張 歡，賈怡文，陳小威,2*，孫尚德,2*

1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2.河南工業(yè)大學 河南省油料深加工工程研究中心，河南 鄭州 450001

角鯊烯為三十碳六烯，由6個異戊二烯連接而成，是一種脂質不皂化物，也是一種天然直鏈三萜類化合物[1]。在大多數動植物體內角鯊烯均廣泛存在，且在人皮脂中其含量高達50 mg/100 g[2]，這減少了紫外照射對人體皮膚的傷害[3]。角鯊烯還因具有抗氧化、滋潤皮膚易被吸收、降低血清膽固醇、預防癌癥和心血管疾病等特性，被廣泛應用在保健品、食品及化妝品等領域[4-5]。

深海鯊魚肝油是傳統(tǒng)的獲取角鯊烯的主要原料，它的角鯊烯含量約為50 g/100 g[6]。不同品種的深海鯊魚肝油中存在不同含量的角鯊烯，這可能與其生活環(huán)境相關[7]。隨著海洋資源的匱乏以及人們生態(tài)意識的提高，出于對海洋動物的保護，植物來源角鯊烯引起了人們的廣泛關注[8-9]。角鯊烯在植物中分布較廣，但含量并不高。植物油中橄欖油等雖可成為提取角鯊烯的來源，但這會加速人類食用油資源緊張，故從油脂精煉廢棄物中提取角鯊烯是十分必要的[9]。脫臭餾出物是油脂精煉過程中脫臭得到的副產物。朱云[10]發(fā)現植物油精煉脫臭過程中，角鯊烯會在高溫負壓環(huán)境下遷移到餾出物中而富集。故橄欖油、米糠油、大豆油的脫臭餾出物可作為獲取角鯊烯的優(yōu)質植物源。如Akgün[11]以橄欖油脫臭餾出物為原料，在超臨界甲醇中酯化后采用超臨界CO2提取角鯊烯，此外，通過響應面分析優(yōu)化提取條件可提取到純度高達75%的角鯊烯。稻米油脫臭餾出物(DD)是稻米油精煉脫臭過程中產生的副產物，其中主要含有游離脂肪酸、植物甾醇、角鯊烯和維生素E等。稻米油脫臭餾出物中角鯊烯含量為2～10 g/100 g，高于大豆油脫臭餾出物(1～2 g/100 g)、棕櫚油脫臭餾出物(0.5～0.8 g/100 g)等中的含量[12]。孫登文[13]采用多級逆流液-液萃取工藝從稻米油脫臭餾出物中提取維生素E和角鯊烯，得到純度高達93.5%的角鯊烯，回收率為91.7%。Sugihara等[14]采用超臨界CO2萃取與超臨界硅膠色譜聯用從稻米油脫臭餾出物中提取得到純度81.0%的角鯊烯。

雖然這些技術提取角鯊烯的效果較好，但過程費時，操作復雜，成本昂貴[15-17]。因此，開發(fā)簡單的工藝從稻米油脫臭餾出物分離、純化角鯊烯具有重要意義，這將為角鯊烯提供植物源并促進脫臭餾出物副產物的高值化利用?；诖耍髡咭缘久子兔摮麴s出物為原料，采用皂化-柱層析聯用技術分離、純化角鯊烯，探究皂化時間、皂化溫度、堿濃度、料液比等確定皂化提取角鯊烯的最優(yōu)條件，進一步選擇合適的洗脫劑，利用柱層析技術得到高純度角鯊烯，以期為角鯊烯分離、純化及稻米油脫臭餾出物的高值化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

稻米油脫臭餾出物：益海嘉里(武漢)糧油工業(yè)有限公司；薄層色譜板、200～300目硅膠：青島海洋化工有限公司；角鯊烯標準品(純度≥98%)：上海麥克林生化科技有限公司；正己烷(色譜純)，乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、95%乙醇(均為分析純)，無水硫酸鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鉀：天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

7890B氣相色譜儀、7890A-5575C氣相色譜質譜聯用儀：美國Angilent公司；IKA RV10旋轉蒸發(fā)儀器：德國IKA/艾卡廣州儀器設備有限公司；分析天平AUY200：日本SHIMADZU公司；DRHH-SW4數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋：上海雙捷實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 皂化分離

在250 mL磨口圓底燒瓶中稱取稻米油脫臭餾出物約5.00 g(萃取劑量在單因素試驗時取10.00 g)，并加入不同濃度和體積的堿液。在不同溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)下，冷凝回流不同時間(30、60、90、120、150、180 min)。通過冷凝回流管頂部加入25 mL(萃取劑量在單因素試驗時取50 mL)蒸餾水，將反應物冷卻至室溫。隨后，分3次用25 mL正己烷將反應物提取于250 mL分液漏斗中，振蕩60 s后靜置分層，得上層不皂化液。通過一定體積10%的乙醇水溶液分3次洗滌不皂化液，直至中性。如果在此過程中因劇烈震搖而出現乳化，用無水乙醇消除。最后，用無水硫酸鈉除去不皂化液中的水分，有機相在50 ℃水浴中旋轉蒸發(fā)溶劑，得到不皂化物。

1.3.2 薄層色譜試驗

用玻璃毛細管吸取少量的角鯊烯標品溶液及不皂化液，將其均勻點樣在薄層色譜板上，用不同種類、不同比例的展開劑分離，當其展開至色譜板頂端約1 cm時，取出薄層色譜板，晾干后用碘蒸汽進行顯色反應。計算比移值(Rf)，當Rf在0.3～0.7之間且能將角鯊烯與其他物質分離的展開劑可作為柱層析的洗脫劑。

1.3.3 柱層析純化

準確稱取0.5 g不皂化物，以200～300目硅膠粉為固定相裝柱，濕法上樣，以正己烷為流動相，每25 mL為一管收集洗脫液，邊洗脫邊使用薄層色譜板及氣相色譜判斷洗脫液成分，待洗脫液中沒有任何成分后，停止收集。通過氣相色譜測定每管樣品，根據標準曲線計算其中角鯊烯的純度。合并收集到的角鯊烯洗脫液，在旋轉蒸發(fā)儀中除去溶劑，可得角鯊烯純化物。

1.3.4 氣相色譜、質譜條件

氣相色譜條件：SGE BPX-70色譜柱(30.0 m×250 μm×25.0 μm)；采用程序升溫，將初始溫度設置為160 ℃，并以5 ℃/min升高至215 ℃，保持15 min；氫火焰離子檢測器溫度300 ℃，進樣口溫度250 ℃，以高純氮氣為載氣，流速1.0 mL/min，采用分流的方式進樣，分流比10∶ 1，進樣量1 μL。

質譜條件：HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；采用程序升溫，初始溫度為160 ℃，并以15 ℃/min升高至220 ℃，保持2 min；然后以5 ℃/min升高至280 ℃，保持20 min；隨后以5 ℃/min升溫到 300 ℃，保持 2 min；采用分流的方式進樣，分流比10∶ 1，進樣量1 μL；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，增益因子1.00；電離方式為EI源，電離電壓70 eV，選擇采集方式為全掃描模式。

1.3.5 測定角鯊烯純度和提取率

準確稱取不皂化物0.5 g，用正己烷溶解并定容至10 mL，隨后稀釋10倍。用注射器得1.5 mL待測液，將其過0.45 μmol/L有機濾膜后利用氣相色譜法測定。與此同時建立標準曲線。用正己烷將20 mg角鯊烯標準品定容至10 mL，配制2 mg/mL的角鯊烯母液，取不同體積母液稀釋至一系列不同質量濃度(5、10、20、50、100、200、400 μg/mL)的角鯊烯標準溶液。以峰面積為橫坐標(x)，質量濃度為縱坐標(y)，繪制角鯊烯標準曲線。以外標法定量，根據氣相色譜及外標標準曲線，計算角鯊烯純度和提取率。

1.4 數據處理

單因素試驗每個樣品進行2次平行，結果以平均值表示；使用Origin 2019和SPSS 21軟件進行數據處理與統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 皂化單因素分析

2.1.1 萃取劑用量對角鯊烯純度和提取率的影響

在皂化溫度80 ℃、料液比1∶ 5 g/mL、堿濃度1.0 mol/L、皂化時間60 min的條件下，探究不同萃取劑用量對角鯊烯純度和提取率的影響，其中采用50、30、20 mL正己烷萃取3次，50、30 mL正己烷萃取2次，50、35、20 mL正己烷分別萃取1次。

從圖1可以看出，隨著萃取劑用量增加，角鯊烯純度呈顯著降低趨勢，從19.5%降至15.6%；而提取率則與之相反，從68.7%升至94.7%，提升至1.4倍。這可能是因為萃取劑用量多，角鯊烯提取較為充分，但同時其他不皂化物也被更多提取出來，故角鯊烯純度降低，提取率升高。這與胡光源等[18]研究結果萃取次數增加使角鯊烯提取率升高相一致。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2—圖5同。圖1 萃取劑用量對角鯊烯純度和提取率的影響Fig.1 Effect of extraction dose on the content and extraction rate of squalene

2.1.2 堿濃度對角鯊烯純度和提取率的影響

在皂化溫度80 ℃、料液比1∶ 5 g/mL、提取時間60 min、25 mL正己烷萃取1次的條件下，探究不同堿濃度(0.1～2.5 mol/L)對角鯊烯純度和提取率的影響。從圖2可以看出，隨著堿濃度的增加，角鯊烯純度呈先升高后降低趨勢，由4.3%顯著升高至19.0%又降至18.8%；在2.0 mol/L時角鯊烯純度最高。而提取率呈顯著降低趨勢，由96.7%降至76.4%。這是由于堿濃度較低時，皂化反應未進行徹底，反應體系中脂肪酸殘留量高，并未被清洗除去，故角鯊烯在不皂化物中的純度過低；而堿濃度升高使皂化反應進行完全，角鯊烯從反應體系中分離而在不皂化物中被富集，從而不皂化物中的角鯊烯純度升高；當堿濃度超過2.0 mol/L時，角鯊烯純度降低可能是由于谷維素、維生素E被破壞，不足以保護角鯊烯，這與陳璐等[19]、謝洋洋[20]的研究結果一致；同時，過量堿液使角鯊烯被破壞，提取率持續(xù)降低[21]。綜上，最佳堿濃度為2.0 mol/L。

圖2 堿濃度對角鯊烯純度和提取率的影響Fig.2 Effect of alkali concentration on the purity and extraction rate of squalene

2.1.3 料液比對角鯊烯純度和提取率的影響

在提取溫度80 ℃、堿濃度1.0 mol/L、提取時間60 min、25 mL正己烷萃取1次的條件下，探究不同料液比(1∶ 4、1∶ 5、1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8、1∶ 9 g/mL)對角鯊烯純度和提取率的影響，結果如圖3所示。

由圖3可知，角鯊烯純度隨著料液比的增加呈先升高后顯著降低的趨勢，這表明改變皂化過程中的料液比對角鯊烯純度產生明顯影響。在料液比為1∶ 6時角鯊烯純度最高，為18.6%，此時皂化反應進行完全；而料液比小于1∶ 6時，堿液過多，不皂化物被破壞，提取難度高，角鯊烯純度降低。這與葉虔臻等[21]以山茶油脫臭餾出物為原料時的研究結果一致。但提取率并未呈現明顯規(guī)律變化，主要是由于在此范圍的料液比對角鯊烯純度的影響不大，僅由17.9%升至18.6%。綜上，最佳料液比為1∶ 6 g/mL。

圖3 料液比對角鯊烯純度和提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on squalene content and extraction rate

2.1.4 皂化時間對角鯊烯純度和提取率的影響

在提取溫度80 ℃、堿濃度1.0 mol/L、料液比1∶ 5 g/mL、25 mL正己烷萃取1次的條件下，探究不同提取時間(30、60、90、120、150、180 min)對角鯊烯純度和提取率的影響。從圖4可以看出，隨著皂化時間的延長，角鯊烯純度呈現緩慢升高后又逐漸降低的趨勢，由18.7%升至19.0%，且在60 min時角鯊烯純度最高，這說明提取時間對角鯊烯純度并沒有顯著影響；而提取率沒有明顯變化規(guī)律，但整體隨著皂化時間的延長而降低。這主要是由于角鯊烯長期處于高溫堿性體系中，易被破壞，純度和提取率都有一定程度的降低。而當皂化時間少于60 min時，皂化反應不充分，不利于角鯊烯的純度提高[19]。綜上，最佳皂化時間為60 min。

圖4 皂化時間對角鯊烯純度和提取率的影響Fig.4 Effect of saponification time on the purity and extraction rate of squalene

2.1.5 皂化溫度對角鯊烯純度和提取率的影響

在堿濃度1.0 mol/L、料液比1∶ 5 g/mL，提取時間60 min、25 mL正己烷萃取1次的條件下，探究不同提取溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)對角鯊烯純度和提取率的影響。由圖5可知，當皂化溫度從50 ℃升至70 ℃，角鯊烯純度呈顯著升高趨勢，并在70 ℃時達到最高值18.48%，此后隨著溫度的繼續(xù)升高，純度隨之顯著降低，這與葉虔臻等[21]以山茶油脫臭餾出物為原料提取角鯊烯的結果一致。此外，齊德珍[22]采用皂化分離法以大豆油脫臭餾出物為原料提取角鯊烯，通過正交試驗分析提取條件發(fā)現皂化溫度以80 ℃為宜，這可能是由于大豆油脫臭餾出物中維生素E含量高于角鯊烯，且其抗氧化能力較角鯊烯好。故在同樣高溫情況下，大豆油脫臭餾出物中角鯊烯不易被破壞，其損失較稻米油脫臭餾出物中低[19,22-23]。皂化反應屬于吸熱反應。在低溫皂化時，皂化反應慢且未完全，體系中脂肪酸含量高，角鯊烯純度較低；隨著皂化溫度的升高，皂化反應更充分，角鯊烯在不皂化物中富集，同時體系長期處于高溫堿性條件下，角鯊烯損失量增多，在皂化溫度超過70 ℃時角鯊烯提取率與純度均降低。此外，角鯊烯熱穩(wěn)定性很差，易發(fā)生熱分解反應，產生醛和酮[24-25]，也可能導致隨著皂化溫度的升高，角鯊烯提取率大體呈現降低趨勢，由80.1%降至74.8%。綜上，最佳皂化溫度為70 ℃。

圖5 皂化溫度對角鯊烯純度和提取率的影響Fig.5 Effect of saponification temperature on the purity and extraction rate of squalene

2.2 洗脫劑選擇

選擇不同種類、不同比例的展開劑，將石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮(極性從小到大)作為展開劑，并將其復配進行薄層色譜試驗(TLC)，為防止拖尾現象，可加入一定量冰乙酸。從試驗結果可知，單一溶劑乙酸乙酯、丙酮并不能將角鯊烯與其他物質分離，這主要是由于角鯊烯是不飽和三萜類化合物，屬于弱極性物質，而薄層色譜試驗根據相似相溶原則，極性較大的溶劑使之分離效果差[26]。當選擇兩種不同配比展開劑時，角鯊烯可與其他物質分離。其中，當V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=10∶ 1、20∶ 1、25∶ 1、50∶ 1、100∶ 1時，比移值(Rf)在0.8～0.95之間，且相差不大。單一展開劑石油醚可使角鯊烯與其他物質分離，Rf為0.69。當展開劑選擇正己烷時，分離效果較好(Rf=0.49)，因此選擇正己烷作為洗脫劑進一步進行柱層析純化角鯊烯。

2.3 柱層析純化

目前，角鯊烯的定量測定多采用氣相色譜法，而氣相色譜-質譜聯用法主要用于其定性分析[27-28]。由于皂化分離過程只能將角鯊烯純度提升至20%左右，因此，為了得到高純度的角鯊烯進一步利用柱層析技術提純不皂化物。不皂化物、角鯊烯被洗脫之前的餾分以及含有角鯊烯的餾分氣相色譜圖如圖6所示。將一定時間收集的餾出液進行氣相色譜分析，可得每管中角鯊烯質量，并計算回收率，結果如圖7所示。

圖6 不皂化物以及柱層析第128、312分鐘餾分氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatograms of unsaponifiable matter and the 128 min and 312 min fractions of column chromatography

圖7 洗脫時間對角鯊烯質量和回收率的影響Fig.7 Effect of elution time on the mass and recovery of squalene

從圖6可知，不皂化物中除了角鯊烯外還含有其他不可皂化物(如甾醇、維生素E等)，隨著正己烷的洗脫，雜質首先被洗脫出來，隨后在240 min開始有角鯊烯流出。從圖7可知，角鯊烯從層析240 min后開始富集，在304 min時質量最高，此后質量逐漸降低，360 min之后角鯊烯質量明顯較低。通過柱層析收集240～360 min樣品匯集后，脫溶能回收得到94%的角鯊烯。

插圖為角鯊烯純化物離子質譜及分子結構圖8 角鯊烯純化物氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatographic results of purified squalene

利用氣相色譜-質譜聯用對得到的角鯊烯進行了結構鑒定分析，結果如圖8所示。經離子色譜信息分析和質譜數據庫匹配，證實得到的確實為角鯊烯。此外，利用標準曲線計算其純度為85%。

3 結論

以稻米油脫臭餾出物為原料，采用皂化分離法結合柱層析純化制備角鯊烯。通過單因素考察可知，皂化提取高純度角鯊烯的最適條件為皂化溫度70 ℃、皂化時間60 min、料液比1∶ 6 g/mL、堿濃度2.0 mol/L。通過薄層色譜證實正己烷可作為柱層析分離純化角鯊烯的最佳洗脫劑。經氣相色譜分析，在柱層析收集液中獲得了純度為85%、回收率為94%的角鯊烯。本工藝操作簡單，回收率較高，為植物源角鯊烯的開發(fā)利用提供了研究基礎。