姚芬，高虹，殷朝敏，史德芳，胡龍，范秀芝

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064）

猴頭菇（Hericium erinaceus）屬擔(dān)子菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、猴菌目、猴菌科、猴菌屬，是一種珍貴的藥食同源真菌[1]。相關(guān)研究表明猴頭菇具有維護(hù)胃腸道健康[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]、抗癌[4-5]、抗氧化[6]、降血糖[7]、降血脂[8]、神經(jīng)保護(hù)[9-10]等多種生理功能。然而，目前對(duì)猴頭菇功效成分的研究主要集中在多糖、蛋白質(zhì)、多肽、漆酶和甾醇等方面，對(duì)酚類物質(zhì)的研究報(bào)道相對(duì)較少。

植物多酚（polyphenols）是一種具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，大量研究表明食用菌酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒以及預(yù)防心血管疾病等作用，這些作用均與酚類物質(zhì)的組成與結(jié)構(gòu)有關(guān)[11-12]。Kawagishi等[13-15]從猴頭菇內(nèi)分離得到Hericenone A，Hericenone B，Hericenone C，Hericenone D，Hericenone E，Hericenone F，Hericenone G和Hericenone H 8種酚類物質(zhì)，其中Hericenone A-C具有抑制宮頸癌細(xì)胞的作用；Ma等[16]從猴頭菇子實(shí)體中分離得到Hericenone I和Hericene D，并證明這兩種酚類物質(zhì)對(duì)食道癌細(xì)胞EC109具有細(xì)胞毒性作用；胡瀟文[17]從猴頭菇菌絲體中分離得到Hericenone I和Hericene D，并證明這兩種酚類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)作用。目前，除了結(jié)構(gòu)和功能明確的酚類物質(zhì)Hericenone A-I外，猴頭菇中其它大部分酚類物質(zhì)的研究主要集中在總酚和總黃酮的含量與活性分析上，而對(duì)酚類物質(zhì)的組分研究報(bào)道較少[18]。本試驗(yàn)在對(duì)猴頭菇有機(jī)相提取物進(jìn)行定性的基礎(chǔ)上，采用超高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-electro spray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESI-MS）對(duì)猴頭菇醇提物及其石油醚萃取相、氯仿萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相中的14種酚酸和12種黃酮進(jìn)行定量分析，旨在為研究猴頭菇酚類物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系和今后開(kāi)展體內(nèi)活性研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菇：中國(guó)林業(yè)栽培采集中心采集的猴頭菌H99菌株（CFCC 83090）在 4℃的 PDA（potato dextros agar）培養(yǎng)基上保存，并在25℃下進(jìn)行菌種活化，活化后的菌種接種于以60%桑枝、20%葛根渣、18.8%麥麩、1.0%硫酸鈣、0.2%碳酸鈣為基質(zhì)制作的無(wú)菌接種袋中[19]。接種袋在溫度23℃～25℃、相對(duì)濕度90%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待子實(shí)體成熟即可采收。

乙腈、甲酸、甲醇（均為色譜純）、酚酸標(biāo)準(zhǔn)品、黃酮標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純）：美國(guó)Sigma公司；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-1000VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Q Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧離子源（ESI）和Xcalibur工作站]：美國(guó)Thermo公司；Acquity超高效液相色譜：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物的制備

摘取新鮮的猴頭菇子實(shí)體，切成小塊于55℃的恒溫干燥箱內(nèi)干燥，恒重后粉碎過(guò)80目篩，即得猴頭菇菌粉。將猴頭菇菌粉（600 g）用10倍體積95%乙醇浸提2次，每次24 h。過(guò)濾分離殘?jiān)?，合并兩次濾液，減壓濃縮，取1/5浸膏凍干得到醇提物（ethanol extraction，EE）。將剩余醇提物按 1∶20（g/mL）溶于蒸餾水中，依次用等體積石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇于600 W超聲功率下萃取1 h，每種溶劑重復(fù)萃取3次，合并提取液，減壓濃縮得到石油醚萃取物（petroleum ether fraction，PEF）18.02 g、氯仿萃取物（chloroform fraction，CF）2.08 g、乙酸乙酯萃取物（ethyl acetate fraction，EAF）2.07 g、正丁醇萃取物（n-butanol fraction，NF）11.00 g。

1.3.2 樣品前處理

酚酸類化合物樣品制備：精確稱量0.1 g～0.5 g樣品于15 mL玻璃試管中，加入2 mL 1 mol/L NaOH，28℃搖床抽提2 h，加入500 μL 5 mol/L鹽酸，隨后加2 mL乙酸乙酯，離心后吸取乙酸乙酯相，重復(fù)3次。將乙酸乙酯收集到一起，氮?dú)獯蹈?。?.5 mL甲醇溶解上機(jī)。

黃酮類化合物樣品制備：精確稱量50 mg樣品于2 mL離心管中，加入1 mL甲醇；放水浴鍋中65℃抽提4 h，12 000 r/min離心10 min后取上清液，等待上機(jī)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取900 μL的水溶液于10 mL容量瓶中，依次加入原兒茶酸、沒(méi)食子酸、苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、香草醛、丁香醛、4-羥基苯甲酸、芥子酸、反式阿魏酸、氫化肉桂酸和反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，加水定容至10 mL，再用甲醇稀釋10倍后即得濃度為100 μg/mL的標(biāo)樣儲(chǔ)備液。再將儲(chǔ)備液梯度稀釋成 1/100、5/100、10/100、20/100、40/100、60/100、80/100、100/100 ng/mL 工作液備用。

黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取900 μL 50%的甲醇溶液加入10mL容量瓶中，依次加入L-苯丙氨酸、兒茶素、表兒茶素、牡荊素、槲皮苷、楊梅素、木犀草素、槲皮素、芹菜素、柚皮素、山奈酚和異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，加50%的甲醇溶液定容至10 mL，再用50%甲醇水溶液稀釋10倍后即得濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。再將儲(chǔ)備液梯度稀釋成1/1 000、5/1 000、10/1 000、20/1 000、40/1 000、80/1 000、160/1 000、320/1 000、500/1 000 ng/mL工作液備用。

1.3.4 超高效液相色譜條件

Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱；流動(dòng)相A（0.1%乙酸-水溶液），流動(dòng)相B（0.1%乙酸-乙腈）；梯度洗脫：10%A-90%B（0～2 min），60%A-40%B（2 min～9 min），10%A-90%B（9 min～10 min）；進(jìn)樣量為2 μL；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.5 質(zhì)譜條件

采用美國(guó)Thermo公司的Q exactive高分辨質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，電噴霧離子源，分析物在負(fù)離子同時(shí)掃描下以單離子檢測(cè)模式進(jìn)行分析；鞘氣40 arb；輔助氣10 arb；離子噴霧電壓+3 000 V；溫度350℃；離子傳輸管溫度320℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Peakview 1.2和Analyst 1.6（ABSciex）統(tǒng)計(jì)分析，取平均值。采用 SPSS 21.0軟件在P＜0.01水平進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線信息

26種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖見(jiàn)圖1。沒(méi)食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、對(duì)香豆酸、香草醛、4-羥基苯甲酸、丁香醛、芥子酸、反式阿魏酸、苯甲酸、氫化肉桂酸和反式肉桂酸，14種酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖見(jiàn)圖2。26種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)如表1所示。L-苯丙氨酸、兒茶素、表兒茶素、牡荊素、槲皮苷、楊梅素、木犀草素、槲皮素、芹菜素、柚皮素、山奈酚、異鼠李素，12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖見(jiàn)圖3。

表1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 1 Regression equation of standard phenolic acid samples

圖1 酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig.1 Total current ion diagram of phenolic components standards

圖2 酚酸類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖Fig.2 Ion current diagram of phenolic acid standards

續(xù)表1 酚酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Continue table 1 Regression equation of standard phenolic acid samples

圖3 黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品離子流圖Fig.3 Ion current diagram of flavonoids standards

從表1中可以看出，所用檢測(cè)方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程R2均大于0.99，可以用于以上酚酸和黃酮類物質(zhì)的定量分析。

2.2 猴頭菇醇提物及不同有機(jī)萃取物中酚酸類物質(zhì)定量分析

按照所建立的UPLC-ESI-MS方法，依據(jù)保留時(shí)間等信息，結(jié)合表1中14種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程，計(jì)算出猴頭菇醇提物及4種有機(jī)溶劑萃取物中14種酚酸含量如表2所示。

從表2可以看出，猴頭菇醇提物及4種有機(jī)溶劑萃取物中酚酸組成較一致，但組分含量差異明顯。EE中含量較高的為苯甲酸和反式肉桂酸，PEF中含量較高的為苯甲酸、肉桂酸、沒(méi)食子酸，CF中含量最高的為苯甲酸、反式阿魏酸、反式肉桂酸，EAF中含量較高的為反式阿魏酸、苯甲酸、原兒茶酸，NF中含量較高的為苯甲酸、沒(méi)食子酸。相對(duì)于其他酚酸組分，苯甲酸在EE、PEF、CF和 NF中的含量均為最高，分別為202.951、1 209.208、3 512.186、78.219 μg/100 mg，四者之間存在極顯著性差異（P＜0.01）。而EAF中反式阿魏酸含量最高，其含量為857.464 μg/100 mg。有報(bào)道指出，苯甲酸在酸性條件下具有很好的抑菌作用[20]，Rezaeiroshan等[21]指出反式阿魏酸是一種重要的具有生物活性的膳食多酚，具有抗炎、抗氧化、抗菌等多種生理功能，由此推測(cè)猴頭菇醇提物及4種有機(jī)溶劑萃取物在抑菌、抗炎等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，后續(xù)會(huì)對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 猴頭菇醇提物及不同有機(jī)萃取物中酚酸類物質(zhì)組成及含量Table 2 Composition and content of phenolic acids of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

2.3 猴頭菇醇提物及不同有機(jī)萃取物中黃酮類物質(zhì)定量分析

按照所建立的UPLC-ESI-MS方法，依據(jù)保留時(shí)間等信息，結(jié)合表1中12種黃酮類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程，計(jì)算出猴頭菇醇提物及4種有機(jī)溶劑萃取物中12種黃酮類物質(zhì)含量如表3所示。

表3 猴頭菇醇提物及不同有機(jī)萃取物中黃酮類物質(zhì)組成及含量Table 3 Composition and content of flavonoids of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

由表3可知，猴頭菇醇提物及4種有機(jī)相黃酮組成和含量差異明顯，且黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酚酸含量。相對(duì)于其他黃酮組分，L-苯丙氨酸在EE、PEF、CF和NF中含量均為最高，其中EE、PEF、CF、NF中L-苯丙氨酸含量分別為 25.688、36.104、6.838、24.080 μg/100 mg。而EAF中表兒茶素含量最高，其含量為0.740 μg/100 mg。

相關(guān)研究表明食用菌中酚類物質(zhì)的組成主要為酚酸和黃酮。Liu等[22]研究指出雙孢菇中的酚類物質(zhì)主要為咖啡酸、沒(méi)食子酸、阿魏酸、原兒茶素和楊梅素。Woldegiorgis等[23]研究表明硫磺菌中主要的酚類物質(zhì)為對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、綠原酸、沒(méi)食子酸和楊梅素。石芳等[24]研究表明黑脈羊肚菌中主要含沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、白藜蘆醇、木犀草素、槲皮素等酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)出的猴頭菇中的酚類物質(zhì)大部分為酚酸，少部分為黃酮，且酚酸和黃酮的組成和含量均存在差異。這種差異可能與提取試劑的極性有關(guān)，極性不同導(dǎo)致酚類物質(zhì)在不同溶劑中的溶解性不同，提取率也不同。大量的研究已經(jīng)表明，提取溶劑的極性與酚類化合物的提取率有關(guān)。董蕊等[25]研究了木賊醇提物及不同萃取部位總酚酸、黃酮的含量，結(jié)果表明乙酸乙酯相總酚酸和黃酮的相對(duì)含量高于石油醚、正丁醇和水相。涂宗財(cái)?shù)萚26]比較了紅薯葉在不同溶劑（水、甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯和氯仿）中總酚和總黃酮的含量，結(jié)果表明甲醇中總酚和總黃酮含量最高。劉曦等[27]研究了藍(lán)莓葉不同極性提取劑對(duì)總酚含量的影響，結(jié)果表明水提物中總酚含量最高。由此可見(jiàn)提取溶劑的極性對(duì)酚類物質(zhì)提取率有較大的影響，不同植物的酚類物質(zhì)組成不同，提取率也存在差異。因此要得到更全面的猴頭菇酚類物質(zhì)組成，需要進(jìn)一步優(yōu)化質(zhì)譜條件和利用更高級(jí)的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行對(duì)未檢測(cè)的其他比較復(fù)雜的酚類物質(zhì)和衍生物進(jìn)行分析。

3 結(jié)論

本研究建立了24種酚類化合物的超高效液相色譜－電噴霧質(zhì)譜法，并用所建立的方法分析了猴頭菇醇提物及不同有機(jī)溶劑萃取物中酚類物質(zhì)的組成和含量。相對(duì)于其他酚酸和黃酮組分，苯甲酸和L-苯丙氨酸在EE、PEF、CF和NF中的含量均為最高，反式阿魏酸和表兒茶素在EAF中含量最高。猴頭菇醇提物及不同有機(jī)溶劑萃取物中的酚酸和黃酮組分的含量均存在一定的差異，EE中主要含苯甲酸、反式肉桂酸和L-苯丙氨酸，PEF中苯甲酸、肉桂酸、沒(méi)食子酸和L-苯丙氨酸含量相對(duì)較高，CF中含量最高的為苯甲酸、反式阿魏酸、反式肉桂酸和L-苯丙氨酸，EAF中主要酚類組分為反式阿魏酸、苯甲酸、原兒茶酸和表兒茶素，NF中含量較高的為苯甲酸、沒(méi)食子酸和L-苯丙氨酸。這為進(jìn)一步研究猴頭菇中酚類物質(zhì)提供了理論依據(jù)，對(duì)猴頭菇中活性成分的開(kāi)發(fā)與利用具有參考意義。