何畏，曹曦

電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬綿陽醫(yī)院·綿陽市中心醫(yī)院口腔科，四川 綿陽 621000

間充質(zhì)干細胞是具有多向分化能力的干細胞，其應(yīng)用于顱頜面骨缺損修復(fù)是近年來的研究熱點。在目前的顱頜面骨組織工程研究及臨床應(yīng)用中，由于長骨骨髓間充質(zhì)干細胞易于獲取，純度高，通常以股骨和脛骨來源的骨髓間充質(zhì)干細胞為主[1-3]。近年來，研究者在顱頜面骨骨縫中發(fā)現(xiàn)新的間充質(zhì)干細胞并成功分離培養(yǎng)，并證實顱頜面骨骨縫間充質(zhì)干細胞(calvarial suture stem cells，CSSCs)是顱頜面骨主要的干細胞，引起成骨端、骨膜、硬腦膜及顱面骨的形成，主要參與顱頜面的形成發(fā)育及缺損修復(fù)[4-6]。當(dāng)顱頜面骨骨縫間充質(zhì)干細胞增殖、分化和凋亡程序出現(xiàn)紊亂時，即可引發(fā)顱頜面骨發(fā)育障礙[7-9]。骨髓間充質(zhì)干細胞與顱頜面骨骨縫間充質(zhì)干細胞胚層來源不同，四肢骨骼僅由中胚層來源，通過軟骨內(nèi)成骨形成；顱頜面骨為扁骨，來源于神經(jīng)嵴和軸旁中胚層，通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨形成[10]。本實驗通過分離培養(yǎng)大鼠顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞和股骨骨髓間充質(zhì)干細胞，并對其進行鑒定。隨后在體外分別進行成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)，分析兩種細胞的成骨和成脂能力差異。本實驗旨在研究不同骨骼來源的間充質(zhì)干細胞之間的差異，對顱頜面骨組織工程的發(fā)展和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生5 d的SD(Sprague Dawley)大鼠10只由四川大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗試劑和儀器α-MEM培養(yǎng)基(Hy-Clone公司，美國)；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(GIBICO公司，美國)；青霉素和鏈霉素(華北制藥有限公司)；FITC-抗CD29、FITC-抗CD11b、FITC-抗CD45、FITC-抗CD90(BioLegend)；多聚甲醛(Sigma-Aldrich)；磷酸鹽緩沖液；消毒酒精(口腔疾病研究國家重點實驗室)；成骨誘導(dǎo)液的配置：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，10 mmol/Lβ甘油磷酸鈉0.05 mmol/L維生素C和100 mmol/L地塞米松；COL1A Antibody(COL-1)(生產(chǎn)商：Santa)；Anti-Alkaline Phosphatase(生產(chǎn)商：Abcam)；RUNX2(D1L7F)Rabbit mAb(生產(chǎn)商：CST)；Anti-Osteocalcin antibody[OC4-30](生產(chǎn)商：Abcam)；β-Actin(4D3)monoclonal antibody(生產(chǎn)商：Bioworlde)；鈣鹽染色液(茜素紅S)、堿性磷酸酶染色液(生產(chǎn)商：Leagene)；M-PER蛋白提取劑(Thermo Fisher Scientific)；蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Roche)；4×LDS樣品緩沖液(Invitrogen)；BioMax膠片(Kodak)；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Stem Cell Technologies Inc)；油紅O(Sigma-Aldrich)；M-PER蛋白提取劑(Thermo Fisher Scientific)；抗PPARγ抗體、抗LPL抗體(Santa Cruz)；吸管若干、5 mL一次性注射器、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、15 mL塑料離心管、30 cm2塑料培養(yǎng)皿、六孔培養(yǎng)板(Corning)。其他：組織剪、眼科剪、眼科鑷、紗球、無菌紗布、骨膜分離器。超凈工作臺(蘇州市凈化設(shè)備總廠)；Beckman低溫低速離心機(Beckman公司，美國)；DMLS光學(xué)顯微鏡(LEICA公司，德國)；二氧化碳培養(yǎng)箱(SHELL/JB公司，美國)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；流式細胞儀(Becton-Dickinson)；WD-9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)；電泳電源(CIB-RAD)，制膠器，轉(zhuǎn)膜儀，電泳槽(北京市六一儀器廠)；PVDF膜(MILLIPORE)；FTC3000實時熒光定量基因擴增儀(FUNGLYN公司，加拿大)；相機。

1.2 實驗方法

1.2.1 CSSCs的體外分離、培養(yǎng) 取出生后5 d SD大鼠，頸椎脫臼處死，浸入75%酒精中消毒，3 min后取出，無菌條件下沿顱骨正中縫切開皮膚及皮下組織，剔除附著的結(jié)締組織及骨膜，保留正中縫兩側(cè)各1 mm，小心切下，并與硬腦膜分離。用PBS緩沖液反復(fù)沖洗分離好的骨縫區(qū)骨塊。將骨縫區(qū)骨塊剪成小段，置于含10%胎牛血清α-DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基量僅覆蓋骨塊即可。放置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中。每隔4~5 h觀察培養(yǎng)基的量，適時添加。2~3 d后，細胞將從骨塊中心的骨縫區(qū)爬出。以后每3 d全量換液一次。

1.2.2 BMSCs的體外分離、培養(yǎng) 取出生后5 d SD大鼠，頸椎脫臼處死，浸入75%酒精中消毒，3 min后取出，無菌條件下分離雙下肢，將分離好的股骨和脛骨浸入預(yù)先置有PBS緩沖液培養(yǎng)皿中。PBS徹底沖洗骨表面，剪去雙側(cè)骨骺端，用無菌注射器抽取培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔2~3次，沖出骨髓，將沖出液收集到離心管中，吹打混勻后進行離心，1 500 r/min×5 min。棄去上清液，用含10%胎牛血清的α-DMEM培養(yǎng)基重懸，并充分吹均勻，用無菌滴管將細胞懸液接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，24 h半量換液，以后每3 d全量換液一次。

1.2.3 CSSCs和BMSCs的體外擴增 待9~12 d，細胞達到80%~90%融合后吸棄培養(yǎng)基，以PBS沖洗2~3次，加入1~2 mL混合消化液(0.02%EDTA：0.25%胰酶=1∶1)，按1∶2傳代培養(yǎng)。之后每3 d換液一次，密切觀察細胞生長情況，待細胞基本融合，再以上述方法進行連續(xù)傳代擴增培養(yǎng)至第三代用于以后試驗。

1.2.4 CSSCs和BMSCs表型分析 將第三代CSSCs和BMSCs經(jīng)消化、離心、重懸后，各分成兩管，作為抗體指標(biāo)和同型對照。分別加入CD-29、CD11b、CD90、CD45，以及其相應(yīng)的同型對照。孵育15 min(切記要避光)后，加入PBS終止，1 200 r/min離心5 min，棄上清。PBS重懸，流式細胞儀檢測。重復(fù)測定3次。

1.2.5 CSSCs和BMSCs體外成骨誘導(dǎo) 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的細胞密度進行接種，2 d貼壁后開始進行成骨誘導(dǎo)。除去培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)液。細胞成骨誘導(dǎo)14 d后進行Ⅰ型膠原免疫熒光檢測和堿性磷酸酶染色。誘導(dǎo)21 d后進行茜素紅染色。

1.2.6 免疫印跡法(Western blot)檢測細胞成骨分化蛋白表達水平差異 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，2 d貼壁后開始進行成骨誘導(dǎo)。誘導(dǎo)1周后每瓶細胞加入含PMSF的裂解液400μL，收集細胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移到離心管中，加入loading-buffer煮沸5 min使蛋白變性，加樣品于10%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，30 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h。配制封閉液，將脫脂牛奶5.0 g加入100 mL TBST，混勻。加入一抗勻速震搖，4℃過夜。TBST振洗15 min，重復(fù)4次。TBST振洗15 min，重復(fù)4次。將膜取出，置于曝光盒，加入發(fā)光底物避光孵育5 min，進入暗室，將膠片壓在膜上進行曝光。在Typhoon系統(tǒng)上掃描結(jié)果，Image J軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參，實驗重復(fù)三次。

1.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測細胞成骨分化基因表達 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的細胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，2 d貼壁后進行成骨誘導(dǎo)。誘導(dǎo)1周后，每孔加1 mL TRIzol Reagent裂解細胞，反復(fù)吹打，將裂解液收集進1.5 mL離心管，每管加0.2 mL氯仿和0.5 mL異丙醇，混勻后室溫孵育10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min。移去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀，7 400 r/min，4℃離心5 min。移去乙醇，自然晾干沉淀5~10 min。加入DEPC處理水，溶解RNA沉淀。檢測RNA質(zhì)量和RNA濃度。將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用20 uL體系，置于PCR儀上，37℃反應(yīng)15 min、85℃反應(yīng)5 s、4℃反應(yīng)5 min合成cDNA。采用20 uL體系對cDNA進行擴增，本步驟均在冰上操作。引物設(shè)計序列如下：ALPF：TTGGACTGACTGGGAAGGGAGA；ALPR：TCAATC CTGCCTCCTTCCACTA；OCNF：TCTCTCTGCTCAC TCTGCTGG；OCNR：CGAGGTTCAGGTAACAACTC CATC；RUNX2F：GGCCGGGAATGATGAGAACTA；RUNX2R：GTTTCACTTTGAGAACGGAGCAG。

1.2.8 CSSCs和BMSCs體外成脂誘導(dǎo) 取第三代CSSCs和BMSCs，按照1×106/L的細胞密度接種于6孔板，2 d貼壁后開始進行成脂誘導(dǎo)，3 d換液一次。成脂誘導(dǎo)2周后進行油紅O染色。

1.2.9 Western Blotting檢測細胞成脂分化蛋白表達水平 實驗方法同上。

1.3 主要觀察指標(biāo) ①CSSCs和BMSCs的特點，流式鑒定結(jié)果；②CSSCs和BMSCs成骨分化能力；③CSSCs和BMSCs成脂分化能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用One-way ANOVA分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSSCs的分離、培養(yǎng)和傳代擴增特點 分離獲取的骨縫碎塊在培養(yǎng)3~4 d后可見細胞從骨縫區(qū)爬出(圖1A)。待細胞慢慢分裂增殖后細胞表現(xiàn)出形態(tài)的多樣性。約2周后貼壁細胞接近80%融合，貼滿瓶底，形態(tài)多為梭形或星形(圖1B)。此時進行傳代，剛傳代的細胞呈球形，生長潛伏期較原代細胞短，沉降貼壁速度較原代細胞快，待長滿培養(yǎng)瓶底，此時即可再傳代(圖1C)。

圖1 不同時期大鼠顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞形態(tài)(×40)

2.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)和傳代擴增特點 分離獲取的BMSCs培養(yǎng)72 h后細胞開始進行分裂增殖，形成比較大片的細胞團(圖2A)。約1周后細胞形成集落，多為成纖維細胞形態(tài)，互相融合成片(圖2B)。9~12 d后貼壁細胞接近80%~90%融合，貼滿瓶底，形態(tài)多為梭形。此時進行傳代，傳代后的細胞形態(tài)與原代一致，增殖速度與原代相比明顯增快。多次傳代后，BMSCs細胞純度更高，呈現(xiàn)更均勻的成纖維細胞樣分布特征(圖2C)。連續(xù)傳代，形態(tài)無明顯變化。

圖2 不同時期大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(×40)

2.3 CSSCs的鑒定 第三代CSSCs流式檢測結(jié)果顯示：高表達CD90、CD29且陽性率分別為99.8%和99.9%，CD11b及CD45基本呈陰性(圖3)。說明培養(yǎng)擴增的細胞具有干細胞特征，為MSCs中的一群。

圖3 CSSCs表面抗原檢測

2.4 BMMSCs的鑒定 P3代BMSCs流式檢測結(jié)果顯示：高表達CD90、CD29且陽性率分別為99.6%和99.4%，CD11b及CD45基本呈陰性(圖4)。說明培養(yǎng)擴增的細胞具有干細胞特征，為MSCs中的一群。

圖4 BMMSCs表面抗原檢測

2.5 CSSCs和BMSCs成骨誘導(dǎo)分化能力比較成骨誘導(dǎo)14 d后，CSSCs和BMSCsⅠ型膠原免疫熒光染色均呈陽性反應(yīng)，且CSSCsI型膠原的表達高于BMMSCs(圖5A、5B)。堿性磷酸酶(ALP)染色結(jié)果顯示大部分CSSCs和BMSCs胞質(zhì)中可見紅色ALP陽性顆粒，CSSCsALP染色陽性區(qū)域多于BMMSCs(圖5C、5D)。成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示CSSCs和BMSCs成骨誘導(dǎo)后均出現(xiàn)茜素紅陽性區(qū)域，CSSCs陽性區(qū)域更多(圖5E、5F)。因此，CSSCs和BMSCs均可向成骨細胞分化，CSSCs體外成骨分化能力較BMMSCs強。

圖5 CSSCs和BMSCs成骨誘導(dǎo)分化能力

2.6 細胞成骨分化相關(guān)蛋白表達水平比較 在成骨誘導(dǎo)7 d時對ALP、OCN、RUNX2蛋白水平進行檢測，采用Image J對Western blot條帶進行量化。結(jié)果顯示CSSCs組ALP、OCN、RUNX2蛋白含量高于BMSCs組，以β-actin為內(nèi)參，RUNX2、ALP、OCN蛋白含量在CSSCs中的表達分別是BMSCs的2.1、1.8、1.5倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 Western blot檢測成骨分化相關(guān)基因的表達水平

2.7 細胞成骨分化相關(guān)基因表達水平比較 成骨誘導(dǎo)7 d對ALP、OCN、RUNX2 mRNA水平進行檢測，結(jié)果與蛋白差異基本一致，CSSCs組ALP、OCN、RUNX2mRNA相對表達量高于BMSCs組，以GAPDH為內(nèi)參，RUNX2、ALP、OCNmRNA水平在CSSCs中的表達分別是BMSCs的2.23、1.92、1.56倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 RT-PCR檢測細胞成骨分化相關(guān)基因表達水平

2.8 CSSCs與BMMSCs體外成脂誘導(dǎo)

2.8.1 油紅O染色 成脂誘導(dǎo)14 d進行油紅O染色。染色結(jié)果顯示CSSCs與BMMSCs體外成脂誘導(dǎo)后均出現(xiàn)染色陽性區(qū)域，BMSCs油紅O陽性區(qū)域更多。因此，油紅O染色說明CSSCs較BMMSCs體外成脂分化能力弱，見圖8。

圖8 油紅O染色(×40)

2.8.2 細胞成脂分化相關(guān)基因PPARγ和LPL表達水平比較 成脂誘導(dǎo)7 d對PPARγ和LPL蛋白水平進行檢測，采用Image J對Western blot條帶進行量化。結(jié)果顯示CSSCs組PPARγ和LPL蛋白水平含量低于BMSCs組，以β-actin為內(nèi)參，PPARγ和LPL蛋白水平在BMSCs中的表達分別是CSSCs的2.5、1.8倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。

圖9 Western blot檢測成脂分化相關(guān)基因表達水平

3 討論

除了生命中的自然更替，骨骼還具有自我修復(fù)能力，以應(yīng)對損傷或疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)流失[11]。大量骨缺損模型研究已證實，間充質(zhì)干細胞在損傷和疾病造成的骨質(zhì)流失修復(fù)中起了巨大作用[11-13]。長骨骨髓間充質(zhì)干細胞的來源已被廣泛研究多年，研究發(fā)現(xiàn)其中主要的干細胞群體駐留在骨髓腔血管周圍[3，14]。目前BMSCs的體外分離培養(yǎng)方法已經(jīng)很成熟，做到無菌操作即可。根據(jù)BMSCs在塑料組織培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特性，骨髓貼壁法已成為一種簡單易行、操作性較強的分離培養(yǎng)方法[15]。所得BMMSCs活力好，貼壁生長以及擴增傳代較理想[14]。相比之下，目前對干細胞在顱骨修復(fù)中的作用知之甚少。與長骨不同，顱面骨為扁骨，主要由膜內(nèi)成骨形成，而不是軟骨內(nèi)成骨，因此骨髓腔空間極小。先前的研究認(rèn)為，上覆的骨膜和下覆的硬膜為顱骨骨修復(fù)提供骨祖細胞[16-18]，最近的研究發(fā)現(xiàn)顱骨骨縫間充質(zhì)中存在具有多種分化能力和內(nèi)在修復(fù)潛力的干細胞群[19-20]。骨縫區(qū)骨髓量極少，無法采取常規(guī)方法獲取顱骨骨縫區(qū)骨髓，因此只能采用骨縫區(qū)骨塊進行培養(yǎng)，將骨縫區(qū)骨塊分離，盡量去除骨縫區(qū)周圍骨，但不破壞骨縫，待細胞自行爬出，并進行相應(yīng)的鑒定。本實驗分別從大鼠的股骨骨髓和顱骨骨縫中分離培養(yǎng)干細胞，BMSCs約1周后形成集落，多為成纖維細胞形態(tài)，互相融合成片。9~12 d后貼壁細胞接近80%~90%融合，貼滿瓶底，形態(tài)多為梭形。分離獲取的顱骨骨縫碎塊在培養(yǎng)3~4 d后可見細胞從骨縫區(qū)爬出。約2周后貼壁細胞接近80%融合，貼滿瓶底，形態(tài)多為梭形或星形。經(jīng)過細胞表面標(biāo)志鑒定，BMSCs與CSSCs均高表達CD90、CD29(表示細胞處于原始的未分化狀態(tài))，而細胞表面抗原CD11b、CD45(兩者均屬造血系統(tǒng)細胞標(biāo)記物)幾乎不表達CD90[21]。根據(jù)檢測結(jié)果，可初步確定其即為本研究需要的BMSCs和CSSCs。

分化潛能是間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于組織工程的基本前提。該研究分離的骨髓間充質(zhì)干細胞和顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞經(jīng)體外成骨、成脂誘導(dǎo)后，均可合成I型膠原，形成鈣結(jié)節(jié)、堿性磷酸酶顆粒和脂滴，同時對ALP、OCN、RUNX2三個骨形成相關(guān)因子以及PPARγ和LPL兩個脂形成相關(guān)因子的蛋白和mRNA分別進行western blot和PCR檢測。研究發(fā)現(xiàn)顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相同的生物學(xué)特性：均可以體外多向誘導(dǎo)分化；且顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力更強，而骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化能力更強，因此顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞更適用于骨組織工程。近來有研究成功分離培養(yǎng)下頜骨間充質(zhì)干細胞，并發(fā)現(xiàn)下頜骨間充質(zhì)干細胞較骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨向分化能力更強，而成脂分化能力弱[22]，與顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞的多向分化能力相似。目前研究認(rèn)為出現(xiàn)此差異是由于骨髓間充質(zhì)干細胞與顱頜面骨間充質(zhì)干細胞胚層來源不同，四肢骨骼僅由中胚層來源，通過軟骨內(nèi)成骨形成；顱頜面骨為扁骨，來源于神經(jīng)嵴和軸旁中胚層，通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨形成[10]，因此顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞與下頜骨間充質(zhì)干細胞具有類似的多分化能力，而與骨髓間充質(zhì)干細胞之間存在一定差異。

干細胞分化能力對于適當(dāng)?shù)淖晕倚迯?fù)至關(guān)重要，以此來應(yīng)對損傷或生理性的骨丟失。目前存在大量關(guān)于干細胞自我修復(fù)機制的研究。研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞通過建立一個可再生的造血微環(huán)境來幫助修復(fù)，同時也為所有新形成的骨骼成分提供祖細胞[23-24]。關(guān)于顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞的招募機制和顱骨創(chuàng)面修復(fù)過程中的作用，已有研究證實與之前認(rèn)為參與顱骨修復(fù)的祖細胞主要位于骨膜的觀點相反，具有再生能力的是組織間質(zhì)內(nèi)的干細胞，而不是周圍的膜[20，25]。當(dāng)顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞直接移植到損傷部位后可以改善損傷修復(fù)，強烈提示對骨修復(fù)有直接作用[6]。由此可見，顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力在組織再生中發(fā)揮了巨大的作用。

綜上，本研究成功分離培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細胞和顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞，并進行成骨、成脂誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)顱骨骨縫間充質(zhì)干細胞成骨能力更強，而骨髓間充質(zhì)干細胞成脂能力更強，為其在顱頜面骨組織工程的發(fā)展和臨床應(yīng)用中提供實驗依據(jù)。