的肽，所有的水解物在所使用的測(cè)定中都顯示出抗氧化能力，其中肺水解物的抗氧化能力可能主要是由于Glu和His殘基發(fā)揮了較強(qiáng)的鐵螯合能力，胰腺水解物的抗氧化能力可能與其高含量的Phe和Val有關(guān)。Wang等[10]認(rèn)為His的咪唑環(huán)能有效增強(qiáng)肽的自由基清除活性。Val的作用是增加抗氧化肽在脂質(zhì)或脂溶性體系中的溶解性，從而有助于提高抗氧化活性[11-12]。綜上，VHHH符合上述兩點(diǎn)特征。為研究VHHH抗氧化能力，作者對(duì)其3種體外抗氧化能力和在細(xì)胞中的抗氧化活性進(jìn)行了研究，為其開(kāi)展體內(nèi)試驗(yàn)以及開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固相有機(jī)合成抗氧化肽VHHH：純度為98.2%。人外周血：健康成年志愿者提供。

亞油酸、DPPH、還原型谷胱甘肽(GSH)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)、葡聚糖(Dextran)：均為分析純，美國(guó)Sigma公司；核黃素(VB2)、L-蛋氨酸(Met)、氮藍(lán)四唑(NBT)、六氫吡啶、鄰苯二酚、CuSO4：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2O2：分析純，廣州科霸化工有限公司；清除羥自由基能力測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒：南京建成生物有限公司；Tb 4101 Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：上海通善生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶：美國(guó)Gibco公司；CCK 8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

FACS101流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司；9602G酶標(biāo)儀：北京普朗醫(yī)療器械公司；UV-2802紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯(上海)儀器有限公司；DP70顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 中性粒細(xì)胞分離

參照文獻(xiàn)[13]并適當(dāng)調(diào)整。取外周靜脈血5 mL，加入 6%葡聚糖混勻，室溫放置 30 min；上層為白細(xì)胞混合層，下層為紅細(xì)胞層。取一新管加入淋巴細(xì)胞分離液，緩慢加入富含白細(xì)胞的上層混合液(與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為1∶ 1)，1 500 r/min 離心 20 min，取中間層；加入冰冷雙重水，迅速裂解其中的少量紅細(xì)胞，按質(zhì)量比3∶ 1加入KCl溶液并混勻，1 300 r/min 離心 6 min，離心后去上清液，底層即為中性粒細(xì)胞，加入 1 mL pH 7.0 PBS液制成細(xì)胞懸液。

1.3.2 VHHH抗氧化細(xì)胞試驗(yàn)

取6孔板，分3組進(jìn)行試驗(yàn)[13]：各組加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中性粒細(xì)胞(細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL)12 h，換1 mL新鮮含血清的培養(yǎng)基。第1組加入2 μL H2O2；第2組在加入2 μL H2O2的同時(shí)分別加入合成肽VHHH 250、500、1 000、2 000 μg；第3組設(shè)為對(duì)照，不添加任何試劑。所有細(xì)胞加試劑培養(yǎng)2 h后測(cè)凋亡率。按同樣處理方法在96孔板分組培養(yǎng)細(xì)胞，2 h后測(cè)細(xì)胞增殖率和細(xì)胞SOD活性。

1.3.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定

羥基自由基清除力測(cè)定參照張雪嬌等[14]的方法，計(jì)算清除率。

式中：A對(duì)為對(duì)照管吸光度；A樣為樣品管吸光度；A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；A0為空白管吸光度。

1.3.4 超氧陰離子清除能力的測(cè)定

超氧陰離子清除能力采用NBT光化還原法，操作步驟參照Girgih等[15]的方法，并適當(dāng)調(diào)整。測(cè)定時(shí)依次加入2.5 mL 50 mmol/L pH 7.8 PBS緩沖液、2 mL 195 mmol/L Met、0.1 mL 3 μmol/L EDTA、0.1 mL不同濃度的還原劑、0.2 mL 1.125 mmol/L NBT和0.1 mL 60 μmol/L核黃素溶液，混合均勻，于25 ℃ 4 000 Lux光照10 min，立即避光，在560 nm下迅速測(cè)定吸光度。以無(wú)光照的混合液吸光度為對(duì)照(記為A0)，不加還原劑的反應(yīng)管作為最大光化還原管(記為Aj)，樣品溶液的吸光度記為A1。超氧陰離子清除能力以抑制率表示。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Lu等[16]的方法并稍加調(diào)整。分別取2 mL 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的VHHH溶液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混合加入具塞試管中，迅速振搖并在室溫下避光靜置60 min，以無(wú)水乙醇作為參比，在517 nm處比色，測(cè)定吸光度(A1)，同時(shí)測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇與2 mL DPPH溶液混合液的吸光度(A2)，2 mL樣品溶液與2 mL無(wú)水乙醇的吸光度(A0)，計(jì)算自由基抑制率。

1.3.6 銅離子螯合力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17]的方法并適當(dāng)調(diào)整。取1 mL 2 mmol/L CuSO4、1 mL六氫吡啶(pH 7.0)和20 μL 0.1%鄰苯二酚充分混合，然后加入1 mL不同濃度的樣品溶液后，混勻，反應(yīng)5 min，在632 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以水代替樣品溶液作為空白樣，計(jì)算Cu2+螯合力。

式中：A0為空白樣品吸光度；AS為樣品吸光度。

1.3.7 凋亡率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍加修改。將孔內(nèi)培養(yǎng)液棄除，加入0.3%胰酶消化6 min，收集消化液，1 500 r/min離心5 min，去除上清液。分別向每管中加入100 μL凋亡測(cè)試緩沖液、5 μL PI和5 μL Annexin-V，室溫酶解10 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率，流速100個(gè)/s。

1.3.8 細(xì)胞增殖率的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]，取1.3.2在96孔板內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞，向各孔分別加入10 μL KIT-8，2 h后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)450 nm處的吸光度。

1.3.9 SOD活性的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，去除各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，并用0.1 mmol/L pH 7.2 PBS緩沖液清洗3遍，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30 min，收集裂解后的細(xì)胞液，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液60 μL，每孔分別加入20 μL SOD活性檢測(cè)試劑以及底物工作液，37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)均做3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 12.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥基自由基清除能力

羥基自由基是最活潑的一類(lèi)自由基，能夠與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，使以上物質(zhì)過(guò)氧化和DNA突變，從而導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[19]。由圖1可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力也相應(yīng)增加，但增幅趨緩。從同一質(zhì)量濃度下的清除效果看，VHHH清除效果高于GSH。在質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL時(shí)，VHHH清除率為57.84%±0.14%，而GSH僅為17.96%±0.91%。

圖1 VHHH和GSH的羥基自由基清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging of VHHH and GSH

2.2 超氧陰離子清除能力

圖2 VHHH和GSH的超氧陰離子清除能力Fig.2 Superoxide radical scavenging of VHHH and GSH

超氧陰離子自由基能夠生成羥基自由基等活潑的自由基[20]。由圖2可知，隨著質(zhì)量濃度增加，VHHH和GSH的清除率均增強(qiáng)，VHHH在質(zhì)量濃度高于0.20 mg/mL后清除率增幅趨緩。從相同質(zhì)量濃度的清除效果來(lái)看，在質(zhì)量濃度低于0.80 mg/mL時(shí)，VHHH清除率高于GSH，表明VHHH在低濃度時(shí)有較強(qiáng)的超氧陰離子清除能力。

2.3 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩(wěn)定的以氮為中心的合成自由基，常常用于物質(zhì)抗氧化能力的體外測(cè)定。由圖3可知，隨著質(zhì)量濃度增加，二者的清除率都提高。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.60 mg/mL時(shí)，二者清除率變化不大。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.80 mg/mL和1.00 mg/mL時(shí)，GSH清除率分別為64.14%±1.95%、64.35%±0.51%。在同一質(zhì)量濃度時(shí)，GSH清除率明顯高于VHHH清除率。

圖3 VHHH和GSH的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging of VHHH and GSH

2.4 銅離子螯合力

銅離子、鐵離子等金屬離子是非常強(qiáng)的自由基發(fā)生劑，在油脂的自氧化過(guò)程中，微量的金屬離子可使油脂氧化的誘導(dǎo)速率提高1036倍，金屬離子的存在使得捕捉自由基的抗氧化劑很快被消耗[21]。因此對(duì)金屬離子的螯合有利于抗氧化作用。由圖4可知，VHHH和GSH的螯合力都隨著質(zhì)量濃度增加而增加，在質(zhì)量濃度小于0.60 mg/mL時(shí)，螯合力相差較大，當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.60 mg/mL時(shí)，差距逐漸縮小。

圖4 VHHH和GSH的銅離子螯合能力Fig.4 Copper chelateing ability of VHHH and GSH

2.5 VHHH和GSH的IC50的比較

由表1可知，在清除生物體內(nèi)自由基方面，VHHH的清除能力強(qiáng)于GSH(清除羥基自由基IC50分別為0.39 mg/mL和0.64 mg/mL，清除超氧陰離子IC50分別為0.73 mg/mL和0.81 mg/mL)，而在清除人工合成的DPPH自由基方面，VHHH清除能力低于GSH(分別為1.78 mg/mL和0.57 mg/mL)。從銅離子螯合能力來(lái)看，VHHH低于GSH(分別為0.64 mg/mL和0.37 mg/mL)。

表1 VHHH和GSH的抗氧化能力比較Table 1 Comparison of antioxidant activity of VHHH and GSH

2.6 VHHH對(duì)細(xì)胞抗氧化的影響

注：Q1區(qū)域?yàn)閴乃兰?xì)胞；Q2區(qū)域?yàn)橥砥诘蛲黾?xì)胞；Q3區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞；Q4區(qū)域?yàn)榛罴?xì)胞；細(xì)胞凋亡率為Q2和Q3象限百分率之和。圖5 VHHH對(duì)氧化脅迫下中性粒細(xì)胞凋亡率的影響Fig.5 Effect of VHHH on the survival rate of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖6 VHHH對(duì)氧化脅迫下中性粒細(xì)胞增殖率的影響Fig.6 Effect of VHHH on the proliferation rate of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖7 VHHH對(duì)氧化脅迫下SOD活性的影響Fig.7 Effect of VHHH on SOD activity of polymorphonuclear neutrophil under oxidative stress

圖8 KIT-8吸光度與SOD活性之間的關(guān)系Fig.8 Relationship between absorbance of KIT-8 and SOD activity

3 討論與小結(jié)

H2O2是一種常見(jiàn)的氧自由基產(chǎn)生物，在機(jī)體中容易分解產(chǎn)生羥自由基或氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)氧化損傷。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，抗氧化劑可以延緩細(xì)胞損傷程度。有學(xué)者從海參、安康魚(yú)肌肉中提取的多肽被發(fā)現(xiàn)能有效清除自由基和超氧陰離子，對(duì) H2O2誘導(dǎo)損傷的 RAW 264.7 細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用[23-24]。本研究表明VHHH可通過(guò)提高SOD活性抗H2O2致細(xì)胞氧化作用。Himaya等[25]發(fā)現(xiàn)一種來(lái)自魚(yú)皮的抗氧化六肽GGFDMG和十肽LLMLDNDLPP具有清除細(xì)胞內(nèi)活性氧活性的同時(shí)，能夠上調(diào)抗氧化酶SOD的表達(dá)水平，幫助細(xì)胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，結(jié)果與本研究類(lèi)似。郭勇等[26]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)白山核桃源五肽Leu-Pro-Leu-Leu-Arg(LPLLR)能通過(guò)提高SOD酶的活性等方式對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的PC12細(xì)胞起一定保護(hù)作用。在機(jī)體中SOD存在3種形式：SOD1存在于細(xì)胞質(zhì)中，SOD2存在于線(xiàn)粒體中，SOD3存在于細(xì)胞外[27]。但VHHH如何誘導(dǎo)SOD蛋白表達(dá)還需要深入研究。

VHHH具有較強(qiáng)的體外和細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。由于體外抗氧化測(cè)定方法及細(xì)胞試驗(yàn)無(wú)法考慮在體內(nèi)的吸收、代謝和藥效等因素，導(dǎo)致體外和體內(nèi)抗氧化活性之間存在差異，因此還需通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)研究VHHH抗氧化能力，為其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。