宋平麗，李 剛，許建鋒，馬青翠，亓寶秀，2，張玉星

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000；2.利物浦約翰摩爾斯大學(xué)，利物浦 L3 3AF)

赤霉素(Gibberellin，GA)是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用的一種植物激素。GA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程主要是通過(guò)形成GA-GID1(Gibberellin insensitive dwarf 1)復(fù)合體后再與DELLA結(jié)合，誘導(dǎo)DELLA被泛素化降解，從而解除DELLA的阻遏作用，引起下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致GA反應(yīng)[1]。其中赤霉素受體GID1是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中與赤霉素特異性結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，是植物感知赤霉素信號(hào)所必需的受體蛋白，對(duì)GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用[2]。

2005年GID1基因首次在水稻GA不敏感的矮化突變體gid1中被鑒定出來(lái)[2]。2006年，研究人員在擬南芥基因組中鑒定出3個(gè)水稻GID1的同源基因，分別是AtGID1a、AtGID1b和AtGID1c，單基因突變均不會(huì)引起矮化表型，但是三突卻表現(xiàn)出GA不敏感的極矮化表型，證明它們功能冗余[3-4]。Hollender等[5]發(fā)現(xiàn)，桃樹(Prunuspersica)發(fā)育遲緩性侏儒癥(Brachytic dwarfism trait)是由于赤霉素受體PpeGID1c無(wú)義突變?cè)斐傻?，且改變GID1c的表達(dá)可以在不影響果實(shí)發(fā)育的情況下控制樹體大小。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，赤霉素受體GID1基因已相繼從楊樹[6]、棉花[7]、茶樹[8]、甘藍(lán)型油菜[9]、板栗[10]、葡萄[11]等物種中成功分離和表達(dá)。

CRISPR/Cas9 技術(shù)自2013年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，迅速被國(guó)際生物界關(guān)注并應(yīng)用，已經(jīng)成為基因組定點(diǎn)編輯的首選方法。目前，在園藝植物上也獲得了一些成功案例[12]。Illouz-Eliaz等[13]針對(duì)番茄中存在的3個(gè)GID1，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了單突、雙突和三突，發(fā)現(xiàn)在適宜生長(zhǎng)條件下，只有三突(gid1TRI)長(zhǎng)勢(shì)弱小，葉色黑綠，而單突卻沒(méi)有明顯的表型，證明3個(gè)GA受體在適宜條件下功能冗余。以上研究也為CRISPR編輯技術(shù)在其他植物進(jìn)行GID1基因編輯提供了重要參考。

杜梨以其抗性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，與梨品種嫁接親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為我國(guó)北方應(yīng)用最為廣泛的砧木[14]。由于其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，嫁接品種后樹體高大，給梨樹矮化密植栽培帶來(lái)較大的困難。本研究以杜梨為試材，通過(guò)克隆PbGID1家族基因，分析其氨基酸序列，設(shè)計(jì)相關(guān)突變關(guān)鍵靶位點(diǎn)，構(gòu)建一套可同時(shí)編輯PbGID1家族基因的CRISPR/Cas9載體，轉(zhuǎn)化至杜梨子葉并再生出陽(yáng)性植株，旨在為將來(lái)獲得矮化杜梨砧木提供理論和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用杜梨葉片取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心杜梨資源圃，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存。

試劑及菌株：PrimeSTAR?Max DNA Polymerase高保真DNA聚合酶和T4DNA連接酶訂購(gòu)于TaKaRa公司，BsaⅠ-HF購(gòu)自New England Biolabs(NEB)公司，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體購(gòu)自北京全式金生物，KOD-Plus高保真酶訂購(gòu)于東洋紡生物科技有限公司，DNA純化和膠回收試劑盒、引物合成和其他試劑均訂購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。植物表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和CRISPR/Cas9中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1、pYLgRNA-AtU6-29均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授課題組提供[15]。農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 杜梨總RNA提取、cDNA合成和基因組DNA提取

杜梨總RNA提取參照TIANGEN RNA prep Pure Plant Kit提供的方法(天根生化科技有限公司)；cDNA合成參照TIANGEN FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒提供的方法(天根生化科技有限公司)；gDNA采用M5 HiPer Plus多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒提取(北京聚合美生物科技有限公司)。

1.3 基因結(jié)構(gòu)及氨基酸序列分析

根據(jù)杜梨測(cè)序基因組數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，利用擬南芥AtGID1基因序列進(jìn)行同源搜索，針對(duì)搜索的序列設(shè)計(jì)相關(guān)克隆引物(表1)。分別以杜梨cDNA和gDNA為模板擴(kuò)增PbGID1家族基因。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 2 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，連接至pEASY-Blunt Zero Cloning Kit克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，挑取單克隆測(cè)序。

利用GSDS(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn)在線軟件[16]，對(duì)測(cè)序的cDNA序列和基因組DNA序列構(gòu)建基因結(jié)構(gòu)；采用ClustalW 2(https：// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用 GeneDoc軟件對(duì)序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯并輸出。

1.4 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及載體構(gòu)建

根據(jù)克隆的杜梨PbGID1s基因序列，使用CRISPR-P v2.0(crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2.0/)在線軟件尋找潛在靶位點(diǎn)。靶點(diǎn)序列應(yīng)位于基因外顯子區(qū)域且不跨越內(nèi)含子；靶點(diǎn)序列盡量不要包含4個(gè)及以上連續(xù)的胸腺嘧啶T；根據(jù)靶點(diǎn)GC含量和位置選擇潛在靶點(diǎn)，最終確定8個(gè)靶點(diǎn)T1～T8。

根據(jù)唐雨薇等[17]報(bào)道的方法進(jìn)行載體構(gòu)建，載體系統(tǒng)包含雙元植物表達(dá)載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N和針對(duì)8個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)盒中間載體pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29。引物參照表2合成，共需要進(jìn)行2輪PCR，第1輪PCR針對(duì)每一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行2個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，T1～T8的2個(gè)反應(yīng)依次為：U-F/AtU3dT1(反應(yīng)①)和gRT1/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3bT2(反應(yīng)①)和gRT2/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-1T3(反應(yīng)①)和gRT3/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-29T4(反應(yīng)①)和gRT4/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3bT5(反應(yīng)①)和gRT5/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-1T6(反應(yīng)①)和gRT6/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU6-29T7(反應(yīng)①)和gRT7/gR-R(反應(yīng)②)；U-F/AtU3dT8(反應(yīng)①)和gRT8/gR-R(反應(yīng)②)；第2輪PCR取第1輪反應(yīng)①和②的PCR產(chǎn)物混合為模板，用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4、Pps-GG4/Pgs-GG5、Pps-GG5/Pgs-GG6、Pps-GG6/Pgs-GG7、Pps-GG7/Pgs-GG8、Pps-GG8/Pgs-GGL擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收，即獲得相應(yīng)的T1-gRNA至T8-sgRNA表達(dá)盒片段。

將雙元載體pYLCRISPR/Cas9P35S-N質(zhì)粒與8個(gè)sgRNA表達(dá)盒回收片段，按表3提供的試劑比例添加，采用酶切-連接方法進(jìn)行構(gòu)建，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，以卡那霉素(Kanamycin，Kan)篩選陽(yáng)性菌落，并挑取單克隆，利用SP-L2/SP-R-C特異引物檢測(cè)目標(biāo)條帶大小，菌液測(cè)序后提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105備用。

表2 CRISPR/Cas9-PbGID1s 載體構(gòu)建所需引物Tab.2 Primers for CRISPR/Cas9-PbGID1s vector construction

表3 表達(dá)載體構(gòu)建體系Tab.3 Expression vector construction system

1.5 杜梨子葉浸染及遺傳轉(zhuǎn)化

杜梨子葉再生參照林靜[18]的方法，遺傳轉(zhuǎn)化參照龐宏光[19]的方法，主要操作包括：杜梨種子消毒、子葉誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)4個(gè)步驟。

陽(yáng)性植株檢測(cè)：將在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的抗性芽及對(duì)照正常培養(yǎng)40 d后，對(duì)抗性苗和對(duì)照植株進(jìn)行編號(hào)，提取基因組DNA，根據(jù)表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)特異引物VecF/VecR(表4)，凝膠成像后根據(jù)條帶大小判斷抗性苗是否為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜梨PbGID1s基因克隆

以杜梨cDNA和基因組DNA為底物進(jìn)行PbGID1s的克隆，利用特異引物(表1)，克隆到杜梨PbGID1家族的4個(gè)成員，分別命名為PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，如圖1所示，PbGID1b-1、PbGID1b-2，PbGID1c-1和PbGID1c-2的CDS序列分別為1 041，1 041，1 095，1 035 bp，DNA全長(zhǎng)分別為1 401，1 373，1 706，1 640 bp?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PbGID1s家族成員均含有2個(gè)外顯和1個(gè)內(nèi)含子(圖1-C)。

2.2 PbGID1s氨基酸序列分析

對(duì)4個(gè)杜梨PbGID1s氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)(圖2)，4個(gè)PbGID1蛋白中均存在激素敏感酯酶家族保守的HGG和GXSXG保守域。擬南芥AtGID1s蛋白序列包含13個(gè)與GA或 DELLA的結(jié)合區(qū)，N端至C端依次為TWVLIS、LDR、FFHGGSF、HS、IYD、YRR、DGW、GDSSGGNI、GNI、MF、LDGKYF、WYW和 GFY[20]，對(duì)PbGID1s的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，除PbGID1b-1蛋白LDR結(jié)構(gòu)域中的D被E取代外，其他結(jié)合區(qū)序列一致。以上結(jié)果表明，杜梨4個(gè)PbGID1s蛋白均具有GID1家族特有的保守結(jié)構(gòu)，且在GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要功能的氨基酸結(jié)構(gòu)域與模式植物高度相似，屬于GID1家族成員。

表4 陽(yáng)性植株檢測(cè)引物Tab.4 Primers for detection of positive plantlets and gene editing effect

A、B.分別以杜梨cDNA(A)和gDNA(B)為模板的PCR電泳圖。1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2。C.PbGID1s基因結(jié)構(gòu)。A，B.Gel electrophoresis of PCR products amplified using cDNA(A)or gnomonic DNA(B)of Pyrus betulifolia as template.1.PbGID1c-1；2.PbGID1c-2；3.PbGID1b-1；4.PbGID1b-2.C.Gene structure of PbGID1s.

2.3 基因編輯打靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

針對(duì)杜梨PbGID1家族的每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)2～3個(gè)靶點(diǎn)，以此降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，且靶點(diǎn)位置應(yīng)在保守結(jié)構(gòu)域HGG、GXSXG或關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域上游，使PbGID1s發(fā)生關(guān)鍵位點(diǎn)的缺失或突變，進(jìn)而失去功能。PbGID1s靶點(diǎn)選擇如圖3所示，共設(shè)計(jì)8個(gè)靶點(diǎn)，其中靶點(diǎn)T2、T6靶向PbGID1c-1，T1靶向PbGID1c-2，T3靶向PbGID1c-1和PbGID1c-2；T7靶向PbGID1b-1，T4、T8靶向PbGID1b-2，T5靶向PbGID1b-1和PbGID1b-2。

2.4 sgRNA表達(dá)盒和PbGID1s基因編輯載體構(gòu)建

sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建采用2輪PCR的方法，第1輪PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4-A所示，靶點(diǎn)T1/T8、T2/T5、T3/T6和T4/T7分別以pYLgRNA-AtU3d、pYLgRNA-AtU3b、pYLgRNA-AtU6-1和pYLgRNA-AtU6-29為底物各進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)，前后2段(前段用F表示，后段用R表示)PCR產(chǎn)物分別均為150/130 bp，400/130 bp，350/130 bp，370/130 bp左右。

右側(cè)數(shù)字表示氨基酸位置。HSL家族的HGG和GXSXG保守域由星號(hào)標(biāo)出；橫線區(qū)域?yàn)镚A或DELLA蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。The numbers in the right indicate positions of the amino acid sequences of cDNA.The HGG and GXSXG conserved domains of the HSL family are marked by asterisks；the underlined regions are the binding sites for GA or DELLA proteins.

紅色NGG代表PAM序列。NGG highlighted in red are PAMs.

第2輪PCR將含有靶點(diǎn)序列的2個(gè)PCR產(chǎn)物混合后共同作為底物，使2個(gè)片段疊加成一個(gè)表達(dá)盒，擴(kuò)增結(jié)果如圖4-B所示，其中攜帶T1、T2/T5、T3/T6、T4/T7和T8靶點(diǎn)序列的表達(dá)盒片段分別依次為288，532，488，503，289 bp，通過(guò)電泳檢查8段產(chǎn)物大小均符合預(yù)期，測(cè)序后證明sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建成功。

將8個(gè)sgRNA表達(dá)盒按表4體系構(gòu)建至載體后，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性單克隆的菌液測(cè)序發(fā)現(xiàn)在pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體中包含數(shù)目不等的靶點(diǎn)序列，其中最多包含5個(gè)靶點(diǎn)，分別是T1、T5、T6、T7、T8(圖4-C)，目標(biāo)靶點(diǎn)與啟動(dòng)子在載體連接順序?yàn)锳tU3d+T1-AtU3b+T5-AtU6-1+T6-AtU6-29+T7-AtU3d+T8。該序列位于pYLCRISPR/Cas9P35S-N載體2個(gè)BsaⅠ酶切位點(diǎn)之間，以上結(jié)果證明成功將帶有5個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)盒構(gòu)入CRISPR/Cas9載體序列當(dāng)中，且能同時(shí)靶向PbGID1家族的4個(gè)基因。

A.第1輪PCR跑膠圖；B.第2輪PCR跑膠圖；C.重組質(zhì)粒示意圖。A.First round PCR electropherogram；B.Second round PCR electropherogram；C.Schematic diagram of plasmid recombination.

2.5 杜梨子葉遺傳轉(zhuǎn)化

將上述成功構(gòu)入5個(gè)靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105中用于浸染杜梨子葉，試驗(yàn)重復(fù)3次，分別對(duì)浸染子葉數(shù)目、抗性子葉數(shù)目、抗性芽數(shù)目、陽(yáng)性苗數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示：第1次試驗(yàn)共浸染杜梨子葉195粒，具有抗性芽的子葉為32粒，占總數(shù)的16.41%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2.01，陽(yáng)性苗為10株；第2次試驗(yàn)共浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為21粒，占總數(shù)的10.50%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2，陽(yáng)性苗為8株；第3次試驗(yàn)浸染杜梨子葉200粒，具有抗性芽的子葉為33粒，占總數(shù)的16.50%，每粒子葉再生抗性芽數(shù)目為2.15，陽(yáng)性苗15株。3次試驗(yàn)共計(jì)浸染595粒杜梨子葉，獲得抗性芽176個(gè)，陽(yáng)性植株33株，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到5.55%。對(duì)第2次試驗(yàn)結(jié)果中的抗性苗及對(duì)照苗提取基因組gDNA，用載體特異序列VecF和VecR(表4)為引物擴(kuò)增，部分結(jié)果如圖5所示，空載體序列(22)為1 750 bp左右；共篩選出8株陽(yáng)性苗分別編號(hào)3、6、7、11、12、15、20、23，因?qū)gRNA表達(dá)盒構(gòu)建入載體，使得PCR擴(kuò)增片段為3 000 bp左右，以上結(jié)果證明該CRISPR/Cas9表達(dá)載體已成功轉(zhuǎn)入杜梨基因組。

表5 杜梨遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果Tab.5 Genetic transformation result analysis of Pyrus betulifolia

1～21，23.部分轉(zhuǎn)化植株；22.陽(yáng)性對(duì)照(空載體)；24.未轉(zhuǎn)化植株。1—21，23.Partially transformed plantlets；22.Positive control(empty vector)；24.Untransformed negative control plantlet.

3 結(jié)論與討論

赤霉素受體蛋白GID1在GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，負(fù)調(diào)控因子DELLA蛋白阻遏GA信號(hào)，而GA-GID1-DELLA復(fù)合體的形成是阻遏蛋白DELLA被降解的前提[21]，并且該復(fù)合體的形成也會(huì)一定程度降低植物體內(nèi)游走的DELLA蛋白含量，從而降低DELLA蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用[22]。Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)，壽星桃作為一種對(duì)GA處理不敏感的矮化突變體就是因?yàn)镻pGID1c的第191位氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致其不能與DELLA發(fā)生互作引起的矮化。因此GID1功能喪失或改變，使其不能形成復(fù)合體，可能會(huì)抑制或阻遏GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使植株出現(xiàn)對(duì)GA不敏感的矮生表型。本研究利用同源克隆方法克隆得到4個(gè)杜梨GID1家族基因，通過(guò)序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)分析推測(cè)該家族基因均符合GID1蛋白特征，可能對(duì)杜梨GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。

CRISPR/Cas9 作為一種由sgRNA介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，能在全基因組水平有選擇性地調(diào)控目的基因表達(dá)，通過(guò)特異性識(shí)別具有PAM序列的目標(biāo)DNA序列，對(duì)特定的靶點(diǎn)進(jìn)行高效編輯；CRISPR/Cas9可以同時(shí)對(duì)任意數(shù)量基因進(jìn)行編輯，因其具有高效、精準(zhǔn)和便捷等特點(diǎn)，已經(jīng)逐漸發(fā)展成為研究基因功能及物種定向改造的常用工具。但是，受限于遺傳轉(zhuǎn)化體系的不成熟，在木本植物尤其是在梨樹上的應(yīng)用仍存在很大困難。杜梨作為實(shí)生砧木在梨樹生產(chǎn)中具有重要作用，但是以杜梨為砧木的嫁接品種生長(zhǎng)后期往往樹體高大，不利于矮化密植栽培的應(yīng)用。所以通過(guò)利用CRISPR基因編輯技術(shù)定向突變杜梨PbGID1s基因，使其獲得矮生性狀成為可能。目前，楊鋒等[24]已經(jīng)通過(guò)構(gòu)建雙靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9基因編輯載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將GUS轉(zhuǎn)基因紅茄梨愈傷組織的GUS基因敲除。Pang等[25]利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法敲除杜梨PbPAT14基因。本研究在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含有5個(gè)靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9編輯載體，并成功利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式將該載體轉(zhuǎn)入杜梨基因組，為杜梨遺傳轉(zhuǎn)化提供方法支持。

盡管經(jīng)過(guò)多次嘗試和改良，本研究中心將該表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入杜梨子葉并獲得陽(yáng)性植株。但遺憾的是，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性植株P(guān)bGID1s基因靶點(diǎn)前后約200～300 bp區(qū)域克隆并測(cè)序發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性植株均未發(fā)生編輯事件。究其原因，可能與本研究選用載體的啟動(dòng)子非杜梨內(nèi)源啟動(dòng)子而是擬南芥特異啟動(dòng)子有關(guān)。Charrier等[26]在蘋果中，利用蘋果內(nèi)源啟動(dòng)子U3和U6改造的CRISPR載體編輯效率顯著提高；Ren等[27]通過(guò)在葡萄中克隆本源啟動(dòng)子VvU3/U6啟動(dòng)sgRNA和UBQ2啟動(dòng)子啟動(dòng)Cas9蛋白后，也顯著提高CRISPR/Cas9載體在葡萄中的編輯效率。所以針對(duì)以上問(wèn)題，接下來(lái)河北省梨工程技術(shù)研究中心將圍繞杜梨本源啟動(dòng)子改造CRISPR/Cas9載體進(jìn)行研究，在完善遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，為獲得杜梨矮生資源提供保障。

本研究克隆了4個(gè)杜梨PbGID1基因家族成員，PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1和PbGID1c-2，均由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，且PbGID1s的氨基酸序列均含有HGG和GXSXG特征保守結(jié)構(gòu)域和能與GA、DELLA結(jié)合的關(guān)鍵序列，具有赤霉素受體功能；成功將含有5個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA表達(dá)盒構(gòu)建至CRISPR/Cas9基因編輯載體，并可同時(shí)靶向PbGID1家族的4個(gè)基因；利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，將CRISPR/Cas9-PbGID1s基因編輯載體轉(zhuǎn)入杜梨子葉，成功再生出陽(yáng)性植株。