孫英淇，謝東東，韓知雨，任順成

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

酵母可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，作為天然發(fā)酵劑，在發(fā)酵行業(yè)中具有重要的作用。酵母是釀酒行業(yè)必不可少的原料之一，不同種類的酵母可以產(chǎn)出不同的白酒(濃香型、醬香型、米香型和清香型)、啤酒、葡萄酒等。酵母也被應(yīng)用在烘焙[1]、酵素生產(chǎn)[2]、生物產(chǎn)能[3]、農(nóng)副產(chǎn)品增值[4]等方面。酵母在應(yīng)用過程中伴隨著老化的問題，需要不斷地傳代保藏，在傳代保藏過程中會(huì)發(fā)生衰老，嚴(yán)重影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)[5]。

酵母的衰老主要分為兩種：(1)隨著酵母不斷傳代、分裂次數(shù)的增多，活力逐漸降低，稱為復(fù)制性衰老；(2)單個(gè)酵母產(chǎn)生有限的子細(xì)胞的時(shí)序性衰老[6-7]。引起酵母細(xì)胞衰老的原因主要有：(1)酵母細(xì)胞端粒理論[8-9]，酵母細(xì)胞在每次分裂過程中細(xì)胞端?？s短3～4 bp，直到細(xì)胞的平均端粒長度200 bp耗盡，酵母的DNA發(fā)生損傷造成衰老。(2)酵母內(nèi)源性氧化脅迫[10]，酵母在代謝過程中產(chǎn)生活性氧(ROS)并逐漸積累，造成酵母的氧化脅迫。(3)基因組的穩(wěn)定性，基因組的不穩(wěn)定影響酵母DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致酵母進(jìn)入衰老的過程。(4)酵母外源脅迫，因?yàn)樵趥鞔倪^程中生長環(huán)境不斷變化，導(dǎo)致酵母受到高滲、乙醇以及氧化等脅迫產(chǎn)生的自由基逐漸積累，對(duì)酵母造成損傷，削減其活性[11]。同時(shí)，有研究表明酵母在傳代過程中有機(jī)酸的代謝呈現(xiàn)先升高再降低，細(xì)胞中蔗糖酶、核酸酶、脂肪酶、α-淀粉酶、乳糖酶等一些與細(xì)胞代謝相關(guān)酶的活性不斷下降[12]，胞內(nèi)自由基含量不斷升高[13]，抗氧化酶的活性不斷提升[14]。酵母在傳代過程中細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)的種類和含量也呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的趨勢，使酵母形態(tài)發(fā)生變化，提高了酵母的絮凝力，生長速率和降糖能力下降[15]。

然而，針對(duì)傳代過程中酵母碳流向的具體研究較少。研究表明多數(shù)的脅迫環(huán)境都會(huì)引起碳代謝的改變，如冷凍[16]、高糖[17]、金屬脅迫[18]等。其中，甘油海藻糖的產(chǎn)量均在酵母受到脅迫時(shí)提升，以保護(hù)酵母細(xì)胞的活性[19-20]。有學(xué)者通過基因的增強(qiáng)和切割以放大代謝效果，使酵母產(chǎn)出更多的保護(hù)物質(zhì)，從而更好地應(yīng)對(duì)脅迫[21-22]。因此，研究傳代酵母的碳代謝流向的變化規(guī)律，能夠?yàn)榻湍缚顾ダ系难芯刻峁┗A(chǔ)。同時(shí)，通過了解酵母在傳代過程中生長和發(fā)酵代謝以及細(xì)胞內(nèi)活性氧含量和抗氧化酶活性變化規(guī)律，探究酵母在傳代過程中衰敗的關(guān)鍵代數(shù)和衰敗規(guī)律，可以更科學(xué)高效地利用酵母。

本研究以釀酒酵母為對(duì)象，測定酵母在第1、5、10、15、20代時(shí)的生長特性和細(xì)胞膜性能，檢測酵母碳代謝產(chǎn)物乙醇、海藻糖、甘油等物質(zhì)的產(chǎn)量，測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性及活性氧(ROS)含量，研究酵母在傳代過程中代謝、氧化損傷和抗氧化能力的變化，揭示酵母細(xì)胞衰老的機(jī)制，為工業(yè)發(fā)酵提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 酵母與培養(yǎng)基

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

YPD培養(yǎng)基原料：瓊脂(粉)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，蛋白胨、酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2 D雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPC-300BSH-Ⅲ恒溫恒濕箱、DHG-907電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；TGL-18高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；UV-1800BPC紫外可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的培養(yǎng)

采用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，培養(yǎng)基使用YPD培養(yǎng)基 (1%酵母膏、2%葡萄糖和2%蛋白胨)。

接種1%活性干酵母于YPD培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液稀釋涂布，30 ℃培養(yǎng)24 h后篩選出單菌落。將取出的單菌落酵母在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后劃線純化2次，取單菌落甘油保藏。

將甘油保藏的酵母以2%接種量接種至YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h作為種子液。取2%的種子液接種到新的YPD液體培養(yǎng)基中，作為第1代，每24 h接種1次為1代[12]，在雙功能氣浴恒溫?fù)u床中180 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)。在第1、5、10、15、20代生長24 h后取酵母樣液進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.2 不同代數(shù)酵母的生長曲線測定

采用雷雅男等[23]使用的方法測定生長曲線。

1.3.3 發(fā)酵液電導(dǎo)率和核酸含量的測定

利用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率。采用許艷俊等[24]使用的方法，用紫外分光光度計(jì)在260 nm和280 nm處測定發(fā)酵液的吸光度，采用M.wave Professional 2.0計(jì)算核酸的含量。

1.3.4 還原糖含量的測定

用DNS法測定還原糖的含量[25]。

1.3.5 乙醇含量的測定

取適當(dāng)稀釋的樣液1.00 mL于比色管中，加入2.00 mL重鉻酸鉀溶液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴10 min后，立即用流水冷卻，用分光光度計(jì)在波長600 nm處測定其吸光度，利用乙醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙醇含量[26]。

1.3.6 甘油含量的測定

甘油含量的測定采用張永生等[27]的方法。

1.3.7 海藻糖含量的測定

海藻糖含量的測定參考Dong等[20]使用的方法，并優(yōu)化。取5 mL菌液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液。加入5 mL 0.5 mol/L三氯乙酸，然后放入冰水浴30 min(每5 min搖晃1次)，取出后在4 000 r/min條件下離心10 min，取1 mL上清液于比色管中，加入5 mL蒽酮-硫酸試劑，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，590 nm處測定吸光度。

1.3.8 酵母胞內(nèi)蛋白含量的測定

酵母胞內(nèi)蛋白含量的測定采用Bradford法。

1.3.9 酵母胞內(nèi)ROS含量和SOD、CAT活性的測定

分別取不同代酵母的菌液100 mL，5 000g離心10 min收集菌體。將收集到的菌體置于研缽中，加入適量液氮研磨至糊狀。之后使用生理鹽水定容至10 mL，混勻后在4 ℃、9 000g離心10 min。使用南京建成試劑盒E004-1-1、A001-1-1、A007-1-1分別對(duì)酵母胞內(nèi)ROS含量以及SOD、CAT的活性進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用 SPSS 16.0 中Duncan多重比較的檢驗(yàn)方法和T檢驗(yàn)法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用 Microsoft Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同代酵母的生長曲線

圖1 不同代酵母生長曲線Fig.1 Growth curves of different generations of yeast

由圖1可知，酵母的生長趨勢隨著代數(shù)的增加呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢。在前4 h的遲滯期，不同代數(shù)酵母的生長沒有顯著的差異。在4～14 h酵母的對(duì)數(shù)生長期，不同代數(shù)酵母的生長開始出現(xiàn)差異，生長速度隨著酵母傳接代數(shù)的增加而減慢，第1代酵母在14 h時(shí)開始進(jìn)入平穩(wěn)期，而第5、10、15和20代酵母分別在14 h、16 h、20 h和22 h時(shí)進(jìn)入平穩(wěn)期，酵母進(jìn)入平穩(wěn)期，吸光度峰值隨著酵母的代數(shù)的增加而降低。酵母在傳代過程中的生長增殖能力逐漸下降。一方面可能是由于酵母的葡萄糖利用量減少，代謝下降所致；另一方面可能是由于隨著傳接代數(shù)的增加，酵母的自由基含量積累，細(xì)胞受到損傷，導(dǎo)致生長性能下降[13]。

2．2 不同代酵母發(fā)酵液中電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)含量的變化

由表1可知，酵母菌液的電導(dǎo)率隨傳代次數(shù)的增加呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，第20代的電導(dǎo)率顯著高于其他處理組。說明酵母在傳代過程中細(xì)胞膜的通透性可能受到影響。一方面可能是隨著細(xì)胞老化，活性氧含量的增加，細(xì)胞膜受到損傷，導(dǎo)致老化的酵母細(xì)胞膜的功能衰弱，胞內(nèi)物質(zhì)外泄[28]；另一方面可能是酵母在代謝減弱時(shí)，通過增加細(xì)胞膜的通透性，以吸取營養(yǎng)物質(zhì)來抑制代謝活力的減弱[24]。

表1 不同傳代次數(shù)酵母菌液的電導(dǎo)率、核酸和蛋白質(zhì)含量Table 1 Conductivity, content of nucleic acid and protein of yeast medium with different times of passage

由表1可知，第20代酵母的胞外核酸含量最多且與15代之間的變化值最大，第5代顯著大于第1代，第15代顯著大于第5代，該結(jié)果同電導(dǎo)率結(jié)果相似。同時(shí)隨著傳代次數(shù)的增加發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量也呈顯著增加的趨勢。酵母在傳代過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等重要生命物質(zhì)出現(xiàn)一定程度的外泄，并且在15—20代時(shí)最為嚴(yán)重。這可能是因?yàn)槔匣慕湍讣?xì)胞膜功能減弱，酵母發(fā)生自溶，胞內(nèi)的核酸及蛋白質(zhì)外泄[29]，或是因?yàn)樵谘趸{迫條件下部分細(xì)胞損傷破裂。酵母培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量的增加也可能是因?yàn)榻湍缸陨韺?duì)老化的組織降解排出胞外的結(jié)果[30]。

2．3 不同代酵母培養(yǎng)基中葡萄糖、甘油、海藻糖、乙醇含量的變化

不同代酵母發(fā)酵液中剩余葡萄糖的含量如表2所示。第5代與第1代酵母發(fā)酵液中葡萄糖含量相比沒有顯著變化，第10代與第5代酵母發(fā)酵液中葡萄糖含量相比顯著增多，第15代與第10代酵母發(fā)酵液中葡萄糖含量相比沒有顯著變化，而第20代發(fā)酵液中葡萄糖含量與第15代相比有顯著增加并且差距最大。發(fā)酵液中殘?zhí)呛糠从沉私湍笇?duì)培養(yǎng)基中葡萄糖的吸收利用能力，殘?zhí)呛吭缴僬f明酵母利用量越高。結(jié)果表明，酵母細(xì)胞傳代次數(shù)的增加會(huì)影響酵母的碳利用率，細(xì)胞的衰老影響了酵母細(xì)胞的碳利用率，影響細(xì)胞的生長，該結(jié)果也同酵母的乙醇產(chǎn)量相一致。這可能是因?yàn)榻湍冈趥鞔^程中自由基不斷積累，導(dǎo)致高代數(shù)的酵母自身ROS含量較高，嚴(yán)重減弱了細(xì)胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能[13,30]，削弱了細(xì)胞代謝的能力，導(dǎo)致酵母的碳代謝量降低。

表2 不同傳代次數(shù)酵母碳代謝相關(guān)物質(zhì)的含量Table 2 Content of substances related to carbon metabolism in yeast with different times of passage

由表2可知，第1代、第5代和第10代酵母隨著傳接代數(shù)的增加發(fā)酵液中甘油含量依次顯著增加，第15代和第10代酵母相比沒有顯著差異，第20代與第15代相比顯著增加，并且增加量是前3組組間差值的1.78～2.80倍，第20代的甘油含量是第1代的2.84倍。傳代次數(shù)多的酵母細(xì)胞甘油產(chǎn)量增多，表明老化的細(xì)胞碳代謝更加偏向于甘油代謝，這可能與酵母受到高滲冷凍脅迫相似[20,31]，在傳代過程中受到外界脅迫導(dǎo)致酵母啟動(dòng)HOG應(yīng)答機(jī)制，產(chǎn)出更多的甘油來保護(hù)自身細(xì)胞。

由表2可知，酵母胞內(nèi)海藻糖的含量隨著傳接代數(shù)增加呈現(xiàn)顯著升高的趨勢。在第5—10代和第15—20代增幅較大，分別為35.673、64.015 μg/mL。傳代次數(shù)多的酵母細(xì)胞中海藻糖含量的增多同甘油的結(jié)果相似，說明老化的酵母細(xì)胞的碳代謝傾向于甘油合成的同時(shí)也增加了海藻糖的合成強(qiáng)度，這可能是酵母對(duì)傳代過程中受到不斷積累的脅迫效應(yīng)做出的反應(yīng)應(yīng)答的結(jié)果[16]。

由表2可知，第1代、第5代、第10代酵母發(fā)酵液中乙醇含量依次顯著降低，第15代酵母發(fā)酵液中乙醇含量與第10代相比稍降低，第20代酵母發(fā)酵液中乙醇含量顯著降低并且減少量是第1—15代每相鄰實(shí)驗(yàn)組之間差值的2.36～6.80倍，第20代的乙醇含量也僅為第1代的30.27%。傳代次數(shù)越多的酵母產(chǎn)出的乙醇越少說明酵母發(fā)酵力減弱[32]。所以，隨著不斷地傳代衰老，酵母的碳代謝中糖酵解代謝能力下降，發(fā)酵力減弱，其中第20代最為嚴(yán)重。這可能與酵母利用的葡萄糖量相關(guān)[21]，另外，根據(jù)表2中海藻糖和甘油含量的變化，推測酵母可能減少乙醇的代謝以產(chǎn)生更多的海藻糖和甘油，來抵御活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷。

2．4 不同代酵母胞內(nèi)ROS含量、胞內(nèi)CAT、SOD的活性

如表3所示，523.6 nm處的熒光峰值體現(xiàn)酵母ROS熒光強(qiáng)度，酵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨著酵母傳代次數(shù)的增多而顯著增加，其中第15、20代的酵母胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度分別是第1代的2.29、2.81倍。酵母在受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體中ROS含量增加，ROS的產(chǎn)生嚴(yán)重削減酵母的活力。ROS含量的增高進(jìn)一步證明酵母在傳代過程中所受到損傷脅迫的積累，同時(shí)也解釋了酵母活性降低的原因，該結(jié)果同丁華建等[13]的研究結(jié)果相一致。

表3 不同代酵母的ROS含量及抗氧化酶活性Table 3 ROS content and antioxidant enzymes activity of different generations of yeast

由表3可知，酵母第1代和第5代、第10代和第15代之間胞內(nèi)CAT和SOD的活性沒有顯著的差異，在第5代和第10代之間有顯著的差異。第15代和第20代酵母胞內(nèi)CAT活性沒有顯著差異，而SOD的活性顯著增加。酵母細(xì)胞內(nèi)的CAT、SOD都是抗氧化酶的一種，能夠清除酵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基，減少酵母的氧化損傷，這也是酵母抵抗衰老的表現(xiàn)[33]。酵母每間隔10代抗氧化酶有顯著的增長，這同酵母胞內(nèi)ROS含量的增加相一致，可能是酵母在氧化脅迫的情況下自身的應(yīng)答，通過提高抗氧化酶的活性來降低氧化脅迫造成的傷害。而與此不同的是尹亞輝等[14]卻發(fā)現(xiàn)酵母在傳代過程中胞內(nèi)抗氧化酶的活性先升高再降低，這可能是由于所選菌種和代數(shù)定義不同導(dǎo)致的酵母老化程度不同。抗氧化酶活性提升的同時(shí)，胞內(nèi)的ROS含量依然在不斷增加，這可能是酵母所受到的脅迫超過了自身的抵抗能力的范圍。

3 結(jié)論

酵母在傳代過程中不斷老化，細(xì)胞膜的功能衰弱，對(duì)葡萄糖的利用率降低，發(fā)酵力減弱。在酵母的碳代謝量降低的前提下，細(xì)胞的代謝從糖酵解代謝轉(zhuǎn)向海藻糖和甘油代謝。酵母胞內(nèi)抗氧化酶活力的提升不能很好地抵抗酵母受到的氧化脅迫。酵母生長速率在第10代開始受到影響，并且在第5代、第10代和第20代時(shí)的發(fā)酵力分別顯著下降。本研究初步探索了酵母在傳代過程中的生長特性、糖代謝變化和抗氧化特性，下一步可結(jié)合酵母各基因的表達(dá)強(qiáng)度的進(jìn)行更加深入的研究。