李芙蓉，向發(fā)椿，曹麗萍，邵 勇，佘永新，鄭鷺飛，金茂俊，金 芬，王 靜，李崇瑛*，王珊珊,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610059）

食品安全問(wèn)題已成為全世界共同面臨的重大挑戰(zhàn)，其不僅會(huì)對(duì)人類健康造成巨大危害，還會(huì)嚴(yán)重制約進(jìn)出口貿(mào)易及工業(yè)發(fā)展[1-2]。因此，開(kāi)發(fā)高效的食品安全精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)保障食品安全至關(guān)重要。氣相色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等色譜方法是當(dāng)前食品安全監(jiān)測(cè)中最常用的檢測(cè)技術(shù)[2-4]。雖然其具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但也存在設(shè)備較為昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)、操作相對(duì)復(fù)雜、對(duì)技術(shù)人員專業(yè)要求高等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足食品生產(chǎn)、加工、流通和銷售全鏈條實(shí)時(shí)有效監(jiān)控的需求[1]。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。

天然酶具有催化活性高、底物特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，作為核心識(shí)別材料或標(biāo)記物在酶抑制法和免疫分析法等常用快速檢測(cè)技術(shù)中發(fā)揮著重要作用。但受其本身的局限性，諸如難以制備和提純、成本高、穩(wěn)定性差、貯存條件苛刻等的影響，限制了其應(yīng)用和推廣[5]。鑒于此，部分環(huán)糊精、金屬?gòu)?fù)合物、聚合物、超分子化合物、納米酶等人工模擬酶相繼被開(kāi)發(fā)出來(lái)。納米酶是一類具有類酶催化活性的納米材料[1]。自2007年研究人員發(fā)現(xiàn)磁性Fe3O4納米材料本身具有類似辣根過(guò)氧化物酶（peroxidase horseradish，HRP）的催化活性[6]，可催化H2O2氧化四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）和鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）等顯色底物顯色后，納米酶?jìng)涫懿毮?，已成為分析傳感、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7-8]。金屬（單金屬及合金）納米材料[8]、碳納米管[9]、石墨烯及其衍生物[10]、鈰氧化物[11]、釩氧化物[12]、鈷氧化物[13]等一系列納米材料被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性。與天然酶相比，納米酶除具有穩(wěn)定性高、成本低、可批量生產(chǎn)、貯存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)外，其表面易修飾和功能可裁剪的特性為實(shí)現(xiàn)不同場(chǎng)景的應(yīng)用提供了可能[14]。

近年來(lái)，隨著納米科學(xué)、傳感技術(shù)、理論計(jì)算等領(lǐng)域的發(fā)展，納米酶在食品安全領(lǐng)域取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，展現(xiàn)出極具潛力的應(yīng)用前景[1,15-16]。本文結(jié)合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究成果，詳述貴金屬、金屬氧化物、碳材料、金屬有機(jī)框架材料等常見(jiàn)納米酶材料的模擬酶特性及其催化機(jī)理，納米酶?jìng)鞲衅鞯脑砑捌湓谵r(nóng)藥、獸藥、無(wú)機(jī)離子、真菌毒素、食源性病原體、違禁添加物、酚類化合物等食品污染物快速檢測(cè)領(lǐng)域中最新應(yīng)用進(jìn)展，最后在此基礎(chǔ)上，展望了納米酶應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，以期為新型納米模擬酶?jìng)鞲衅鞯脑O(shè)計(jì)、性能提升及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 納米酶類型及催化機(jī)理

納米酶是一類具有類酶活性的納米材料。由于其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，已成為最具前景的天然酶替代材料之一，在分析傳感、疾病診斷和治療、環(huán)境保護(hù)、抗菌等方面展示出巨大的應(yīng)用前景[7-8,15-16]。依據(jù)催化活性，可將納米酶分為類過(guò)氧化物酶、類過(guò)氧化氫酶、類超氧化物歧化酶、類氧化酶和類水解酶等[7]。納米酶催化活性主要取決于表面電子轉(zhuǎn)移過(guò)程。為設(shè)計(jì)新型納米酶材料、提高其催化活性、拓寬其應(yīng)用范圍，近年來(lái)，研究者利用電子自旋共振技術(shù)（electron spin resonance，ESR）、密度泛函理論（density functional theory，DFT）計(jì)算、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）、酶穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)表征等多種技術(shù)對(duì)納米酶的催化機(jī)理開(kāi)展了理論研究。目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)金屬、金屬氧化物/硫化物、碳納米材料、金屬有機(jī)框架材料等納米材料具有模擬酶活性，并對(duì)其催化活性和催化機(jī)理進(jìn)行了分析探索。

1.1 貴金屬納米酶

常見(jiàn)的貴金屬納米酶主要包括金（Au）、銀（Ag）、鉑（Pt）、鈀（Pd）等及其所形成的合金材料。這些納米酶大多具有類氧化酶、類過(guò)氧化物酶、類過(guò)氧化氫酶、類超氧化物歧化酶以及類水解酶等多種催化活性，其中以其作為過(guò)氧化物酶和氧化酶在分析傳感領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛。貴金屬納米酶的催化活性緣于其表面對(duì)底物的吸附、活化和電子轉(zhuǎn)移，受材料尺寸、形貌、表面修飾物、pH值等因素影響。Shen Xiaomei等[8]通過(guò)DFT計(jì)算和輔助實(shí)驗(yàn)對(duì)貴金屬Au、Ag、Pt、Pd及其合金的類氧化酶和類超氧化物歧化酶活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，貴金屬可通過(guò)催化氧氣分子分解為氧原子進(jìn)而吸附TMB、抗壞血酸等有機(jī)底物中的氫原子，從而實(shí)現(xiàn)氧氣對(duì)底物的氧化（方程（1）、（2）），且其活性取決于金屬組成和晶面暴露程度，催化活性從高到低依次為Pd（111）＞Pt（111）＞＞Au（111）、Ag（111）。當(dāng)作為超氧化歧化酶時(shí)，其催化機(jī)理如方程（3）～（4）所示，O2-·可與水反應(yīng)生成HO2·，而HO2·極易被吸附在重金屬表面重排生成H2O2和O2（圖1）。

圖1 HO2·在Au（111）（A）和Pt（111）（B）晶面上重排機(jī)理[8]Fig.1 Rearrangements of two HO2· groups on (111) facets of Au (A)and Pt (B)[8]

此外，研究者也對(duì)貴金屬的類過(guò)氧化物酶活性和類過(guò)氧化氫酶活性也進(jìn)行了探討。相關(guān)研究表明貴金屬對(duì)過(guò)氧化氫的催化機(jī)理主要受pH值影響，在低pH值條件下H2O2在金屬表面發(fā)生堿性分解，貴金屬（Au、Ag、Pd和Pt）表現(xiàn)出類過(guò)氧化物酶活性，而在高pH值條件下，H2O2在金屬表面發(fā)生酸性分解，表現(xiàn)出類過(guò)氧化氫酶活性[17]。

1.2 金屬氧化物

金屬氧化物基納米酶主要指過(guò)渡金屬氧化物，包括鐵氧化物、鈰氧化物、錳氧化物、銅氧化物、鈷氧化物、釩氧化物等。與貴金屬基納米酶不同，金屬元素價(jià)態(tài)的改變對(duì)其催化活性起著決定作用。

鐵氧化物納米酶包括Fe3O4、Fe2O3、MFe2O4（M為鈷（Co）、錳（Mn）、鋅（Zn））等，可模擬過(guò)氧化物酶、氧化酶和過(guò)氧化氫酶等天然酶的催化活性。其中，F(xiàn)e3O4納米粒子自被發(fā)現(xiàn)可催化H2O2-TMB顯色反應(yīng)以來(lái)，由其生物相容性好、易于修飾且具有獨(dú)特的磁學(xué)特性，在H2O2、葡萄糖、有機(jī)污染物等傳感分析檢測(cè)方面取得了廣泛的應(yīng)用[18]。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)和催化實(shí)驗(yàn)表明，其催化H2O2-TMB反應(yīng)的機(jī)理為乒乓機(jī)理，與HRP相比，其對(duì)H2O2親和力減弱，對(duì)TMB親和力增強(qiáng)，溫度和酸堿耐受性更強(qiáng)[6]。分子機(jī)理研究表明，F(xiàn)e2+和Fe3+之間的轉(zhuǎn)化是其呈現(xiàn)高過(guò)氧化物酶活性的關(guān)鍵。其催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線也基本符合米氏動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

鈰氧化物納米粒子由于同時(shí)存成Ce3+和Ce4+兩種價(jià)態(tài)，且具有氧空位結(jié)構(gòu)，因而具備了多種酶活性，比如過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、氧化酶和超氧化物歧化酶[11]。氧化鈰中Ce3+/Ce4+比例以及溶液pH值對(duì)其類酶活性具有重要影響。Asati等[19]發(fā)現(xiàn)氧化鈰可在無(wú)外加氧化劑的情況下使有機(jī)底物顯色，證明其具有氧化酶活性，并將其作為HRP酶的替代物用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中。研究結(jié)果表明，酸性條件和減小粒徑尺寸有利于提高其氧化酶活性。Heckert等[20]的研究表明Ce3+/Ce4+也能發(fā)生類芬頓反應(yīng)，催化H2O2產(chǎn)生羥自由基，其催化機(jī)理如方程（5）～（7）。隨后，Jiao Xue等[21]證明了氧化鈰納米粒子具有類過(guò)氧化物酶活性，并采用比色法實(shí)現(xiàn)了葡萄糖的快速測(cè)定。Pirmohamed等[22]研究發(fā)現(xiàn)氧化鈰還具有類過(guò)氧化氫酶活性和類超氧化物歧化酶活性，并通過(guò)EPR分析證明當(dāng)氧化鈰納米粒子Ce3+/Ce4+比例相對(duì)較低時(shí)，類過(guò)氧化氫酶活性占主導(dǎo)地位，反之，類超氧化物歧化酶活性占主導(dǎo)地位。當(dāng)其作為超氧化物歧化酶時(shí)，催化機(jī)理如方程（8）～（9）所示；當(dāng)其作為過(guò)氧化氫酶時(shí)，通過(guò)兩個(gè)半反應(yīng)催化H2O2，一個(gè)H2O2分子與Ce4+通過(guò)氧化還原反應(yīng)生成質(zhì)子、氧氣和Ce3+；另一個(gè)H2O2分子結(jié)合在氧空位上，將Ce3+氧化為Ce4+并釋放出H2O分子[23]。

除鐵氧化物和鈰氧化物外，研究者也開(kāi)發(fā)了GeO2、V2O5以及Co3O4等金屬氧化物納米酶。Liang Xin等[15]采用水熱法合成了只具有類過(guò)氧化物酶活性而不具備氧化酶活性GeO2納米酶。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)和·OH熒光測(cè)試結(jié)果表明，與HRP和Fe3O4等不同，其催化H2O2氧化TMB過(guò)程中，不產(chǎn)生·OH和O2-·等自由基，而是生成GeO2-H2O2-TMB三元復(fù)合物中間體。V2O5納米顆粒具有類鹵素過(guò)氧化物酶、類谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和類氧化酶活性，可在H2O2存在下催化鹵離子生成次鹵酸、催化谷胱甘肽生成氧化型谷胱甘肽，也可在不加H2O2條件下催化TMB顯色，用于谷胱甘肽的比色法測(cè)定[12]。Mu Jianshuai等[24]發(fā)現(xiàn)Co3O4納米粒子具有類過(guò)氧化物酶和類過(guò)氧化氫酶活性。穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)底物TMB的親和力高于HRP，對(duì)底物H2O2的親和力低于HRP，其類過(guò)氧化物酶活性緣于Co3O4納米酶加速TMB與H2O2間轉(zhuǎn)移電子，而不是因?yàn)榱u自由基的生成。Qin Wenjie等[13]發(fā)現(xiàn)Co3O4具有氧化酶活性，研究表明，Co3O4的類氧化酶催化活性并非源自·OH或O2-·自由基的產(chǎn)生，而是來(lái)源于Co3O4納米酶加速TMB和吸附在其表面的氧氣間的電子轉(zhuǎn)移。

1.3 碳基納米材料的催化機(jī)理

碳基納米材料主要包括富勒烯、石墨烯、碳納米管及它們的衍生物等，因其獨(dú)特的物理化學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)引起了科學(xué)家們對(duì)其作為模擬酶的研究興趣。目前碳基納米材料已被證實(shí)具有類過(guò)氧化物酶、類超氧化物歧化酶和類水解酶活性[25]，其中以其作為過(guò)氧化物酶模擬酶的機(jī)理研究和應(yīng)用最為廣泛。

Li Ruimin等[10]發(fā)現(xiàn)富勒烯的衍生物C60[C(COOH)2]2具有類過(guò)氧化物模擬酶活性。研究表明，C60[C(COOH)2]2類過(guò)氧化酶活性主要與C60獨(dú)特的電子共軛結(jié)構(gòu)有關(guān)，TMB通過(guò)π-π相互作用吸附在碳籠表面，其分子內(nèi)氨基的孤對(duì)電子轉(zhuǎn)移至碳籠，使碳籠的電子密度和遷移率得以提高，進(jìn)而加速了碳籠到H2O2的電子轉(zhuǎn)移。Sun Hanjun等[26]通過(guò)對(duì)其表面—C＝O、—O＝CO—、—C—OH等不同官能團(tuán)進(jìn)行消除，結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論計(jì)算對(duì)GODs的類過(guò)氧化物酶催化機(jī)理進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，—C＝O和—O＝CO—分別作為催化活性位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)石墨烯量子點(diǎn)（graphene quantum dots，GODs）納米酶活性具有促進(jìn)作用，而—C—OH的存在會(huì)抑制GODs的催化活性。Zhao Ruisheng等[9]利用DFT進(jìn)一步從分子層面揭示了納米碳氧化物的類過(guò)氧化物酶催化機(jī)理。結(jié)果表明，共軛大π鍵的存在對(duì)其類過(guò)氧化物酶活性至關(guān)重要，—COOH可輔助H2O2產(chǎn)生·OH進(jìn)而氧化TMB。此外，單壁碳納米管、螺旋狀碳納米管、光致發(fā)光氮化碳點(diǎn)、多色發(fā)光碳納米顆粒和碳量子點(diǎn)也都被證明具有過(guò)氧化物酶的活性[10]。

為進(jìn)一步提高碳基納米酶的催化活性、賦予材料新的性能，研究者們采用摻雜技術(shù)和雜化技術(shù)，開(kāi)發(fā)了Co、Cu、Fe等金屬或非金屬摻雜碳基納米材料以及血紅素/石墨烯、納米金/石墨烯、普魯士藍(lán)/碳納米管等納米雜化材料，拓展了碳基納米材料作為納米酶在生物傳感等方面的應(yīng)用。例如，Mu Jianshuai等[27]制備了Co摻雜的類石墨相碳化氮（Co-g-C3N4），并發(fā)現(xiàn)Co摻雜有利于TMB-g-C3N4-H2O2間的電子轉(zhuǎn)移，可顯著提升g-C3N4的類過(guò)氧化物酶活性。Qiu Na等[28]設(shè)計(jì)合成了三維石墨烯磁性納米材料（three-dimensional graphene/mesoporous Fe3O4，3D GF/M-Fe3O4），并發(fā)現(xiàn)由于3D GF和M-Fe3O4的協(xié)同作用，復(fù)合材料類過(guò)氧化酶活性遠(yuǎn)高于3D GF和M-Fe3O4。

1.4 金屬有機(jī)框架材料的催化機(jī)理

金屬有機(jī)框架化合物（metal organic frameworks，MOFs）是由無(wú)機(jī)金屬離子和有機(jī)配體通過(guò)配位鍵自組裝得到的具有特定孔徑結(jié)構(gòu)的多孔納米材料。由于其具有比表面積大、易于修飾、孔道多樣、功能可調(diào)、富含不飽和金屬中心等特點(diǎn)，已成為納米酶領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Fe、Co、Cu是常用的構(gòu)建MOFs基納米酶的金屬中心。據(jù)報(bào)道，MIL-53(Fe)、MIL-68、MIL-100、MIL-101、Fe-MIL-88NH2等MIL系列MOFs、Cu-MOFs、Co-MOFs以及Co/2Fe-MOFs均具有類過(guò)氧化物酶活性[14]，其催化機(jī)理為芬頓/類芬頓反應(yīng)，催化H2O2生成·OH。此外，Ce-MOFs可作為氧化酶的模擬酶[29]。與CeO2相比，Ce-MOFs具有更高的類氧化酶活性，這可能是其具有較大的比表面積且與TMB間有較強(qiáng)的π-π相互作用引起的。除MOFs自身具有模擬酶活性外，還可通過(guò)對(duì)MOFs進(jìn)行化學(xué)修飾或者制備MOFs復(fù)合物提高催化性能。Chen Weihai等[30]首先以2,2-二吡啶-5,5-二羧酸為有機(jī)配體，以Zr4+為金屬中心制備了UiO（University of Oslo）型MOFs，再通過(guò)Cu2+與聯(lián)吡啶配位獲得了Cu2+后修飾的MOFs基納米酶Cu2+-NMOFs。研究表明，與Cu2+單獨(dú)使用或Cu2+與聯(lián)吡啶混合使用相比，Cu2+-NMOFs對(duì)H2O2-多巴胺的催化效率顯著提高，說(shuō)明Cu2+-NMOFs的催化活性緣于Cu2+-雙吡啶復(fù)合物和MOFs的協(xié)同作用。此外，Cu2+-NMOFs還可催化H2O2-Amplex紅、H2O2-魯米諾、H2O2-NADH等反應(yīng)體系，有利于實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)的多模式檢測(cè)。He Li等[31]采用原位合成法制備了AuNPs/MOFs納米復(fù)合物，結(jié)果表明，該法制備的AuNPs/MOFs對(duì)H2O2-TMB的催化效率遠(yuǎn)高于物理混合物制備的AuNPs/MOFs以及AuNPs或MOFs單獨(dú)使用，推測(cè)其較高的催化活性是AuNPs和MOFs的協(xié)同作用加速了自由基·OH、O2-·、O2的生成導(dǎo)致的。

除MOFs外，MOFs衍生物也被發(fā)現(xiàn)具有類酶活性[32]。例如，Li Siqi等[33]以ZIF-67為前驅(qū)體，通過(guò)熱解一步制備了具有氧化酶活性的Co、N共摻雜的多孔碳納米雜化物（Co,N co-doped hierarchically porous carbon，Co,NHPC），可有效催化O2氧化TMB、1,2-二氨基苯和2,2’-疊氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽等顯色劑顯色。活性氧測(cè)試結(jié)果表明，在催化反應(yīng)中主要生成了O2和O2·自由基。Co,N-HPC的高比表面積和多孔結(jié)構(gòu)使溶解氧得以快速擴(kuò)散到催化活性位點(diǎn)。

2 納米酶在食品檢測(cè)中的應(yīng)用

納米酶由于具有活性可調(diào)、功能可控、易于修飾、成本低、易于批量生產(chǎn)、環(huán)境耐受性好、穩(wěn)定性高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)，作為天然酶的新興替代物，在食品安全領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。研究者利用污染物與納米酶的相互作用、污染物對(duì)納米酶催化體系的調(diào)控作用、或?qū)⒓{米酶作為標(biāo)記物，開(kāi)發(fā)出大量基于納米酶的高性能光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)量型傳感器，用于食品中農(nóng)藥、獸藥、真菌毒素、病原體、重金屬、違禁添加物等污染物的檢測(cè)（表1）。

表1 納米酶在食品檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Applications of nanozymes in food safety detection

續(xù)表1

2.1 農(nóng)藥殘留檢測(cè)

農(nóng)藥在防治農(nóng)作物病蟲害、提高農(nóng)作物品質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的投入品。然而隨著農(nóng)藥的廣泛使用，尤其是其過(guò)量和不合理使用，所造成的農(nóng)產(chǎn)品、水、土壤和空氣中農(nóng)藥殘留污染問(wèn)題日益突出。由于大多數(shù)農(nóng)藥難以降解，且具有一定的毒性，殘留在食品和環(huán)境中的農(nóng)藥通過(guò)食物鏈、呼吸和皮膚接觸進(jìn)入人體后，會(huì)導(dǎo)致慢/極性中毒，對(duì)人體造成較大危害。為實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)，研究者們開(kāi)發(fā)出一系列基于納米酶的農(nóng)藥殘留快速分析方法并取得了較好的應(yīng)用效果。

Fe3O4納米酶首先被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析。Guan Guijian等[34]將Fe3O4作為過(guò)氧化物酶模擬酶催化魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在乙醇存在的情況下，超氧陰離子被清除，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)被顯著抑制，進(jìn)而通過(guò)滅線磷和乙醇與Fe3O4納米粒子的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，建立了turn-on模式的有機(jī)磷化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法。隨后，研究者們報(bào)道了基于CeO2

[35]、GeO2[15]、NiO[36]等金屬氧化物納米酶的農(nóng)藥殘留速測(cè)方法。Wei Jinchao等[35]研究發(fā)現(xiàn)CeO2具有類磷酸水解酶活性，可催化甲基對(duì)氧磷水解生成黃色的對(duì)硝基苯酚，進(jìn)而以熒光碳點(diǎn)為探針，通過(guò)對(duì)硝基苯酚對(duì)碳點(diǎn)熒光的猝滅作用，實(shí)現(xiàn)了花旗參和飲用水中甲基對(duì)氧磷的熒光速測(cè)，檢出限為3.75×10-2nmol/L。Liang Xin等[15]合成了具有類過(guò)氧化物酶活性的GeO2納米顆粒，可在H2O2存在下催化TMB顯色，進(jìn)一步將其與酶抑制法聯(lián)用，構(gòu)建了GeO2-乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）反應(yīng)體系用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)。其檢測(cè)機(jī)理為乙酰硫代膽堿在AChE作用下水解生成可降解GeO2的硫代膽堿，抑制顯色反應(yīng)發(fā)生；而當(dāng)體系中存在對(duì)氧磷時(shí)，AChE活性被抑制，顯色反應(yīng)得以進(jìn)行。結(jié)果表明，所制備的GeO2納米酶在pH 4～7條件下均具有較高催化活性，熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性均優(yōu)于HRP，此外，與Fe3O4、NiFe2O4、Co3O4、CuO等類過(guò)氧化物酶相比，具有更高的催化速率（vm＝23.4×10-8mol/（L·s））和底物親和力，且極易被硫代膽堿降解；同時(shí)，由于其只具備過(guò)氧化物酶活性、不具備氧化酶活性，且為白色，顯著消除了納米粒子自身顏色和內(nèi)在氧化活性對(duì)比色檢測(cè)的干擾，因此大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。該法線性范圍為1×10-13～5×10-11mol/L，檢測(cè)限為1.4×10-5nmol/L，為實(shí)現(xiàn)水和果汁中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的精準(zhǔn)測(cè)定提供了新途徑。Khairy等[36]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單靈敏的基于NiO納米酶修飾的絲網(wǎng)印刷電極。由于NiO對(duì)對(duì)硫磷具有較強(qiáng)的吸附作用，該電化學(xué)傳感器檢測(cè)限為24 nmol/L，靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)水、尿液和蔬菜等多種樣品中有機(jī)磷殘留量的快速測(cè)定。

除金屬氧化物外，貴金屬、碳納米材料也作為模擬酶廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的快速測(cè)定。Singh等[37]利用馬拉硫磷對(duì)Pd-Au納米棒類過(guò)氧化物酶活性的抑制作用，以鄰苯二胺為顯色底物，基于Pd-Au納米棒催化H2O2氧化鄰苯二胺顯色，提出了一種簡(jiǎn)單、靈敏、無(wú)標(biāo)記的馬拉硫磷比色測(cè)定法，檢出限為1.8×102nmol/L，低于我國(guó)GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定飲用水中馬拉硫磷的限量值（0.05 mg/L）。研究結(jié)果表明，所制備的Pd-Au納米酶在酸性條件（pH 2.0～6.0）具有較高催化活性，在堿性條件下，活性較低，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Kcat均優(yōu)于HRP，且由于其對(duì)馬拉硫磷分子中R—S—R’基團(tuán)較強(qiáng)的親和力，使得馬拉硫磷對(duì)其催化位點(diǎn)具有較強(qiáng)的吸附抑制作用，從而使該法對(duì)巴拉松、毒死蜱等有機(jī)磷以及硫酸鋅等金屬鹽無(wú)交叉反應(yīng)，具有超高的選擇性。為進(jìn)一步提高特異性，Weerathunge等[38]以核酸適配體為識(shí)別元件，利用銀納米粒子的類過(guò)氧化物酶活性，對(duì)毒死蜱進(jìn)行了比色法測(cè)定。該法檢測(cè)原理為當(dāng)核酸適配體吸附在Ag表面時(shí)，可有效抑制Ag納米酶活性，從而減弱H2O2-TMB顯色反應(yīng)程度；當(dāng)體系中加入毒死蜱，適配體從納米酶表面解離，納米酶活性得以恢復(fù)，顯色反應(yīng)增強(qiáng)。結(jié)果表明，與敵敵畏等其他有機(jī)磷及噻蟲嗪等非有機(jī)磷農(nóng)藥相比，該法對(duì)毒死蜱具有較好的特異性和選擇性，檢出限為3.2×104nmol/L，低于GB 5749—2006規(guī)定飲用水中毒死蜱的限量值（0.03 mg/L），可滿足檢測(cè)需求。本課題組以分子印跡聚合物為識(shí)別材料，以半抗原修飾的PtNPs為三唑磷競(jìng)爭(zhēng)物，利用PtNPs的類過(guò)氧化物酶活性催化H2O2氧化TMB生成具有較強(qiáng)拉曼信號(hào)的藍(lán)色氧化產(chǎn)物TMB2+，實(shí)現(xiàn)了水和梨中三唑磷的比色法和表面拉曼增強(qiáng)光譜法雙模式測(cè)定，檢出限為3.2 nmol/L[7]，低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)（EU）2017/626《歐盟農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫(kù)-農(nóng)藥殘留和最大殘留水平》規(guī)定的梨中三唑磷的最大殘留限量（0.01 mg/kg）。Zhu Yunyao等[16]制備了具有類過(guò)氧化物酶活性的氮摻雜石墨烯、氮/硫摻雜石墨烯和石墨烯氧化物3 種納米酶材料，并用其構(gòu)建了檢測(cè)芳香族農(nóng)藥的比色納米酶?jìng)鞲衅麝嚵校▓D2）。3 種雜原子摻雜的石墨烯納米酶可催化H2O2氧化TMB，發(fā)生明顯的顯色反應(yīng)；當(dāng)芳香族農(nóng)藥被石墨烯吸附時(shí)，納米酶的活性位點(diǎn)被掩蓋，導(dǎo)致其類過(guò)氧化物酶活性降低，顯色程度減弱。由于不同的芳香族農(nóng)藥對(duì)3 種納米酶的抑制作用不同，所制備的納米酶?jìng)鞲衅麝嚵锌沙晒Ψ直娉?×103～5×105nmol/L的5 種農(nóng)藥，并區(qū)分每種農(nóng)藥的不同濃度以及兩種混合農(nóng)藥的不同比例。該研究提供了一種交叉響應(yīng)且成本經(jīng)濟(jì)的速測(cè)方法，為農(nóng)藥的殘留測(cè)定提供了新思路。

圖2 基于雜原子摻雜的石墨烯納米酶農(nóng)藥陣列檢測(cè)示意圖[16]Fig.2 Schematic diagram of nanozyme sensor arrays based on heteroatom-doped graphene for detecting pesticides[16]

納米酶的活性對(duì)檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度具有重要影響，設(shè)計(jì)合成雜化材料是提高納米酶活性的有效手段。Chang Yachu等[39]合成了CuO/MWCNTs納米雜化材料。結(jié)果表明，CuO/MWCNTs比MWCNTs具有更高的類過(guò)氧化物酶催化活性，可通過(guò)加速電子轉(zhuǎn)移過(guò)程有效催化H2O2氧化熒光紅燃料，進(jìn)而通過(guò)草甘膦對(duì)其活性的吸附抑制作用，構(gòu)建了水中草甘膦的熒光速測(cè)方法。該法不僅靈敏度高（檢出限為4.0 nmol/L，低于GB 5749—2006規(guī)定的飲用水中草甘膦的限量值0.7 mg/L），且對(duì)草甘磷具有良好的選擇性，在快速篩查草甘磷方面具有較好的應(yīng)用前景。Bagheri等[40]開(kāi)發(fā)了一種具有類過(guò)氧化物酶活性的Fe3O4@ZIF-8納米酶，并結(jié)合AChE和膽堿氧化酶（choline oxidase，CHO），以對(duì)苯二甲酸為熒光底物，通過(guò)Fe3O4@ZIF-8對(duì)H2O2-對(duì)苯二甲酸的催化反應(yīng)和二嗪農(nóng)對(duì)AChE的抑制作用構(gòu)建了二嗪農(nóng)的熒光傳感器。研究表明，所制備的Fe3O4@ZIF-8較Fe3O4和ZIF-8具有更高的類過(guò)氧化物酶活性，且具有優(yōu)異的磁性和穩(wěn)定性，至少可重復(fù)回收利用10 次。該法線性范圍為0.5～500.0 nmol/L，檢測(cè)限為0.2 nmol/L，可實(shí)現(xiàn)水和果汁中有機(jī)磷農(nóng)藥的準(zhǔn)確快速測(cè)定。

2.2 金屬離子檢測(cè)

重金屬離子難以生物降解，且極易通過(guò)食物鏈大量蓄積在人體內(nèi)，對(duì)人體消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)造成不可逆的傷害，危害極大。因此，開(kāi)發(fā)靈敏、快速、簡(jiǎn)便的重金屬檢測(cè)方法，一直是食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

研究表明，金屬粒子可增強(qiáng)或抑制納米酶的催化活性。據(jù)此，Gao Zhuangqiang等[41]設(shè)計(jì)了一種具有類過(guò)氧化物酶活性的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）修飾的鉑納米立方顆粒（Pt@PVP），通過(guò)Ag+對(duì)其表面活性位點(diǎn)的吸附占據(jù)所導(dǎo)致的模擬酶活性減弱，H2O2-TMB顯色反應(yīng)程度降低，構(gòu)建了一種檢測(cè)水中Ag+的比色傳感器（圖3）。該傳感器線性范圍為10-5～10-7mol/L，與其他基于納米金的比色法相比，具有靈敏度高（檢測(cè)限為8×10-2nmol/L）、響應(yīng)速度快（6 min）等優(yōu)勢(shì)，且由于Ag+和Pt@PVP間面心立方晶格和PVP的協(xié)同相互作用，對(duì)Ag+顯示出較強(qiáng)的特異性，抗干擾能力強(qiáng)，可滿足我國(guó)對(duì)自來(lái)水中Ag的檢測(cè)需求（限量值為0.05 mg/L）。氨基酸對(duì)納米酶反應(yīng)催化體系具有一定調(diào)控作，基于納米酶-氨基酸-金屬離子三者相互作用，研究人員開(kāi)發(fā)了系列檢測(cè)方法。Zhang Wenchi等[42]采用組氨酸（His）對(duì)鈀納米粒子（Pd nanoparticles，PdNPs）的類過(guò)氧化物酶活性進(jìn)行調(diào)控。His修飾可改變PdNPs的粒徑大小、元素價(jià)態(tài)和表面性質(zhì)，與純PdNPs相比，His-Pd納米酶尺寸更小、Pd0（零價(jià)態(tài)Pd）含量更高、親水性更好，因而其對(duì)H2O2-TMB顯色反應(yīng)的催化能力得以顯著提高。而當(dāng)體系中存在Ag+時(shí)，Ag+與His間的強(qiáng)相互作用可將His改性劑從納米酶表面剝落，從而降低其催化活性。利用該原理在可在30～300 nmol/L的線性范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水中Ag+的準(zhǔn)確特異性測(cè)定，檢測(cè)限為4.7 nmol/L?；贖g2+和半胱氨酸（Cys）的相互作用，Mohammadpour等[43]以碳點(diǎn)（carbon dots，CDs）作為過(guò)氧化物酶模擬酶開(kāi)發(fā)了比色傳感器，Hg2+檢出限為23 nmol/L。半胱氨酸作為一種強(qiáng)大的抗自由基生物分子，當(dāng)其加入反應(yīng)體系后，能夠成功抑制陽(yáng)離子自由基的生成，阻止底物TMB的藍(lán)色氧化產(chǎn)物出現(xiàn)。而Hg2+對(duì)半胱氨酸具有較強(qiáng)的親和力，使得顯色產(chǎn)物藍(lán)色陽(yáng)離子正常生成，顯色程度隨Hg2+濃度增加而增強(qiáng)。聚集誘導(dǎo)發(fā)光增強(qiáng)效應(yīng)在傳感分析領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，因此，研究者們開(kāi)始探索聚集效應(yīng)對(duì)納米酶活性的影響。Liao Hong等[44]研究發(fā)現(xiàn)Pb2+可通過(guò)誘導(dǎo)谷胱甘肽修飾的AuNCs聚集從而極大地提高AuNPs的類過(guò)氧化物酶活性（對(duì)H2O2-TMB反應(yīng)的催化活性提高了近10 倍）。在此基礎(chǔ)上，建立了一種簡(jiǎn)便、可靠的比色法用于Pb2+檢測(cè)，線性范圍為2.0×103～2.5×105nmol/L，檢測(cè)限為2×103nmol/L，在環(huán)境和食品樣品中重金屬離子速測(cè)方面具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。Jiang Cuifeng等[45]證明了Hg2+對(duì)殼聚糖修飾的AuNPs類過(guò)氧化物酶活性具有聚集誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)，并據(jù)此建立了一種免標(biāo)記、簡(jiǎn)單、快速的Hg2+可視化檢測(cè)方法。

圖3 基于PVP修飾的Pt納米酶的Ag＋比色法檢測(cè)原理[41]Fig.3 Schematic illustration of the principle of the PVP-capped Pt nanozyme assay for colorimetric detection of Ag+[41]

K+、Fe2+等雖然是人體必需的金屬離子，但其攝入過(guò)量也會(huì)對(duì)人體健康造成較大威脅，因此，建立該類離子的速測(cè)方法對(duì)保障人體健康也具有重要意義。Chen Zhengbo等[46]研究表明在AuNPs表面修飾K+的核酸適配體可通過(guò)提高AuNPs負(fù)電荷密度增強(qiáng)AuNPs與帶正電的TMB的親和力，進(jìn)而提高電子轉(zhuǎn)移速度，增強(qiáng)AuNPs的類過(guò)氧化物酶活性；而當(dāng)目標(biāo)離子K+存在時(shí)，適配體與K+特異性結(jié)合并離開(kāi)AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs催化活性下降。Chen Zhengbo等利用該原理制備了一種簡(jiǎn)單靈敏的比色傳感器，用于K+測(cè)定，該法檢測(cè)限為6×10-2nmol/L，靈敏度比其他光學(xué)檢測(cè)方法提高了2～9 個(gè)數(shù)量級(jí)，且具有較好的選擇性。與目標(biāo)物抑制納米酶催化活性不同。有研究表明Fe2+可以顯著提高M(jìn)oS2納米片類過(guò)氧化物酶的活性[47-48]。研究者基于這種協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)分別構(gòu)建了免標(biāo)記的比色和熒光傳感器，用于測(cè)定水中Fe2+，檢出限分別為7 nmol/L和3.5 nmol/L。

2.3 獸藥殘留檢測(cè)

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，獸藥被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的預(yù)防、控制和治療以及動(dòng)物生理機(jī)能的調(diào)節(jié)。然而過(guò)量殘留在肉、蛋、奶等動(dòng)物源性食品中的獸藥及其代謝物將通過(guò)食物鏈累積，對(duì)人類健康造成威脅。因此，建立快速、有效、可靠的獸藥殘留檢測(cè)方法，對(duì)保障國(guó)民安全具有重大意義。近年來(lái)，研究人員已基于納米酶開(kāi)發(fā)出靈敏、經(jīng)濟(jì)、可靠、便捷的獸藥檢測(cè)方法，并成功用于牛奶[50,52-53]、蜂蜜[50-51]、雞蛋[50]等樣品的檢測(cè)。

抗生物分子可直接與納米酶發(fā)生相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)其催化活性，基于此，Wang Yilin等[49]構(gòu)建了基于Fe3O4NPs的比色傳感器，用于測(cè)定四環(huán)素類抗生素。四環(huán)素類抗生素分子對(duì)Fe3O4表面的Fe2+和Fe3+具有很強(qiáng)的親和力，所形成的Fe3O4-四環(huán)素復(fù)合物可通過(guò)芬頓反應(yīng)催化H2O2氧化TMB，且對(duì)H2O2-TMB的催化反應(yīng)效率優(yōu)于Fe3O4NPs。該方法對(duì)土霉素、四環(huán)霉素、強(qiáng)力霉素的檢出限分別為26、45、48 nmol/L。

獸藥殘留具有濃度低、殘留種類多樣以及所處于的樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多等特點(diǎn)。如將納米酶與特異性識(shí)別元件相結(jié)合，將有效提高檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，解決痕量獸藥難以精準(zhǔn)定量的問(wèn)題?？贵w可有效識(shí)別目標(biāo)物，提高檢測(cè)精準(zhǔn)度。Chang Honghong等[50]制備了殼聚糖修飾的AgI/TiO2納米粒子，該復(fù)合材料在pH 3下具有優(yōu)異的光催化活性。由于AgI和TiO2能級(jí)匹配，AgI/TiO2異質(zhì)結(jié)有利于光生電子和空穴的分離，光生空穴可促使TMB氧化，光生電子可通過(guò)還原O2生成超氧陰離子自由基從而氧化TMB，進(jìn)而將抗體偶聯(lián)在AgI/TiO2上，Chang Honghong等[50]通過(guò)磁珠標(biāo)記氯霉素和氯霉素對(duì)抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，開(kāi)發(fā)了氯霉素的光響應(yīng)比色法免疫分析法。結(jié)果表明，由于復(fù)合材料的光催化活性優(yōu)于AgI和TiO2自身，基于AgI/TiO2構(gòu)建的比色傳感器靈敏度優(yōu)于基于AgI和TiO2構(gòu)建的比色傳感器，此外，該傳感器僅需加入底物TMB，無(wú)需使用H2O2，靈敏度高（檢出限為3×10-2nmol/L）、特異性好、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，可成功應(yīng)用于牛奶、蜂蜜、雞蛋等多種復(fù)雜基質(zhì)；同時(shí)其提出的光響應(yīng)策略為納米酶在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新方向。核酸適配體不但與目標(biāo)分子具有高親和力和特異性結(jié)合作用，還可調(diào)控納米酶活性。將核酸適配體與納米酶結(jié)合，既能對(duì)目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)特異性捕獲，有效避免干擾，還有利于基于納米酶-適配體-目標(biāo)物三者相互作用發(fā)展新的傳感基元和檢測(cè)模式。Wang Chunshuai等[51]基于適配體對(duì)AuNPs類過(guò)氧化物酶活性的抑制作用和目標(biāo)物誘導(dǎo)適配體置換機(jī)理，實(shí)現(xiàn)了卡那霉素的超靈敏電化學(xué)檢測(cè)。AuNPs可催化H2O2與硫氨酸反應(yīng)生成氧化硫氨酸，適配體的修飾使AuNPs催化活性被抑制。當(dāng)體系中存在卡那霉素時(shí)，由于其與適配體高的親和力特異性識(shí)別作用形成卡那霉素-適配體復(fù)合物，使得適配體從AuNPs表面脫落，AuNPs類過(guò)氧化物酶活性得以恢復(fù)，觀測(cè)到明顯的電化學(xué)信號(hào)。該法線性范圍為0.1～60.0 nmol/L，檢測(cè)限為6×10-2nmol/L，靈敏度優(yōu)于GB/T 22995—2008《蜂蜜中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》限量（0.005 mg/kg），可成功應(yīng)用于蜂蜜中卡那霉素的檢測(cè)。Yan Jiao等[52]基于磺胺地索辛適配體對(duì)AuNPs類過(guò)氧化物酶活性的抑制作用，以TMB為顯色底物，采用比色法測(cè)定了牛奶樣品中的磺胺地索辛殘留量。該法線性檢測(cè)限為32 nmol/L，可在15 min內(nèi)完成。類似的，Zhao Jing等[53]以鏈霉素適配體為特異性識(shí)別元件，以2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）為顯色底物，建立了基于AuNPs類過(guò)氧化物酶活性的比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中鏈霉素的快速測(cè)定，檢出限為86 nmol/L，低于GB/T 22969—2008《奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定的牛奶中鏈霉素的最大殘留限量（0.02 mg/kg）。上述基于適配體-納米酶構(gòu)建的傳感檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)需依賴大型儀器，在動(dòng)物源性食品中痕量獸藥殘留日常檢測(cè)方面具有較大潛力。

2.4 真菌毒素檢測(cè)

真菌毒素是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是食品和飼料的主要污染物之一。由于真菌的廣泛存在，雖然可在農(nóng)作物生長(zhǎng)、采后貯藏及加工過(guò)程中加以控制減少真菌毒素污染，但不能完全將其消除。相關(guān)研究表明，即使是低劑量真菌毒素的攝入，也可能會(huì)造成肝臟、腎臟或神經(jīng)毒性甚至死亡。為保障人體健康，近年來(lái)，研究者們開(kāi)發(fā)了基于納米酶?jìng)鞲衅饔糜谡婢舅氐臋z測(cè)，與傳統(tǒng)分析方法相比，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、靈敏、快速、可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

比色法由于具有可視化、成本低、便捷等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，受到了人們廣泛關(guān)注。Lai Wenqiang等[54]采用酶串聯(lián)催化放大策略，構(gòu)建了一種靈敏度有效提高的新型黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）比色免疫傳感器。研究表明，二維結(jié)構(gòu)MnO2納米片的超高比表面積使得其對(duì)TMB的吸附能力較強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)TMB氧化具有優(yōu)異的類氧化酶催化活性，抗壞血酸可以溶解MnO2生成Mn2+，催化反應(yīng)終止，反應(yīng)體系顯色程度減弱，而抗壞血酸氧化酶的存在可有效減弱這一過(guò)程，顯色程度隨抗壞血酸氧化酶濃度增加而增強(qiáng)?；诖耍芯空呃每箟难嵫趸?AFB1標(biāo)記的納米金和磁珠偶聯(lián)AFB1-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式，結(jié)合MnO2-TMB顯色體系，成功測(cè)定了花生中AFB1的濃度，檢出限為2×10-2nmol/L，遠(yuǎn)低于GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)食品中AFB1的限量（0.005～0.020 mg/kg）。該法耦合天然酶-模擬酶催化反應(yīng)，具有靈敏度高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)基于納米酶?jìng)鞲衅鞯暮哿磕繕?biāo)物分析提供了新途徑。除抗體外，研究者也開(kāi)發(fā)基于適配體識(shí)別作用的納米酶?jìng)鞲衅饔糜谡婢舅氐臋z測(cè)。Huang Lunjie等[55]設(shè)計(jì)了具有類氧化酶活性的MnCo2O4納米酶，結(jié)果表明，MnCo2O4可作為氧化酶催化TMB顯色，且由于晶體表面Co3+/Co2+和Mn3+/Mn2+氧化還原催化循環(huán)的協(xié)同作用，MnCo2O4催化活性優(yōu)于Co3O4、Mn3O4、MnO2、CeO2、MnFe2O4等金屬氧化物。赭曲霉素A（ochratoxin A，OTA）適配體的加入使得MnCo2O4表面活性位點(diǎn)被屏蔽，抑制了MnCo2O4-TMB間的電子轉(zhuǎn)移效率，使顯色反應(yīng)程度減弱；加入OTA后，適配體與OTA形成復(fù)合物，從納米酶表面脫落，MnCo2O4活性恢復(fù)。依據(jù)該原理，Huang Lunjie等[55]構(gòu)建了玉米樣品中OTA的高靈敏、高選擇性比色檢測(cè)方法，檢測(cè)限0.19 nmol/L，赭曲霉素B、赭曲霉素C、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1均無(wú)干擾，因此該方法可用于食品中OTA的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)（OTA限量值0.005～0.010 mg/kg）。類似的，Sun Shumin等[56]利用玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）適配體對(duì)AuNPs-H2O2-TMB催化體系的抑制作用，實(shí)現(xiàn)了玉米和玉米油中ZEN的測(cè)定，該方法法檢出限為31 nmol/L。Tian Fengyu等[57]報(bào)道了堿性磷酸酶-MnO2類氧化酶串聯(lián)催化放大體系用于果汁中痕量OTA測(cè)定的方法，檢測(cè)限為6.9×10-2nmol/L。該法以適配體作為識(shí)別元素，實(shí)現(xiàn)了OTA的高效捕獲；通過(guò)生物素-鏈霉親和素反應(yīng)和寡核苷酸雜交策略，設(shè)計(jì)制備了親和素修飾磁珠-生物素標(biāo)記適配體-生物素標(biāo)記互補(bǔ)DNA-親和素標(biāo)記堿性磷酸酶復(fù)合物，既避免了復(fù)雜的共價(jià)偶聯(lián)過(guò)程，也有利于分離富集；以堿性磷酸酶-抗壞血酸-2-磷酸體系通過(guò)抗壞血酸磷酸酯水解產(chǎn)物抗壞血酸還原MnO2生成Mn2+調(diào)控MnO2-TMB反應(yīng)程度進(jìn)行信號(hào)多級(jí)放大，對(duì)構(gòu)建基于適配體的納米酶?jìng)鞲衅骶哂休^好的通用性。

除比色傳感器外，研究者們也探索了電化學(xué)、熒光等傳感檢測(cè)方法。Shu Jian等[58]設(shè)計(jì)合成了一種PtNPs/CoTPP/rGO納米復(fù)合材料，并以其作為HRP酶替代物標(biāo)記AFB1抗體，建立了高靈敏的競(jìng)爭(zhēng)型電化學(xué)免疫傳感器，成功用于花生樣品中AFB1的測(cè)定。該方法不但檢測(cè)限（1.6×10-2nmol/L，5 pg/mL）遠(yuǎn)低于GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定的花生中最大殘留限量（0.02 mg/ kg），準(zhǔn)確度和精密度也可媲美商業(yè)試劑盒，且具有更快速便捷的優(yōu)勢(shì)，在食品中AFB1的日常檢測(cè)中具有較廣的應(yīng)用前景。Bagheri等[59]報(bào)道了一種應(yīng)用分子印跡聚合物（molecular imprintedpolymer，MIP）提高納米酶?jìng)鞲衅黛`敏度和特異性的方法。其以展青霉素為模板分子、以具有類過(guò)氧化物酶活性的基于銀鋅納米顆粒的金屬有機(jī)框架（Ag nanoparticle/Zn-based MOF nanocomposite，AgNPs/Znbased MOF）為載體，通過(guò)溶膠-凝膠印跡技術(shù)制備AgNPs@ZnMOF@MIP納米復(fù)合材料，通過(guò)分子印跡薄層對(duì)展青霉素的特異性吸附以及展青霉素對(duì)AgNPs/Znbased MOF催化位點(diǎn)的屏蔽抑制作用，以對(duì)苯二甲酸為熒光催化底物，設(shè)計(jì)了一種靈敏可靠的展青霉素的熒光傳感器。該法檢測(cè)限為60 nmol/L、特異性好，可成功應(yīng)用于環(huán)境水和蘋果汁中展青霉素的測(cè)定。

2.5 食源性病原體檢測(cè)

食源性病原體是指引發(fā)食源性疾病的細(xì)菌、病毒、寄生蟲和部分真菌，主要包括大腸桿菌O157:H7、李斯特菌、綠膿桿菌、阪崎腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌和諾如病毒等，由其造成的食品污染已在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛的關(guān)注。酶聯(lián)免疫法是該類污染物檢測(cè)中最常用的方法之一。采用納米酶代替天然生物酶，可有效避免生物酶應(yīng)用面臨的缺陷，提高檢測(cè)靈敏度、穩(wěn)定性和效率并降低成本。

大腸桿菌O157:H7是一種嚴(yán)重危害人類健康的致病菌。Han Jiaojiao等[60]以Pd-PtNPs納米酶標(biāo)記抗體，基于雙抗夾心建立了大腸桿菌O157:H7的側(cè)向免疫層析法，用于牛奶中大腸桿菌O157:H7的測(cè)定。結(jié)果表明，制備的Pd-Pt納米酶具有優(yōu)異的類過(guò)氧化物酶活性，可有效催化H2O2-TMB顯色反應(yīng)，顯著提高了靈敏度，檢出限為9×102CFU/mL。采用同樣的雙抗夾心原理，Jiang Ta等[61]以Pt-AuNPs納米酶為抗體標(biāo)記物，通過(guò)其催化H2O2氧化TMB，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157:H7的免疫層析可視化測(cè)定，檢出限為102CFU/mL，遠(yuǎn)優(yōu)于膠體金試紙條和商業(yè)試紙條（105～107CFU/mL）。Wang Zonghan等[62]制備了甘露糖修飾的普魯士藍(lán)納米酶，以其作為H2O2-TMB顯色信號(hào)催化放大探針和大腸桿菌O157:H7特異性識(shí)別材料，通過(guò)形成抗體-大腸桿菌O157:H7-納米酶夾心結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了水、西瓜汁、牛奶和紫甘藍(lán)中大腸桿菌O157:H7的可視化分析，檢出限為102CFU/mL。上述檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需細(xì)菌培養(yǎng)、核酸提取等預(yù)處理，可實(shí)現(xiàn)病原體的快速現(xiàn)場(chǎng)篩查，對(duì)其他食源性病原體的檢測(cè)具有較好的通用性和借鑒意義。單核細(xì)胞增生李斯特菌是最常見(jiàn)、最致命的食源性病原體之一，可引起神經(jīng)和免疫系統(tǒng)感染。Zhang Lisha等[63]設(shè)計(jì)制備了一種具有類過(guò)氧化物酶活性的Fe3O4磁納米粒子團(tuán)簇（Fe3O4nanoparticle cluster，F(xiàn)e3O4NPC），并將其偶聯(lián)適配體，利用對(duì)李斯特菌識(shí)別位點(diǎn)與適配體不同的萬(wàn)古霉素，采用比色夾心法測(cè)定了牛奶樣品中李斯特菌的含量。研究結(jié)果表明，由于Fe3O4NPs間的群體協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)e3O4NPC對(duì)H2O2-TMB的催化活性遠(yuǎn)優(yōu)于Fe3O4NPs，以其作為信號(hào)放大探針，有效提高了靈敏度，檢出限為5.4×103CFU/mL，同時(shí)由于采用三明治夾心法，該方法具有較好的特異性。Liu Yushen等[64]開(kāi)發(fā)了一種基于Ag納米酶調(diào)控AuNPs聚集形態(tài)的比色傳感器。鄰苯二胺可誘發(fā)羧基修飾的AuNPs聚集，而AgNCs催化鄰苯二胺氧化，使聚集體解聚，溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色?；谶@一原理，利用適配體修飾的磁珠和抗體修飾的AgNCs捕獲李斯特菌形成三明治結(jié)構(gòu)，結(jié)合磁分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了豬肉中李斯特菌的準(zhǔn)確測(cè)定，同時(shí)靈敏度得以提升，檢測(cè)限為10 CFU/mL。阪崎腸桿細(xì)菌對(duì)免疫力較低者及嬰幼兒具有較大危害，感染嚴(yán)重可引起敗血癥、腦膜炎等。Zhang Li等[65]報(bào)道了一種基于生物酶-納米酶串聯(lián)催化和雙抗夾心法的試紙條，用于阪崎腸桿細(xì)菌活菌的檢測(cè)。該法采用單疊氮溴化丙啶區(qū)分阪崎腸桿細(xì)菌活菌和死菌、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行信號(hào)放大及DNA定量、Fe3O4類過(guò)氧化物酶納米酶催化H2O2氧化二氨基聯(lián)苯胺顯色，靈敏度與膠體金試紙條相比顯著提高（檢測(cè)限為2 CFU/mL），為開(kāi)發(fā)快速、高靈敏的活菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了有利的工具。Weerathunge等[66]利用諾如病毒與其核酸適配體的高親和力和核酸適配體對(duì)AuNPs類過(guò)氧化物酶催化活性的吸附抑制作用實(shí)現(xiàn)了諾如病毒的檢測(cè)。該法抗干擾能力強(qiáng)、可適用多種檢測(cè)場(chǎng)景，且與常規(guī)ELISA試紙條、石墨烯/納米金標(biāo)記抗體ELISA等現(xiàn)有方法相比在靈敏度（30 MNV/mL）和響應(yīng)時(shí)間（10 min）上均展現(xiàn)出較大優(yōu)勢(shì)，對(duì)其他病原體的實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有較好的借鑒意義。

2.6 其他污染物的檢測(cè)

除上述物質(zhì)外，納米酶還可用于食品中其他污染物的檢測(cè)中，如蘇丹紅I、三聚氰胺、克倫特羅、萊克多巴胺等違禁添加物、對(duì)苯二酚、對(duì)硝基苯酚等有機(jī)污染物、NO2-、CN-等無(wú)機(jī)物。

濫用禁用添加物所造成的食品安全問(wèn)題屢見(jiàn)報(bào)道。蘇丹紅I具有強(qiáng)烈的致癌作用，已被國(guó)家癌癥研究機(jī)構(gòu)列為三類致癌物，嚴(yán)禁在食品中添加。然而由于其顏色鮮艷、不易褪色、價(jià)格低廉，仍然被不法分子大量使用在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中。Palanisamy等[67]首次制備了Graphene/β-CD/PtNPs復(fù)合材料，并通過(guò)其開(kāi)發(fā)出一種靈敏可靠的新型電化學(xué)傳感器，用于測(cè)定食品中的蘇丹紅I。循壞伏安法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將PtNPs沉積在Graphene/β-CD表面，有利于增加蘇丹紅I的吸附位點(diǎn)并加快電極和蘇丹紅I間的電子轉(zhuǎn)移，因此，與Graphene/β-CD和PtNPs單獨(dú)修飾的電極相比，Graphene/β-CD/PtNPs修飾的電極對(duì)蘇丹紅I的電催化活性較強(qiáng)，可顯著提高檢測(cè)靈敏度。該法可實(shí)現(xiàn)辣椒粉、辣椒醬、番茄醬和番茄沙司中蘇丹紅I的測(cè)定，檢測(cè)限為1.6 nmol/L。三聚氰胺可提高蛋白質(zhì)檢測(cè)值，然而其長(zhǎng)期攝入會(huì)導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)中膀胱、腎產(chǎn)生結(jié)石甚至誘發(fā)膀胱癌，因此，國(guó)家嚴(yán)格限制其作為食品添加劑使用，并規(guī)定了食品中三聚氰胺的限量值（嬰幼兒配方食品：1 mg/kg；其他食品：2.5 mg/kg，參考GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》）。Ni Pengjuan等[68]發(fā)現(xiàn)三聚氰胺可通過(guò)誘導(dǎo)AuNPs聚集提高其類過(guò)氧化物酶活性，并利用該原理偶聯(lián)TMB-H2O2反應(yīng)，開(kāi)發(fā)了比色傳感器，紫外-可見(jiàn)光譜的檢出限為0.2 nmol/L，肉眼觀察的檢出限為5×102nmol/L，可成功應(yīng)用于牛奶、奶粉中三聚氰胺的檢測(cè)。鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺作為β-受體激動(dòng)劑，可有效增加肌肉蛋白含量并減低肌肉脂肪組織含量、提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度。然而其在動(dòng)物組織尤其是內(nèi)臟中殘留風(fēng)險(xiǎn)較高，會(huì)引起頭暈、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，我國(guó)已禁止其作為獸藥和飼料添加劑使用。Zhang Lihui等[69]以具有超高比表面積的氧化鋯為載體制備了(NH4)5PV8Mo4O40/ZrO2納米復(fù)合物。研究表明，由于(NH4)5PV8Mo4O40和ZrO2的協(xié)同作用，該復(fù)合材料修飾的電極具有穩(wěn)定性好、響應(yīng)快速、電催化活性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于豬肉樣品中克倫特羅和萊克多巴胺的靈敏、快速檢測(cè)，檢出限分別為5.03 nmol/L和9.3×102nmol/L。

據(jù)報(bào)道，外源性酚類化合物在食品、環(huán)境樣品中均有檢出，部分被列為3 類致癌物，對(duì)人體危害不容忽視。Yang Haiguan等[70]首次證明了CeVO4同時(shí)具有類過(guò)氧化物酶和氧化酶活性，可催化TMB顯色，其催化H2O2氧化TMB主要因?yàn)镠2O2分解生成羥自由基，其類氧化物活性主要與活性氧物質(zhì)的生成有關(guān)。由于對(duì)苯二酚是一種較強(qiáng)的抗自由基化合物，可抑制CeVO4-TMB催化氧化過(guò)程，而間苯二酚和鄰苯二酚不能影響TMB顯色反應(yīng)發(fā)生，故該比色法可成功區(qū)別對(duì)苯二酚和鄰/間二苯酚，具有較好的選擇性、特異性和靈敏度（檢出限為40 nmol/L）。4-氨基安替比林與鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、間苯二酚可在氧化劑存在下生成不同顏色的苯二氮卓類化合物。利用這一原理，Sun Ruiling等[71]開(kāi)發(fā)了基于血紅素-石墨烯雜化納米片類過(guò)氧化物酶活性的比色傳感器，實(shí)現(xiàn)了水中鄰苯二酚、對(duì)苯二酚、間苯二酚的同時(shí)測(cè)定，檢出限分別為1.6×106、8.3×105、2.5×106nmol/L。

亞硝酸鹽廣泛存在于自然界中，其也可作為防腐劑和肉制品護(hù)色劑用于食品生產(chǎn)中，然而食用亞硝鹽含量較高的食品，會(huì)引起呼吸衰竭甚至誘發(fā)癌癥。Zhuang Zhenjing等[72]通過(guò)在碳點(diǎn)表面原位還原氯金酸制備了C/AuNPs納米雜化物，并將該雜化物沉積在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上用于亞硝酸鹽的電化學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于碳點(diǎn)和AuNPs的協(xié)同作用，C/AuNPs修飾的GCE對(duì)亞硝酸鹽的氧化展現(xiàn)了良好的電催化活性，可實(shí)現(xiàn)水樣中亞硝酸鹽的快速高靈敏檢測(cè)（檢測(cè)限為60 nmol/L），且方法準(zhǔn)確度可與GB/T 7493—1987《水質(zhì) 亞硝酸鹽氮的測(cè)定 分光光度法》相媲美。碘是人體的必需微量元素，其過(guò)多或者不足攝入都會(huì)引起人體健康風(fēng)險(xiǎn)。He Shaobin等[73]制備了羧基殼聚糖修飾的PdNPs，I-可與Pd0形成Pd-I鍵從而占據(jù)PdNPs催化活性位點(diǎn)并誘導(dǎo)其聚沉，導(dǎo)致PdNPs對(duì)H2O2-TMB反應(yīng)的催化活性下降，顯色減弱。利用這一原理，He Shaobin等[73]采用比色法實(shí)現(xiàn)了水中I-的分析，檢出限為0.19 nmol/L。

3 結(jié) 語(yǔ)

納米酶由于兼具天然酶的催化活性以及易于修飾、可裁剪性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單、可適用于極端環(huán)境、便于貯存運(yùn)輸?shù)燃{米材料的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。雖然其應(yīng)用有效克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，具備一定的優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)了食品安全檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，但仍面臨著諸多挑戰(zhàn)（表2）。

表2 納米酶應(yīng)用優(yōu)勢(shì)與挑戰(zhàn)Table 2 Main advantages and disadvantages of peroxidase-like nanozymes

首先，與天然酶相比，納米酶種類有限且大部分納米酶活性較低，且目前對(duì)納米酶的研究主要集中在氧化還原酶模擬酶上，對(duì)其他類模擬酶的關(guān)注相對(duì)較少。因此，通過(guò)材料設(shè)計(jì)、形貌、粒徑、結(jié)構(gòu)和組成調(diào)控、表面修飾、元素?fù)诫s、材料復(fù)合等技術(shù)，模擬天然酶活性中心結(jié)構(gòu)和微環(huán)境、精準(zhǔn)控制催化位點(diǎn)、發(fā)揮復(fù)合材料協(xié)同效應(yīng)，以豐富納米酶種類并提高其自身催化性能是未來(lái)重要的研究方向之一。

其次，與天然酶可催化特定底物不同，納米酶底物選擇性和特異性較差，如何提升納米酶體系的特異性和選擇性是亟待解決的技術(shù)瓶頸之一。雖然將天然酶與納米酶整合可提高反應(yīng)體系選擇性，但天然酶的引入也帶了天然酶應(yīng)用時(shí)所面臨的局限性。發(fā)揮納米酶易修飾的特點(diǎn)，引入分子印跡技術(shù)和核酸適配體等識(shí)別技術(shù)等是可嘗試的研究方向。

再次，納米酶的催化機(jī)理研究還較為淺顯，導(dǎo)致當(dāng)前納米酶的定向設(shè)計(jì)較為困難。利用理論模擬和實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)合物理化學(xué)表征手段和人工智能學(xué)習(xí)，深入探索納米酶催化機(jī)理，對(duì)研究納米酶結(jié)構(gòu)組成和其功能構(gòu)效關(guān)系，依據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景合理設(shè)計(jì)納米酶功能、調(diào)控納米酶活性，開(kāi)發(fā)新型多功能納米酶材料，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜食品基質(zhì)中的痕量污染物分析具有重要意義，是未來(lái)的研究熱點(diǎn)。

此外，盡管納米酶已在食品安全領(lǐng)域取得了矚目的研究進(jìn)展，但目標(biāo)物仍局限在少數(shù)污染物。研究污染物與納米酶相互作用機(jī)理，開(kāi)發(fā)新的傳感策略是拓展納米酶在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用的重點(diǎn)研究方向之一。

最后，當(dāng)前基于納米酶的分析方法多為比色法，雖然比色法具有操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)勢(shì)，但其靈敏度相對(duì)較低、易受雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致復(fù)雜基質(zhì)中痕量污染物檢測(cè)不準(zhǔn)確。如何利用納米酶自身獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)（磁性、熒光、熱等），將納米酶和化學(xué)發(fā)光、熒光光譜、電化學(xué)、拉曼光譜等技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建多模式、實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確的智能檢測(cè)技術(shù)是未來(lái)的研究趨勢(shì)。