謝 藝，倪艷林，朱 航，朱葉青，張 艷，鄒華文，張丙林

（長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434023）

玉米是重要的糧食作物和飼料作物，其種植面積和總產(chǎn)量僅次于水稻和小麥。雖然玉米在整個生育期內(nèi)需要較高的溫度，但超過3 d 最高氣溫≥35 ℃的持續(xù)高溫天氣，則會影響植株的生長和發(fā)育，造成高溫熱害。中國南方地區(qū)的夏玉米在幼苗生長期間易遭遇高溫天氣，造成發(fā)育異常而減產(chǎn)。隨著全球工業(yè)化發(fā)展和溫室氣體排放的加劇，季節(jié)性高溫發(fā)生的頻率預(yù)計在未來幾十年內(nèi)會增加［1，2］。全球氣候變暖將對夏玉米的生產(chǎn)帶來很大的負面影響［3］。

如果植物生長發(fā)育過程中受到高溫脅迫，其器官生理生化以及分子反應(yīng)過程等均會產(chǎn)生響應(yīng)。光合作用是植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的關(guān)鍵，遭遇高溫后，由于葉片葉綠素含量減少，類囊體上的光化學反應(yīng)和葉綠體基質(zhì)上的碳代謝受到影響，從而造成玉米葉片光合作用能力下降，有機物合成量減少［4，5］。高溫脅迫導(dǎo)致植株葉片光合速率下降與其氣孔狀態(tài)有很大的關(guān)系，另外，葉片的蒸騰速率隨著氣孔的開閉而變化，受到高溫脅迫時，植株為防止葉溫過高而加快蒸騰來減少熱損傷。氣孔狀態(tài)也是影響植株葉片水分利用率的重要因素，有學者通過研究小麥葉片的氣孔發(fā)現(xiàn)，氣孔面積和氣孔孔徑寬度對水分利用率的影響很大［6］。

氣孔是植物碳同化、呼吸和蒸騰作用等氣體代謝的通路，在生理上具有重要意義［7］。植物通過改變氣孔的開度、大小、氣孔頻度（密度和指數(shù)）和氣孔與表皮細胞的分布狀態(tài)來適應(yīng)各種生理逆境［8-11］。目前，關(guān)于高溫脅迫對氣孔的影響的研究相對較少，且結(jié)果不一致，一般認為高溫對植物葉片的氣孔性狀沒有影響［12-15］，但也有研究認為高溫可以改變氣孔狀態(tài)，比如氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔導(dǎo)度等。植物葉片的氣孔密度與其氣體交換過程密切相關(guān)，Song 等［16］、張立榮等［17］做了關(guān)于擬南芥和不同蒿類矮生草甸的研究，發(fā)現(xiàn)這些植物氣孔密度隨著溫度的升高而降低；朱玉等［18］對藍莓幼苗的研究結(jié)果表明，高溫對氣孔密度的影響因品種而異，部分品種的氣孔密度隨溫度增加而增加，也有一些品種的氣孔密度沒有變化；Jumrani 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，大豆葉片遠軸面和近軸面的氣孔數(shù)量均顯著增加，蒸騰速率加快。此外，氣孔孔徑寬度和氣孔導(dǎo)度決定了單個氣孔的CO2通過量，Zhang 等［20］研究了不同濃度CO2和溫度的交互作用對番茄葉片氣孔孔徑的影響，發(fā)現(xiàn)在高濃度CO2條件下，高溫導(dǎo)致番茄葉片氣孔孔徑寬度減小，最終使水分散失和植株耐熱性之間達到平衡；梁雯［21］通過研究高溫對杜鵑葉片氣孔及光合特性的影響，發(fā)現(xiàn)高溫導(dǎo)致其氣孔導(dǎo)度改變，從而降低細胞間隙CO2摩爾分數(shù)、凈光合速率、蒸騰速率及水分利用率。

目前，不同耐/感玉米自交系苗期的植株性狀、氣體交換過程和氣孔特性對高溫脅迫的響應(yīng)及其恢復(fù)狀態(tài)尚不清楚。因此，根據(jù)前期篩選的結(jié)果，利用人工氣候室模擬增溫，對耐熱性差異較大的2 個玉米自交系進行研究，以玉米苗期高溫脅迫及恢復(fù)的基因型差異為切入點，研究高溫脅迫對玉米苗期葉片氣孔特性和氣體交換參數(shù)的影響以及高溫條件下它們之間的關(guān)系，旨在為豐富耐熱型玉米種質(zhì)資源提供理論依據(jù)，有助于為未來氣候變化下的夏玉米生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 植株培養(yǎng)及處理

供試玉米材料為前期研究中篩選出的耐熱型自交系13HF1849 和敏感型自交系14HF1406。選取子粒飽滿且大小一致的種子，用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，然后用去離子水沖洗干凈后放入燒杯，加溫水沒過種子浸泡8 h，再用去離子水沖洗，將種子放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿，加去離子水至淹沒濾紙并有淺水層，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱催芽。

取試驗田耕層土壤曬干后過1 cm 篩，每盆（直徑16 cm，高17 cm）加200 g 有機質(zhì)、4 g 過磷酸鈣和12 g 氯化鉀混合，將混合后的土裝至盆缽刻度線，每個自交系各選擇10 粒生長發(fā)育良好的種子移栽至盆缽，在人工氣候室中培育（晝/夜氣溫：26/23 ℃，白天/夜間光周期：14/10 h，濕度60%，CO2濃度為450～480 mg/kg）。

在植株即將進入六葉一心期時，分別放入38 ℃（HT）和28 ℃（CK）條件下處理［22，23］，其他環(huán)境參數(shù)不變。當每盆植株在第7 片葉完全展開時，測量該葉片的生理指標、光合、氣孔、氣體交換等參數(shù)。然后將2 組植株放入常溫（28 ℃）條件下恢復(fù)，直到第9片葉完全展開，再次測量第9 片葉的所有參數(shù)。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1 植株性狀的測定 在試驗期內(nèi)，記錄每片葉完全展開所需天數(shù)，以計算出葉速率，出葉速率為完全展開葉片的數(shù)量除以葉片完全展開所需的天數(shù)；待植株第7 片葉與第9 片葉完全展開后，用卷尺測量株高，并用Li-3000 型葉面積儀測定第7 片葉與第9片葉的葉面積；用SPAD502 型葉綠素儀測量葉基部、葉中部和葉尖3 個部位的葉綠素相對含量，每個部位重復(fù)測定5 次，求其均值。

1.2.2 氣體交換參數(shù)的測定 當植株生長至第7 片葉與第9 片葉完全展開后，用Li-6400 型便攜式光合測定系統(tǒng)測定每盆植株第7 片葉與第9 葉葉基部、葉中部和葉尖部的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等氣體交換參數(shù)，測量時的葉室環(huán)境條件為光照度1 000 μmol/（m2·s），濕度60%，溫度為38/28 ℃，CO2濃度為480 mg/kg，植株的穩(wěn)定時間為2.5～5.0 min。以葉基、葉中、葉尖3 個部位的均值為最終參數(shù)。瞬時水分利用效率為凈光合速率與蒸騰速率的比值，潛在水分利用效率為凈光合速率與氣孔導(dǎo)度的比值［24］。

1.2.3 氣孔性狀的測定 與氣體交換參數(shù)測定的時間和葉片一致，采用印跡法取樣，在每盆植株第7 片葉與第9 片葉的葉基部、葉中部和葉尖部位涂上無色透明的指甲油，采集面積為20 mm×10 mm，用膠頭滴管在載玻片上滴一滴去離子水，待葉片上的指甲油風干后，用鑷子撕下薄膜放在載玻片的水滴上，展開鋪平，蓋上蓋玻片，自然晾干備用。

將帶有氣孔印記樣品的載玻片用裝備有相機的Nikon 顯微鏡觀察（YS100 型，尼康株式會社），隨機選擇3 個視野拍照，每個視野拍3 張照片，利用配套軟件系統(tǒng)對每張照片的氣孔密度、表皮細胞密度進行統(tǒng)計和計算，每張照片選取10 個氣孔測量氣孔孔徑寬度、氣孔最大長度、氣孔最大寬度以求氣孔面積。氣孔和表皮細胞密度表示為單位面積內(nèi)氣孔和表皮細胞的數(shù)量。氣孔孔徑寬度是指氣孔兩端保衛(wèi)細胞連接處之間的長度。氣孔面積=氣孔最大長度×氣孔最大寬度×3.14×0.25。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 和DPS 統(tǒng)計軟件進行分析。用Pearson 相關(guān)性檢驗分別分析了高溫條件下氣孔的性狀與光合生理參數(shù)的關(guān)系。采用t檢驗分析了高溫與對照各參數(shù)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同耐/感玉米自交系植株及葉片生理指標對高溫的響應(yīng)及其恢復(fù)

由圖1、圖2 可知，與對照組相比，高溫處理使熱敏感型自交系植株第7 片葉的葉面積、株高和SPAD分別下降了39、33 和31 個百分點，下部葉片出現(xiàn)大面積的萎蔫、褐化和黃化，部分新葉也逐漸呈相似趨勢，生長明顯受到抑制；相反，耐熱型自交系受高溫影響較小，在高溫條件下的生長趨勢與常溫對照相比無較大差異，SPAD甚至增加了9 個百分點。2 個自交系的出葉速率均受到顯著影響，呈減緩趨勢。

圖1 高溫處理及常溫恢復(fù)對耐熱型自交系13HF1849（a、b）和熱敏感型自交系14HF1406（c、d）植株表型的影響

圖2 高溫處理及常溫恢復(fù)對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 葉面積（a、b）、株高（c、d）、葉綠素相對含量（e、f）和出葉速率（g、h）的影響

經(jīng)過28 ℃恢復(fù)期后，2 個自交系第9 片葉僅出葉速率能與常溫對照保持一致，熱敏感型自交系由于高溫處理導(dǎo)致的葉面積、株高和SPAD并沒有隨著溫度降低而恢復(fù)，但是耐熱型自交系的葉面積和株高呈緩慢回升的趨勢。

2.2 不同耐/感玉米自交系氣體交換參數(shù)對高溫脅迫的響應(yīng)及其恢復(fù)

如圖3 所示，與常溫對照相比，高溫導(dǎo)致熱敏感型自交系的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、潛在水分利用效率（iWUE）和氣孔導(dǎo)度（Gs）分別下降25、17、2 和24 個百分點；而耐熱型自交系呈相反趨勢，Pn、Tr、iWUE和Gs分別增加12、49、25 和41 個百分點，且均高于熱敏感型自交系，其中Tr和Gs最為顯著；但是，高溫脅迫使2 個自交系的瞬時水分利用效率（WUE）顯著降低，且耐熱型自交系的WUE低于熱敏感型自交系。經(jīng)過常溫恢復(fù)期后，與對照相比，熱敏感型自交系高溫處理組（第9 片葉）的所有氣體交換參數(shù)均有不同程度的下降，但耐熱型自交系的Tr、iWUE和Gs仍高于對照組。

圖3 高溫處理及常溫恢復(fù)對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 氣體交換參數(shù)的影響

2.3 不同耐/感玉米自交系葉片氣孔特征對高溫的響應(yīng)及其恢復(fù)

2 個玉米自交系的氣孔特性對高溫脅迫的響應(yīng)一致，如圖4 所示，與對照組相比，高溫處理導(dǎo)致2 個自交系的氣孔密度（SD）、氣孔孔徑寬度（SW）和氣孔面積（SA）均顯著增加。耐熱型自交系和熱敏感型自交系的SD分別比對照組增加了30 和27 個百分點，SW分別增加了26 和23 個百分點，SA分別增加了39 和77 個百分點，且熱敏感型自交系所有的氣孔參數(shù)均低于耐熱型自交系。經(jīng)過28 ℃常溫恢復(fù)后，耐熱型自交系和熱敏感型自交系第9 片葉的SD 分別高于對照組39 和63 個百分點，但此時的SW 和SA低于對照組。

圖4 高溫處理及常溫恢復(fù)對耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 葉片氣孔特征的影響

2.4 高溫條件下不同耐/感玉米自交系的凈光合速率和潛在水分利用效率與氣孔參數(shù)和SPAD 之間的關(guān)系

由圖5、圖6 可知，在高溫條件下，2 個試驗材料的凈光合速率分別與氣孔導(dǎo)度、SPAD和氣孔孔徑寬度之間存在顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，而潛在水分利用效率僅與氣孔導(dǎo)度和氣孔孔徑寬度呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。耐熱型自交系的凈光合速率與氣孔導(dǎo)度和SPAD之間的相關(guān)性較高，而熱敏感型自交系的凈光合速率與氣孔孔徑寬度和SPAD之間的相關(guān)性較高。耐熱型自交系的潛在水分利用效率與氣孔導(dǎo)度和氣孔孔徑寬度之間的相關(guān)性較高，熱敏感型自交系的潛在水分利用效率與氣孔孔徑寬度之間的相關(guān)性也較高。

圖5 高溫條件下耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 不同指標與凈光合速率的相關(guān)性

圖6 高溫條件下耐熱型自交系13HF1849 和熱敏感型自交系14HF1406 不同指標與潛在水分利用效率的相關(guān)性

3 討論

研究結(jié)果表明，不同耐/感玉米自交系對高溫脅迫的響應(yīng)不同，38 ℃高溫使熱敏感型自交系苗期的葉面積、株高、葉綠素相對含量和出葉速率呈下降趨勢。這與前人的研究結(jié)果相似，當溫度上升到28 ℃以上時，植株生長開始受到影響，當日平均溫度在30 ℃或35 ℃以上時，株高、總生物量、葉綠素含量和比葉面積呈線性下降［25，26］，40 ℃是玉米營養(yǎng)生長階段的溫度極限［27］。由于高溫導(dǎo)致葉綠素降解，從而造成植株葉片黃化，有機物合成量減少，最終影響到生物量［28］。而高溫條件下耐熱型自交系的葉面積、株高和植株生長狀況與常溫對照相比沒有顯著差異，葉綠素相對含量甚至呈上升趨勢。由此推測，不同溫度條件下植株葉面積和株高等表型生長參數(shù)存在顯著差異可能與2 個自交系的光合性能有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，熱敏感型自交系的凈光合速率下降了25 個百分點，而耐熱型自交系的凈光合速率上升了約12 個百分點。一些學者在早期進行了類似研究，發(fā)現(xiàn)高溫處理后常規(guī)番茄品種的凈光合速率顯著降低，而抗性品種植株在遭遇高溫脅迫后沒有出現(xiàn)降低的趨勢［29］。本研究中出現(xiàn)了抗性自交系的光合速率不降反升的結(jié)果，或許與其氣孔特性有關(guān)。吳冰潔［30］通過研究玉米和高粱的氣孔發(fā)現(xiàn)，無論是近軸面還是遠軸面的氣孔受到抑制，都會導(dǎo)致光合速率降低，且抑制遠軸面氣孔會導(dǎo)致光合速率降低幅度更大，不同作物及其不同品種植株的氣孔對環(huán)境的敏感性差異可能是通過改變CO2分壓來影響其垂直擴散。

前人的研究認為，氣孔孔徑和氣孔導(dǎo)度分別與凈光合速率和水分利用效率呈負相關(guān)關(guān)系，而與蒸騰速率呈正相關(guān)關(guān)系［20］。在不同水分條件下，氣孔導(dǎo)度分別與凈光合速率和潛在水分利用率呈負相關(guān)關(guān)系［31］。植物葉綠素含量和光合作用性能之間也存在相關(guān)性，葉綠素含量越高，玉米葉片的凈光合速率越高，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率越大［32，33］。通過分析本研究結(jié)果之間的相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下，2個玉米自交系的凈光合速率分別與氣孔導(dǎo)度、氣孔孔徑寬度和葉綠素相對含量呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系，而潛在水分利用效率與氣孔導(dǎo)度和氣孔孔徑寬度呈顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。

本研究中，增溫降低了敏感型自交系的潛在水分利用率和蒸騰速率，而耐熱型自交系則呈相反的趨勢。高溫條件下光合性能、蒸騰和水分利用效率變化的主要原因可能是熱脅迫引起的氣孔狀態(tài)變化（氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔面積）。有學者認為，氣孔密度與凈CO2同化率和瞬時水分利用效率呈正相關(guān)關(guān)系［34］。本研究結(jié)果表明，高溫對2 個供試自交系也產(chǎn)生了類似的影響，在高溫脅迫下，自交系的氣孔密度、氣孔孔徑寬度和氣孔面積顯著增加，且耐熱型自交系的基數(shù)和增長率均高于熱敏感型自交系。因此，耐熱型自交系受高溫脅迫的影響較小，這可以歸因于其較高的散熱效率，通過改變氣孔數(shù)目以及單個氣孔的孔徑大小和形狀來改變?nèi)~片氣孔分布格局和每片葉的氣孔總面積［35］。Feller［36］的研究也得到相似的結(jié)果，菜豆葉片在20 ℃到50 ℃下的氣孔開度不同，在溫度為23、30 和35 ℃時，氣孔孔徑分別為0.66、2.76 和4.28 μm。此外，氣孔導(dǎo)度和孔徑大小決定光合作用吸收的CO2量，并通過蒸騰作用控制水分散失量，促進蒸發(fā)冷卻和養(yǎng)分的吸收［37，38］。本研究結(jié)果表明，高溫增加了抗性自交系的氣孔導(dǎo)度、孔徑寬度和SPAD，而熱敏感型自交系則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，這與2 個試驗材料的光合特性變化趨勢一致。推測2 個自交系在高溫條件下的光合特性的差異與其氣孔導(dǎo)度、氣孔孔徑以及SPAD存在聯(lián)系。

另外，氣孔的發(fā)育狀態(tài)也是影響植株光合作用的重要因素，氣孔發(fā)育可以通過改善氣體交換來緩和氣孔限制，從而提高光合性能和蒸騰散熱。溫度是植物感知到的主要環(huán)境信號，能誘導(dǎo)一系列發(fā)育和形態(tài)變化，包括器官生長、花期和氣孔數(shù)量等［39］。玉米等單子葉植物氣孔的發(fā)育過程需要經(jīng)過多個階段，由表皮原細胞形成保衛(wèi)細胞母細胞，再逐漸分裂形成保衛(wèi)細胞和副衛(wèi)細胞，最終形成成熟的氣孔復(fù)合體［40］。氣孔譜系的前體細胞，即分生組織母細胞（MMC）和分生組織能進行自我更新，這些前體細胞的發(fā)育和變化決定了氣孔和表皮細胞的數(shù)量和比例，同時，也由于形成過程中環(huán)境的差異造成一定的氣孔大小差異。氣孔前體細胞的啟動和復(fù)制是由SPCH 蛋白驅(qū)動的，它可以通過調(diào)節(jié)多個基因來促進前體細胞的分裂和形態(tài)轉(zhuǎn)換，并接收外界信號，影響氣孔譜系的活動［41，42］。SPCH 蛋白由MAPK 蛋白激酶和油菜素類固醇（BR）信號通路為靶向，高溫等外界脅迫通過降低MAPK 活性來抑制SPCH 蛋白活性，從而影響氣孔譜系活動［43，44］。由于SPCH 蛋白在氣孔譜系發(fā)育中具有重要作用，所以推測，SPCH 或許是高溫脅迫導(dǎo)致本研究中2 個自交系氣孔導(dǎo)度、密度以及氣孔孔徑寬度增加的原因。另外，PIF4（Phytochrome-interacting factor 4）是高溫感知下游的直接信號，在接收到高溫信號后，能夠調(diào)節(jié)氣孔發(fā)育，缺少PIF4 的植物在高溫條件下會表現(xiàn)出缺陷反應(yīng)。有前人研究了野生型和PIF4 突變體植株對高溫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)野生型植株氣孔密度呈下降趨勢，而突變體植株在高溫條件下的氣孔密度與常溫對照相比無顯著差異，而且高溫條件下，PIF4 能促進SPCH充分積累，以確保氣孔細胞的分化［45］。因此，推測高溫條件下耐熱型自交系氣孔參數(shù)基數(shù)大于敏感型自交系，取決于其SPCH 和PIF4 的表達量，但是具體的結(jié)果還需進一步研究驗證。

本研究中2 個自交系在高溫條件下的瞬時水分利用率均顯著降低，雖然提高蒸騰速率是保護植物免受高溫危害的重要措施之一，但同時也要減少水分損失以實現(xiàn)高效用水。這與前人的一些研究結(jié)果相似，適當?shù)母邷兀?5 ℃）可以增加抗性品種的潛在水分利用率，但當溫度上升到閾值時（40 ℃）便開始降低，同時，常規(guī)品種在35 °C 和40 °C 條件下的潛在水分利用率高于正常溫度［24］。本研究的結(jié)果雖然不能完全描述成熟或整株植物的反應(yīng)，但仍然表明，在高溫脅迫下，植物經(jīng)歷了防止水分流失和蒸騰散熱之間的權(quán)衡。

經(jīng)過常溫恢復(fù)期后，2 個供試自交系的凈光合速率和氣孔孔徑寬度均低于對照組，抗性自交系的光合參數(shù)和氣孔參數(shù)均高于敏感型自交系。耐熱型自交系的蒸騰速率、潛在水分利用效率和氣孔導(dǎo)度均高于對照組，而敏感型自交系則呈相反趨勢。張潔等［46］通過研究高溫及其恢復(fù)對光合特性的影響發(fā)現(xiàn)，氣孔限制因素是高溫處理后處于常溫恢復(fù)期植株光合作用下降的重要原因。在38 ℃的高溫條件下，玉米植株發(fā)生了一系列變化，即使是經(jīng)過常溫恢復(fù)，敏感型自交系的表型特征在短期內(nèi)難以恢復(fù)到正常生長水平，呈持續(xù)的熱損傷狀態(tài)。耐熱型自交系能很快恢復(fù)，或許與其非光化學能量耗散增加和HSP101 蛋白誘導(dǎo)啟動光化學修復(fù)有關(guān)，使其具有更耐熱的光合系統(tǒng)以及有效的光合修復(fù)機制［47］。

4 小結(jié)

與熱敏感型自交系相比，耐熱型自交系在高溫條件下表現(xiàn)出更高的光合和水分利用穩(wěn)定性，在高溫脅迫后恢復(fù)更快，這主要是由于耐熱型自交系具有較大的氣孔導(dǎo)度、氣孔孔徑寬度和葉綠素含量，使CO2同化率增加，最終使光合效率增強，水分利用率提高。經(jīng)過常溫恢復(fù)后，熱敏感型自交系在短期內(nèi)難以恢復(fù)到正常生長水平，呈持續(xù)的熱損傷狀態(tài)，而耐熱型自交系則有更強的恢復(fù)適應(yīng)能力。