向 婭，鐘金城，武志娟，柴志欣

(青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

肌肉組織根據(jù)肌細(xì)胞形態(tài)特征及分布特點可分為平滑肌、心肌和骨骼肌，且骨骼肌和心肌肌原纖維上分布有明暗相間的橫紋，故也將其稱為橫紋肌。肌鈣蛋白 (Troponin，Tn)主要位于肌纖維蛋白的細(xì)肌絲上[1]，包括肌鈣蛋白C(TNNC)、肌鈣蛋白T(TNNT)和肌鈣蛋白I(TNNI)，是肌肉組織收縮和舒張的中樞調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)Ca2+介導(dǎo)的肌動蛋白和肌球蛋白間的相互作用。其中TNNI屬于Ca2+結(jié)合蛋白多基因家族，包括TNNI1、TNNI2和TNNI3等3種亞型[2]。TNNI是肌鈣蛋白-原肌球蛋白調(diào)節(jié)復(fù)合物中的抑制性亞單位，可與肌動蛋白結(jié)合以阻止其與肌球蛋白頭部的結(jié)合發(fā)揮抑制作用[3]，也稱肌鈣蛋白抑制因子，也可通過結(jié)合Ca2+調(diào)控肌球蛋白ATP酶的活性來控制肌肉的收縮活動，進(jìn)一步影響肌纖維組織學(xué)形態(tài)及肌纖維直徑。

研究發(fā)現(xiàn)，TNNI1基因在不同年齡天府肉羊腹肌中的表達(dá)量與肌纖維直徑呈正相關(guān)，與肌纖維密度呈負(fù)相關(guān)[4]。姬改革等[5]發(fā)現(xiàn)，TNNI1基因可能參與了鴨早期發(fā)育骨骼肌纖維發(fā)育及類型的轉(zhuǎn)換。相關(guān)研究顯示，TNNI1可調(diào)控肌纖維的生長發(fā)育。楊華[6]研究顯示，TNNI1在豬幼年個體的心肌和慢收縮骨骼肌纖維中表達(dá)，在成年階段僅在慢收縮骨骼肌纖維中表達(dá)。TNNI1、TNNI3基因在人、小鼠胚胎形成及發(fā)育過程的心肌和慢骨骼肌纖維中均有表達(dá)，且TNNI1在心肌中表達(dá)水平較TNNI3高；在個體幼年期，TNNI1在其心肌中的表達(dá)水平降低，相反TNNI3表達(dá)水平升高；TNNI1在成年階段僅在慢骨骼肌纖維中表達(dá)[7-8]。雜交技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，出生初期大鼠心肌組織存在TNNI1mRNA和TNNI3mRNA[9]，而在9月齡人心肌組織中僅檢測發(fā)現(xiàn)TNNI3mRNA[10]，表明TNNI1和TNNI3在不同年齡段肌肉組織中存在表達(dá)差異。本研究主要分析了TNNI1基因在不同年齡段麥洼牦牛臀肌組織中的表達(dá)趨勢及與肌纖維直徑及密度的相關(guān)性，以及TNNI1、TNNI3在其臀肌和心肌中的表達(dá)模式，以期為深入研究牦牛肌肉生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗樣品

在四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣選取9頭健康雌性麥洼牦牛，其中0.5歲 (犢牛)、1.5～2.5歲(斷奶犢牛)、4.5歲 (成年牛)各3頭，屠宰后采集臀肌及心肌組織樣本各2份，分別置于液氮及4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green Premix Ex TaqⅡ購自TaKaRa公司；TNNI1 Antibody(NBP1-56641)、TNNI3 Antibody(NBP2-20734)及蛋白酶抑制劑均購自Abcam公司；RIPA高效裂解液、SDS-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜、蘇木精、伊紅等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

主要儀器：微量分光光度計(型號NanoDrop 2000)、酶標(biāo)儀(型號Micro17)均購自Thermo公司；Real-Time PCR System(型號QuantStudio 5)購自Life Technologies公司；倒置熒光顯微鏡(型號Axio Observer3)購自ZEISS公司；垂直板電泳和轉(zhuǎn)移裝置(型號Mini-Protean Tetra)購自伯樂(中國)公司等。

1.3 實時熒光定量PCR

TRIzol法提取各組織樣本總RNA。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測所提RNA樣品的質(zhì)量和濃度。檢測合格后，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以先前研究獲得的克隆序列[11]為參考序列，利用Primer 5.0設(shè)計實時熒光定量PCR引物(表1)，引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

反應(yīng)總體積10 μL，反應(yīng)體系為：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ 5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、cDNA模板(400 ng/μL)1.0 μL、ddH2O 3.2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 5 s，共39個循環(huán)。設(shè)置陰性對照且每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt對定量結(jié)果進(jìn)行分析。

相對定量結(jié)果利用2-ΔΔCt法處理。采用SPSS 22.0軟件中One-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

1.4 總蛋白提取及Western Blot

利用組織裂解液提取3個年齡段麥洼牦牛心肌組織總蛋白，并檢測蛋白濃度；以SDS-聚丙烯酰胺電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜后封閉，一抗二抗孵育，洗膜，顯色，曝光后掃描，利用Image J軟件進(jìn)行灰度分析[12]。

1.5 HE染色及統(tǒng)計學(xué)分析

取臀肌、心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色觀察[13]。取臀肌各年齡段樣本切片，在每張切片中隨機(jī)選取5個視野取點拍照。每個樣品制備5張切片，在每張切片每個隨機(jī)視野選取10根肌纖維測其直徑，取其平均值作為單個樣本肌纖維直徑。肌纖維密度為測定每個視野面積中的肌纖維根數(shù)，計算各視野中每平方毫米的肌纖維根數(shù)[14]，并利用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。選取不同年齡段牦牛組織切片，隨機(jī)選取5個視野，利用Image-Pro Plus 6.0測定其平均光密度值[15]。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers for PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 TNNI1、TNNI3 mRNA表達(dá)

由圖1可知，TNNI1在各年齡段麥洼牦牛臀肌組織mRNA表達(dá)趨勢為：成年牛>犢牛>斷奶犢牛，成年牦牛表達(dá)量顯著高于犢牛、斷奶犢牛(P<0.05)，且斷奶犢牛與犢牛間差異不顯著(P>0.05)。

由圖2可知，TNNI1在犢牛心肌組織中表達(dá)量最豐富，其次為斷奶犢牛，在成年牛中表達(dá)量最低，三者間差異顯著(P<0.05)；TNNI3在斷奶犢牛心肌組織中的表達(dá)量顯著高于犢牛、成年牛(P<0.05)，但犢牛與成年牛間差異不顯著(P>0.05)。TNNI1在犢牛心肌組織的表達(dá)量顯著高于TNNI3，而TNNI3在斷奶犢牛及成年牛心肌組織的表達(dá)量顯著高于TNNI1(P<0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2，5，6，9—11同。Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.2，5，6，9—11.

不同大寫字母表示不同基因表達(dá)量之間差異顯著(P<0.05)。Different capital letters indicate significant difference between two genes(P<0.05).

2.2 SDS-PAGE電泳檢測

根據(jù)BCA總蛋白測定數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖3所示，線性擬合公式復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.997 7>0.99，表明該公式可用于計算樣本的蛋白濃度。如圖4所示，各蛋白質(zhì)樣品均一性好，條帶清晰豐富，可用于后續(xù)試驗所需。

圖3 蛋白質(zhì)吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Protein absorbance standard curve

2.3 TNNI1、TNNI3蛋白表達(dá)

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測TNNI1、TNNI3蛋白表達(dá)結(jié)果顯示(圖5，6)，TNNI1、TNNI3蛋白在各年齡段麥洼牦牛心肌組織中的表達(dá)量均隨年齡增大而降低；TNNI1、TNNI3蛋白在犢牛心肌組織中的表達(dá)量顯著高于斷奶犢牛和成年牛(P<0.05)。

圖5 TNNI1蛋白印跡分析Fig.5 Western Blot analysis of TNNI1

圖6 TNNI3蛋白WB分析Fig.6 Western Blot analysis of TNNI3

2.4 麥洼牦牛不同肌肉組織組織學(xué)性狀

通過觀察各年齡段麥洼牦牛不同肌肉組織HE染色切片發(fā)現(xiàn)，牦牛臀肌纖維呈長圓柱形，細(xì)胞核橢圓形，且肌纖維直徑隨年齡增長逐漸增粗，而肌纖維密度隨年齡增長的趨勢與其相反。由圖7和表2可知，就肌纖維直徑和密度而言，成年牛與犢牛、斷奶犢牛差異顯著(P<0.05)，而犢牛與斷奶犢牛差異不顯著 (P>0.05)。

A.犢牛；B.斷奶犢牛；C.成年牛。圖8—11同。A.Calf；B.Weaned calf；C.Adult yak.The same as Fig.8—11.

由圖8可知，不同年齡段麥洼牦牛心肌纖維組織學(xué)形態(tài)存在差異。犢牛心肌細(xì)胞多且排列緊密，肌纖維彼此緊密連接間隙小(圖8-A)，斷奶犢牛較犢牛心肌纖維間隔增大 (圖8-B)，成年牦牛肌纖維間隔較斷奶犢牛期增大，肌纖維直徑增大(圖8-C)。

2.5 TNNI1表達(dá)與臀肌纖維性狀的相關(guān)性

由表3可知，TNNI1mRNA表達(dá)量與肌纖維直徑呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與肌纖維密度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖8 不同年齡麥洼牦牛心肌纖維切片F(xiàn)ig.8 Myocardial muscle fibers slices of Maiwa yak at different ages

表2 各年齡段麥洼牦牛臀肌纖維組織學(xué)性狀測定Tab.2 Gluteal muscle fiber traits comparison of Maiwa yak at different ages

表3 TNNI1 mRNA表達(dá)量與肌纖維性狀的相關(guān)性Tab.3 Correlations between TNNI1 mRNA expression and muscle fiber traits

2.6 TNNI1、TNNI3在牦牛臀肌纖維中的蛋白定位

如圖9免疫組化分析所示，TNNI1在不同年齡段麥洼牦牛臀肌纖維中均表達(dá)，蛋白表達(dá)水平趨勢為：成年牛>犢牛>斷奶犢牛(圖9-A—C)；數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，TNNI1在成年牛中的表達(dá)量顯著高于犢牛(P<0.05)，犢牛顯著高于斷奶犢牛(P<0.05)(圖9-D)。

圖9 不同年齡麥洼牦牛臀肌組織TNNI1蛋白表達(dá)特征(10×10)Fig.9 Protein expression characteristics of TNNI1 in gluteal muscle(10×10)

通過TNNI1、TNNI3表達(dá)定位發(fā)現(xiàn)(圖10，11)，TNNI1在不同年齡段牦牛心肌組織中的表達(dá)水平為：成年牛>犢牛>斷奶犢牛，且成年牛與犢牛、斷奶犢牛差異顯著(P<0.05)；TNNI3蛋白表達(dá)趨勢為：犢牛>斷奶犢牛>成年牛，三者之間均差異均顯著(P<0.05)，同時TNNI3蛋白表達(dá)水平隨年齡的增長呈逐漸降低的趨勢。

圖10 不同年齡麥洼牦牛心肌組織TNNI1蛋白表達(dá)特征(10×10)Fig.10 Protein expression characteristics of TNNI1 in myocardial(10×10)

圖11 不同年齡麥洼牦牛心肌組織TNNI3蛋白表達(dá)特征(10×10)Fig.11 Protein expression characteristics of TNNI3 in myocardial(10×10)

3 結(jié)論與討論

3.1 TNNI1、TNNI3在牦牛各年齡段的mRNA表達(dá)變化

Xu等[16]報道，TNNI1在梅山豬股二頭肌中的表達(dá)量在胚胎期60 d最高，后逐漸降低，在出生后60 d降至最低，此后隨發(fā)育緩慢上升。姬改革等[17]研究顯示，TNNI1在高郵鴨骨骼肌胚胎期表達(dá)量較高，隨后顯著下調(diào)，5日齡表達(dá)量逐漸上調(diào)。Zheng等[18]檢測發(fā)現(xiàn)，蛋雞骨骼肌中TNNI1的表達(dá)量在出雛后4周齡顯著高于2周齡。本研究結(jié)果顯示，TNNI1在成年牛臀肌組織中表達(dá)量最高，在斷奶犢牛中表達(dá)量最低，且與犢牛無顯著差異。TNNI1在骨骼肌中的表達(dá)無種屬特異性，但與物種發(fā)育所處的時期相關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，隨季節(jié)變化幼年期牦牛肌肉生長發(fā)育出現(xiàn)消長變化[20]，成年牦牛產(chǎn)乳量下降，不能全乳喂養(yǎng)，犢牛斷奶后肌肉生長發(fā)育出現(xiàn)短暫下降期，故斷奶犢牛臀肌組織TNNI1表達(dá)量出現(xiàn)降低現(xiàn)象。研究結(jié)果的差異，可能與研究物種及發(fā)育時期有關(guān)。

麥洼牦牛心肌組織TNNI1mRNA表達(dá)量隨年齡的增長而降低，TNNI3表達(dá)量則隨年齡的增長呈先升高后降低趨勢，這與TNNI3在天府肉羊心肌組織中表達(dá)量隨年齡增長逐漸下調(diào)的結(jié)果不同[4]。相關(guān)分析顯示，TNNI3在不同物種啟動基因表達(dá)所需的近側(cè)啟動子長度均不同[21]，其表達(dá)可能具有物種特異性。楊華[6]通過比較TNNI1、TNNI3在大白豬和梅山豬不同發(fā)育時期的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TNNI1表達(dá)水平在個體出生后逐漸降低，而TNNI3則逐漸上升，但TNNI3表達(dá)水平在其不同發(fā)育時期均占主導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，麥洼牦牛在犢牛期時以TNNI1表達(dá)為主，隨年齡增長TNNI3表達(dá)水平逐漸上調(diào)，直至成年期均以TNNI3表達(dá)為主。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期心臟以TNNI1表達(dá)為主，隨年齡增長TNNI1在心肌細(xì)胞的表達(dá)逐漸被TNNI3取代，轉(zhuǎn)錄因子GATA4在這一轉(zhuǎn)變過程發(fā)揮關(guān)鍵作用[22]。以上研究表明，TNNI1在不同物種的心肌組織表達(dá)趨勢一致，而TNNI3mRNA表達(dá)具有物種特異性，不同物種的表達(dá)趨勢均存在較大差異。

3.2 TNNI1 mRNA表達(dá)量與肌纖維性狀關(guān)系

肌纖維直徑和肌纖維密度等組織學(xué)特性與肉品質(zhì)關(guān)系密切，且直接影響肉質(zhì)嫩度[23]。肌纖維數(shù)量在個體出生后就固定不再變化，而肌纖維直徑隨個體發(fā)育逐漸變粗，肌纖維密度則逐漸降低。肌纖維越細(xì)，肉質(zhì)越嫩；肌纖維越粗，肉質(zhì)越差[24-25]，所以肌纖維直徑與密度也成為評估肉品質(zhì)的重要影響因素。毛國祥等[26]通過對我國3個地方鵝種肌纖維直徑及密度等肌肉理化參數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)肌纖維直徑及密度對不同鵝品種肉質(zhì)有影響。McMeekan[27]研究表明，通過肌纖維性狀可進(jìn)一步反映豬的生長過程；Carpenter[28]發(fā)現(xiàn)，隨大鼠的生長發(fā)育，肌纖維直徑與肌肉嫩度呈負(fù)相關(guān)。通過對大通牦牛和九龍牦牛肌纖維組織學(xué)性狀分析，發(fā)現(xiàn)牦牛品種、年齡、性別、取樣部位等對肌纖維直徑均有影響[29-30]。沈元新等[31]研究顯示，肌纖維直徑及肌纖維密度對金華豬肉質(zhì)有顯著影響。本研究結(jié)果顯示，麥洼牦牛犢牛臀肌纖維直徑最小，隨年齡增長，斷奶犢牛肌纖維直徑較犢牛增大，成年牛達(dá)到最大；而肌纖維密度與肌纖維直徑呈負(fù)相關(guān)，其變化趨勢與肌纖維直徑恰好相反，與以上其他物種相關(guān)研究結(jié)果一致。肌纖維直徑及肌纖維密度與牦牛年齡相關(guān)性較大，年齡越小，肌纖維直徑越小，肌纖維密度越大，肉質(zhì)越嫩。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNNI1在不同年齡麥洼牦牛臀肌組織的mRNA表達(dá)量與肌纖維直徑極顯著正相關(guān)，與肌纖維密度顯著負(fù)相關(guān)，這與吳婷婷[4]對不同年齡天府肉羊腹肌TNNI1研究結(jié)果相符，與姬改革等[17]發(fā)現(xiàn)鴨早期各類型肌纖維直徑與TNNI1表達(dá)量不相關(guān)的結(jié)果不同?？赡芘c不同物種以及肌肉發(fā)育不同時期TNNI1的作用機(jī)制不同有關(guān)[22]。目前，家牦牛仍采用半野生放牧方式，且牦牛善攀巖，臀肌尤為發(fā)達(dá)，肌纖維含量豐富，不同于其他圈養(yǎng)家畜品種。相關(guān)研究顯示，牦牛、羊等哺乳動物肌肉組織TNNI1表達(dá)量與肌纖維直徑顯著相關(guān)，而鴨、火雞等禽類TNNI1表達(dá)量與肌纖維直徑不相關(guān)，說明TNNI1在哺乳動物和禽類中的作用方式不同，推測TNNI1并不影響禽類的肌纖維直徑和密度，主要對肌纖維類型的轉(zhuǎn)化發(fā)揮作用；而TNNI1表達(dá)量與哺乳動物肌纖維組織學(xué)特性顯著相關(guān)，與肌纖維的生長發(fā)育密切相關(guān)。

3.3 TNNI1、TNNI3蛋白表達(dá)特點

孫艷[32]發(fā)現(xiàn)，ssTnI基因中包含2個TNNI1亞型結(jié)構(gòu)，且以上2個亞型無法在蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)。張陽[12]研究顯示，在小尾寒羊和杜泊羊的心肌組織中TNNI3蛋白均顯示2條大小不一的譜帶。本研究結(jié)果表明，麥洼牦牛心肌組織中TNNI1、TNNI3蛋白表達(dá)量均隨年齡的增長而逐漸下調(diào)，且TNNI1蛋白表達(dá)趨勢與mRNA表達(dá)趨勢一致，而TNNI3則存在差異，可能TNNI3mRNA的翻譯過程受到了一定影響[12]，其轉(zhuǎn)錄與翻譯的表現(xiàn)豐度發(fā)生變化。同時，在麥洼牦牛各年齡段心肌組織中TNNI1蛋白表達(dá)譜帶均存在大小不同的另一條帶，推測可能為TNNI1蛋白亞型，但在克隆過程并未發(fā)現(xiàn)其mRNA可變剪切體，也未檢測發(fā)現(xiàn)其基因亞型結(jié)構(gòu)。

本研究結(jié)果顯示，TNNI1蛋白在各年齡段麥洼牦牛臀肌組織中均有表達(dá)，其中在成年牛中表達(dá)量最高，犢牛次之，斷奶犢牛表達(dá)量最低。犢牛尚處于哺乳期，生長發(fā)育迅速，肌纖維各項理化指標(biāo)均處于上升趨勢；1.5～2.5歲牦牛生長發(fā)育接近成熟，但存在季節(jié)性消長現(xiàn)象[20]，故TNNI1蛋白在斷奶犢牛中的表達(dá)量表現(xiàn)為下調(diào)趨勢；而成年牛代謝水平穩(wěn)定，各生產(chǎn)性能均達(dá)到最高。研究表明，TNNI3基因突變會引起心肌疾病，并作為心肌梗死等突發(fā)心肌疾病的特異性診斷標(biāo)志基因廣泛用于臨床檢測。張璐璐[33]發(fā)現(xiàn)，TNNI3基因可調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖和凋亡。通過對關(guān)鍵代謝通路對心臟生長發(fā)育的代償性調(diào)控，為TNNI3基因突變對心肌疾病的致病機(jī)制提供了新的研究思路[34-35]。上述研究均表明，TNNI3基因在心肌生長發(fā)育及正常代謝過程發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究蛋白定位結(jié)果顯示，TNNI3在牦牛心肌組織中的表達(dá)量在隨牦牛年齡的增長而逐漸下調(diào)，與蛋白表達(dá)水平一致，推測TNNI3可抑制心肌細(xì)胞增殖，故TNNI3表達(dá)水平逐漸降低，與其正常生長發(fā)育過程相符。