李 杰，黃曉宇，尚學(xué)峰，楊姣姣，張娟麗，謝開會(huì)，張亞麗，閆尊強(qiáng)，王鵬飛，高小莉，楊巧麗，馬艷萍，滾雙寶，3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬技術(shù)工程研究中心，甘肅 蘭州 730070)

我國(guó)作為世界第一大花椒生產(chǎn)國(guó)，花椒種植歷史悠久，品種齊全，種植面積超過113萬(wàn)hm2，主產(chǎn)區(qū)產(chǎn)量超過37萬(wàn)t[1-2]?；ń饭こＳ米髡{(diào)味品，花椒籽為花椒的主要副產(chǎn)品，占花椒總質(zhì)量的60%以上[3]，花椒籽油中富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，多不飽和脂肪酸種類多且含量高[4-5]。李路路[6]研究發(fā)現(xiàn)，花椒籽油中多不飽和脂肪酸高達(dá)85%。隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)豬肉品質(zhì)有了更高的要求，肌內(nèi)脂肪、脂肪酸含量是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的指標(biāo)，直接影響著肉的風(fēng)味和口感。然而，豬肉中多不飽和脂肪酸的合成需要中間產(chǎn)物(亞油酸、α-亞麻酸等)，且胴體中的脂肪酸含量與飼料有直接關(guān)系[7]?；ń纷阎懈缓退?、亞油酸、a-亞麻酸、棕櫚酸等脂肪酸[8]，是豬從飼料中獲取脂肪酸較為理想的來源，在飼料工業(yè)中具有較好的利用價(jià)值。近年來，對(duì)花椒籽的開發(fā)利用方面研究炙熱，已有學(xué)者在雞[9]、魚[6]、豬[10]上進(jìn)行試驗(yàn)，研究均表明，在日糧中添加一定比例的花椒籽粉可提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。由此可見，花椒籽可在飼料行業(yè)開發(fā)利用，它的合理利用有望節(jié)約生產(chǎn)成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，解決花椒生產(chǎn)中副產(chǎn)品浪費(fèi)的問題。

脂肪酸結(jié)合蛋白2基因(Fatty acid-binding protein 2 gene，F(xiàn)ABP2)，蛋白分子質(zhì)量較小(14～15 ku)，屬于脂肪酸結(jié)合蛋白家族(FABPs)[11]，該家族基因大多含有多態(tài)性位點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝途徑來提高肉品質(zhì)，其多態(tài)性位點(diǎn)間接影響肌內(nèi)脂肪含量[12-13]，F(xiàn)ABPs的這種生物學(xué)功能對(duì)豬肉肌內(nèi)脂肪沉積有潛在影響。肌內(nèi)脂肪是豬肉品質(zhì)評(píng)定的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]，其含量影響肉的風(fēng)味?，F(xiàn)階段育種對(duì)豬肉肌內(nèi)脂肪含量要求較高，如何增加肌內(nèi)脂肪含量、提高肉品質(zhì)，是當(dāng)今育種工作者的目標(biāo)和難點(diǎn)。而FABP2與體內(nèi)脂肪沉積相關(guān)聯(lián)，可作為影響肌內(nèi)脂肪含量的候選基因，主要參與哺乳動(dòng)物長(zhǎng)鏈脂肪酸的運(yùn)輸和吸收，影響脂類代謝[15-16]。其次可以通過調(diào)節(jié)參與脂質(zhì)代謝的基因和提高脂肪酸水溶性來促進(jìn)腸道對(duì)多不飽和脂肪酸的吸收[17-18]。除此之外，F(xiàn)ABP2基因還與膽汁酸和維生素具有較高的親和力[19]，這表明FABP2具有極其重要的生理作用。

為了尋找與豬脂肪沉積有關(guān)的基因，本試驗(yàn)通過研究FABP2在不同比例花椒籽飼喂育肥豬中的組織差異表達(dá)，以及對(duì)其編碼區(qū)進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，以期為花椒籽的開發(fā)利用和FABP2基因作為肌內(nèi)脂肪沉積候選基因的相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本試驗(yàn)所用組織樣為畜牧學(xué)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期試驗(yàn)保存[10]。試驗(yàn)對(duì)象為288頭90日齡杜×長(zhǎng)×大三元雜交育肥豬(33 kg)，由臨夏州眾惠豬業(yè)科技有限公司提供，將其隨機(jī)分為4組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18頭豬；對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，各試驗(yàn)組分別用花椒籽代替飼糧中2.5%(試驗(yàn)Ⅰ組)、5.0%(試驗(yàn)Ⅱ組)、7.5%(試驗(yàn)Ⅲ組)的玉米，預(yù)試驗(yàn)7 d，正試期100 d。試驗(yàn)結(jié)束后，屠宰豬只，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、盲腸和背肌組織，液氮迅速冷凍，-80 ℃超低溫冰箱長(zhǎng)期保存。

1.2 試驗(yàn)主要試劑

TRIzol試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司，2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自擎科生物公司(西安)，2×Taq PCR Master Mix和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，pMDTM19-T Vector購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，其他常用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

用TRIzoL提取豬各組織中總RNA，用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒合成cDNA，具體步驟如下：①去除基因組DNA，反應(yīng)體系10 μL，其中5× gDNA Clean Reaction Mix 2 μL，Total RNA 2 μL，RNase free water 6 μL，反應(yīng)條件為42 ℃，2 min；4 ℃保存。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，步驟①反應(yīng)液10 μL，5× Evo M-MLV RT Reaction Mix 4 μL，RNase free water 6 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定cDNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 FABP2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬的FABP2基因參考序列(NM_001031780.1)、內(nèi)參基因GAPDH參考序列(NM_001206359.1)，利用Primer 5.0在線軟件分別設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，由中科羽瞳生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.5 FABP2的表達(dá)檢測(cè)

以3個(gè)處理組中不同組織的cDNA為模板，采用qRT-PCR檢測(cè)FABP2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、盲腸和背肌各組織及各試驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR反應(yīng)總體系為20 μL：2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以2-ΔΔCt法[20]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 三元雜交育肥豬FABP2基因克隆及測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化，將膠回收cDNA與pMDTM19-T Vector載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，加入不含Amp的LB培養(yǎng)基中。搖床振蕩培養(yǎng)1 h后，取適量菌液涂到含Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。接著挑取單個(gè)白色菌落置于LB(含Amp)液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)4～5 h。經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增，將陽(yáng)性克隆菌液送至西安擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 生物信息學(xué)分析

本試驗(yàn)通過多種生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆得到的三元雜交育肥豬FABP2基因的CDS區(qū)進(jìn)行分析。所用在線軟件及程序見表2。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 FABP2基因在三元雜交育肥豬各組織差異表達(dá)

由圖1可知，F(xiàn)ABP2在三元雜交育肥豬各組織中均有不同程度表達(dá)，在空腸中顯著高表達(dá)(P<0.05)，背肌中表達(dá)量最低。但是總體來說在腸道組織的表達(dá)量較高。用不同比例花椒籽替代部分玉米飼喂三元雜交育肥豬后，與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組在心臟、肺臟、腎臟、十二指腸、空腸和盲腸組織中，F(xiàn)ABP2顯著下調(diào)表達(dá)(P<0.05)；脾臟和回腸組織中，F(xiàn)ABP2在試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組中顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；肝臟、結(jié)腸、直腸組織中，F(xiàn)ABP2在試驗(yàn)Ⅰ組顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；FABP2在各試驗(yàn)組不同組織中的表達(dá)無(wú)明顯規(guī)律(圖2)。

表2 生物信息學(xué)分析軟件Tab.2 Bioinformatics analysis software

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.2.

圖2 FABP2基因在不同比例花椒籽飼喂三元雜交育肥豬的組織差異表達(dá)Fig.2 FABP2 gene was differentially expressed in tissues of DLY fattening pigs fed with different proportions of Zanthoxylum seed

2.2 三元雜交育肥豬FABP2基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

用TRIzol法提取三元雜交育肥豬回腸組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得一條427 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段大小一致(圖3)。測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)ABP2基因序列全長(zhǎng)427 bp，包括5′UTR區(qū)10 bp，3′UTR區(qū)18 bp和CDS區(qū)399 bp，編碼132個(gè)氨基酸，其中152位點(diǎn)處的堿基A突變?yōu)镚(圖4)，導(dǎo)致第51位點(diǎn)的賴氨酸突變?yōu)榫彼?；核苷酸序?08位點(diǎn)的堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第103位點(diǎn)的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，均為錯(cuò)義突變(圖5)。

M.DNA Marker DL2000；1，2.FABP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DNA Marker DL2000 ；1，2.PCR amplification product of FABP2 gene.

2.3 同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

用NCBI中的Blast在線軟件，分析克隆所得三元雜交育肥豬FABP2CDS區(qū)序列與其他物種CDS區(qū)序列的同源性，結(jié)果顯示，三元雜交育肥豬FABP2CDS區(qū)序列與綿羊(XM_004009588.5)、馬(NM_001081903.2)、牛(NM_001025332.1)、犬(XM_038444525.1)、智人(NM_000134.4)、獼猴(XM_015139143.2)、小鼠(NM_007980.3)、大鼠(NM_013068.1)、雞(NM_001007923.2)的同源性分別為87.72%，83.33%，87.47%，88.97%，85.96%，86.97%，79.39%，81.42%，72.08%。其中，三元雜交育肥豬與綿羊親緣關(guān)系最近，與雞親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，利用MEGA 7.0軟件計(jì)算不同物種間的遺傳距離(表3)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)，分析結(jié)果與同源性比對(duì)相吻合。

圖4 測(cè)序結(jié)果分析Fig.4 Analysis of sequencing results

圖5 氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of amino acid sequences

2.4 三元雜交育肥豬FABP2蛋白理化性質(zhì)分析

用ProtParam軟件預(yù)測(cè)三元雜交育肥豬FABP2蛋白的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，分子式為C677H1066N186O205S4，分子質(zhì)量為15.219 27 ku，原子總數(shù)為2 138，理論等電點(diǎn)(pI)為6.61，偏酸性；其中天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)所占比例最高(9.80%)，組氨酸(His)最低(0.80%)(圖7)；哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外估計(jì)半衰期為30 h，大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h，酵母體內(nèi)大于20 h；消光系數(shù)(γ=280 nm)為16 960；脂肪族氨基酸指數(shù)為78.94，不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為25.92，表明該蛋白是穩(wěn)定蛋白。

2.5 三元雜交育肥豬FABP2蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用在線軟件SOMPA預(yù)測(cè)三元雜交育肥豬FABP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示(圖8)，F(xiàn)ABP2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，其中延伸鏈占37.12%，由49個(gè)氨基酸殘基組成；無(wú)規(guī)則卷曲占32.58%，由43個(gè)氨基酸殘基組成；α-螺旋占18.94%，由25個(gè)氨基酸殘基組成；β-轉(zhuǎn)角占11.36%，由15個(gè)氨基酸殘基組成。用Phyre2在線軟件通過同源建模法構(gòu)建三元雜交育肥豬FABP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致。同時(shí)對(duì)其親緣關(guān)系最近的綿羊和最遠(yuǎn)的雞構(gòu)建模型，三元雜交育肥豬三級(jí)結(jié)構(gòu)與綿羊相比差異較小，雞延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例均低于三元雜交育肥豬，表明二者蛋白在三級(jí)結(jié)構(gòu)上存在差異，在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用也有所不同，但三者的三級(jí)結(jié)構(gòu)都主要由延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，這也是氨基酸序列保守性的原因(圖9)。

表3 不同物種間遺傳距離Tab.3 Genetic distance between different species

圖6 不同物種FABP2基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of FABP2 gene in different species

圖7 氨基酸組成及頻率Fig.7 Amino acid composition and frequency

h.α-螺旋；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無(wú)規(guī)則卷曲；e.延伸鏈。h.α-helix；t.Beta angle；c.Random crimp；e.Extension chain.

A.三元雜交育肥豬；B.綿羊；C.雞。A.DLY fattening pigs ；B.Sheep ；C.Chicken.

2.6 三元雜交育肥豬FABP2蛋白親疏水性和跨膜區(qū)分析

運(yùn)用ExPASy在線軟件Protscale對(duì)三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析(圖10-A)，氨基酸序列中，第14位出現(xiàn)最小疏水值(-2.711)，第65位出現(xiàn)最大疏水值(1.967)，親水性氨基酸占比(65%)高于疏水性氨基酸(35%)?？赏茰y(cè)三元雜交育肥豬FABP2蛋白為親水性蛋白。用在線軟件TMHMM預(yù)測(cè)跨膜螺旋區(qū)域(圖10-B)，預(yù)測(cè)期望值為0，表明該蛋白不存在跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

2.7 三元雜交育肥豬 FABP2 蛋白亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽分析

用PSORT Ⅱ Prediction對(duì)蛋白亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明(圖11-A)，該蛋白在細(xì)胞質(zhì)(56.50%)、細(xì)胞核(30.40%)、線粒體(8.70%)和過氧化物酶體(4.30%)中發(fā)揮作用；SignalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽，結(jié)果表明，信號(hào)肽S預(yù)測(cè)均值為0.104，該蛋白不具有信號(hào)肽，可推測(cè)為非分泌蛋白(圖11-B)。

圖10 FAPB2親疏水性分析(A)和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(B)Fig.10 FAPB2 hydrophobicity analysis(A)and transmembrane helical structure domain prediction(B)

圖11 蛋白亞細(xì)胞定位(A)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)(B)Fig.11 Protein subcellular localization(A)and signal peptide prediction(B)

2.8 三元雜交育肥豬 FABP2 蛋白激酶磷酸化和N端糖基化位點(diǎn)分析

利用NetPhos 3.1 Server 在線軟件預(yù)測(cè)三元雜交育肥豬FABP2蛋白的激酶磷酸化修飾位點(diǎn)(圖12-A)，預(yù)測(cè)到絲氨酸在53(2個(gè))，54，72，103位點(diǎn)出現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)，得分分別為0.692，0.503，0.993，0.502，0.520；蘇氨酸在42，49(2個(gè))，55，80，105(2個(gè))位點(diǎn)出現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)，得分分別為0.573，0.817，0.779，0.662，0.508，0.855，0.507；酪氨酸在15位出現(xiàn)活躍位點(diǎn)，得分為0.788，該蛋白的激酶位點(diǎn)有DNAPK、PKC、PKA、CKI、CKII，共5種(表4)。

NetNGlyc預(yù)測(cè)三元雜交育肥豬N端糖基化位點(diǎn)(圖12-B)，預(yù)測(cè)值(0.554 6)大于0.5，預(yù)測(cè)結(jié)果可靠，氨基酸序列中，在70位點(diǎn)存在1個(gè)潛在的N端糖基化位點(diǎn)。

圖12 激酶磷酸化位點(diǎn)(A)和N-端糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(B)Fig.12 Kinase phosphorylation site(A)and N-terminal glycosylation site prediction(B)

表4 三元雜交育肥豬FABP2蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)Tab.4 Possible phosphorylation sites of FABP2 protein in DLY fattening pigs

2.9 三元雜交育肥豬FABP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和折疊無(wú)序化分析

NCBI中預(yù)測(cè)到2～131位點(diǎn)含有一個(gè)Lipocalin-FABP2超家族保守結(jié)構(gòu)域，是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(圖13)。運(yùn)用FoldIndex進(jìn)行固有無(wú)序化分析，存在3個(gè)無(wú)序化區(qū)域，分別在1～35，90～102，105～132區(qū)段，所含氨基酸數(shù)分別為35，13，28個(gè)，未折疊氨基酸總數(shù)76個(gè)(圖14-A)。與親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的雞比較，雞在1～35區(qū)域存在含35個(gè)氨基酸的1個(gè)無(wú)序化區(qū)域，存在很大差異(圖14-B)。與親緣關(guān)系最近的綿羊比較，綿羊存在1個(gè)無(wú)序化區(qū)域，無(wú)序化區(qū)域與雞相同，表明不同物種的蛋白質(zhì)發(fā)揮的功能有所不同(圖14-C)。

3 結(jié)論與討論

FABPs家族成員現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少9種，該家族成員的基因結(jié)構(gòu)基本相同[21]，均屬于低分子量的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)伴侶，在各組織中廣泛表達(dá)，主要參與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控細(xì)胞增殖[22]。FABP2蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種可溶性蛋白質(zhì)[22]，可特異性結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸，吸收膳食脂肪酸[23-24]，參與長(zhǎng)鏈脂肪酸的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸[25]。此生物學(xué)特性對(duì)改善肉品質(zhì)具有潛在價(jià)值，可作為體內(nèi)脂肪沉積的候選基因，在分子育種中前景廣闊。已有學(xué)者克隆了斑馬魚[26]和標(biāo)槍蝦虎魚[22]的FABP2基因，發(fā)現(xiàn)該基因編碼132個(gè)氨基酸。Larkina等[27]認(rèn)為，F(xiàn)ABP2基因可作為雞腹部脂肪沉積的候選基因，但是有關(guān)FABP2基因在三元雜交育肥豬上的研究甚少。

圖13 三元雜交育肥豬FABP2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.13 Conserved domain of FABP2 protein in DLY fattening pigs

A.三元雜交育肥豬；B.雞；C.綿羊。A.DLY fattening pigs；B.Chicken；C.Sheep.

本試驗(yàn)成功克隆了三元雜交育肥豬FABP2基因編碼區(qū)，全長(zhǎng)399 bp，編碼132個(gè)氨基酸。通過組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP2基因在各組織中廣泛表達(dá)，在空腸中相對(duì)表達(dá)量最高，但背肌中相對(duì)表達(dá)量最低。飼糧中添加不同比例花椒籽飼喂三元雜交育肥豬后，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅲ組背肌組織中FABP2顯著上調(diào)表達(dá)。與對(duì)照組相比，空腸中FABP2在各試驗(yàn)組均顯著下調(diào)表達(dá)。當(dāng)添加量為7.5%，三元雜交育肥豬背肌中FABP2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。該研究結(jié)果說明，飼糧中添加花椒籽顯著影響三元雜交育肥豬不同組織中FABP2基因表達(dá)水平。Gajda等[28]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP2在哺乳動(dòng)物空腸中表達(dá)量最高，這與本研究結(jié)果相似。通過三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列與豬氨基酸參考序列的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，三元雜交育肥豬FABP2氨基酸序列存在2處錯(cuò)義突變，即152位點(diǎn)處的堿基A突變?yōu)镚，導(dǎo)致第51位點(diǎn)的賴氨酸突變?yōu)榫彼?；核苷酸序?08位點(diǎn)的堿基T突變?yōu)镃，導(dǎo)致第103位點(diǎn)的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，初步推測(cè)這可能是影響豬脂肪沉積的潛在原因之一，但FABP2基因參與脂質(zhì)代謝的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

同源性分析表明，三元雜交育肥豬與綿羊親緣關(guān)系最近，核苷酸序列同源性為87.72%，種間相似性高，說明FABP2蛋白在物種間具有高度保守性。蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)揮功能具有極其重要的作用，可通過共價(jià)修飾的方式修飾1/3以上的細(xì)胞蛋白，蛋白激酶僅對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸殘基的磷酸化表現(xiàn)出嚴(yán)格的特異性[29]。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)到三元雜交育肥豬FABP2蛋白存在5個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、7個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸位點(diǎn)，預(yù)測(cè)結(jié)果合理。此外，還預(yù)測(cè)到一個(gè)N端糖基化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)糖基化大多在膜結(jié)合蛋白中分布，這也是影響該蛋白穩(wěn)定性和功能發(fā)揮的原因[30]。FABP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，是一種親水性非跨膜蛋白，主要在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和過氧化物酶體中發(fā)揮作用。當(dāng)信號(hào)肽位點(diǎn)S均值大于0.5時(shí)，才具有潛在的信號(hào)肽[31]，三元雜交育肥豬FABP2蛋白信號(hào)肽S預(yù)測(cè)均值為0.104，表明該蛋白不具有信號(hào)肽，是非分泌蛋白，主要在胞質(zhì)中。蛋白質(zhì)固有無(wú)序化在生物體中具有極其重要的意義，是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)功能的重要指標(biāo)之一，與蛋白質(zhì)生物學(xué)特性密切相關(guān)[32]。本試驗(yàn)預(yù)測(cè)到三元雜交育肥豬存在3個(gè)無(wú)序化區(qū)域，無(wú)序化程度高。陳旖婷[33]研究發(fā)現(xiàn)，由脂肪細(xì)胞分泌的Lipocalin與脂肪沉積有關(guān)，三元雜交育肥豬FABP2蛋白在2～131位點(diǎn)含有一個(gè)Lipocalin-FABP2超家族保守結(jié)構(gòu)域(脂質(zhì)運(yùn)載蛋白)，具有配體結(jié)合腔，該研究與本研究結(jié)果相似。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同比例花椒籽替代部分玉米能顯著影響三元雜交育肥豬各組織中FABP2的表達(dá)水平，尤其對(duì)背肌和空腸組織中的表達(dá)影響最為顯著。三元雜交育肥豬FABP2基因CDS序列全長(zhǎng)399 bp，共編碼132個(gè)氨基酸，其CDS序列存在2處錯(cuò)義突變，三元雜交育肥豬FABP2基因與綿羊和牛物種同源性較高。三元雜交育肥豬FABP2蛋白為酸性穩(wěn)定的非分泌蛋白，該蛋白主要以延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，該蛋白無(wú)序化程度高，主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究FABP2蛋白的生物學(xué)特性提供科學(xué)依據(jù)。