余文，安琳，崔生輝

（中國食品藥品檢定研究院,北京 100050）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM，以下簡稱單增李斯特菌）為細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性無芽孢桿菌，是引起人畜共患病的重要食源性致病菌[1-3],它可以污染生肉、熟肉制品、蛋類等多種食品[4]。單增李斯特菌可以在冷藏條件下生長，其污染水平是確定冷藏食品安全性的關(guān)鍵因素[5]。低濃度（102CFU/g）的污染即可感染高危人群，包括新生兒、孕婦和免疫缺陷者等[6-7]，引起敗血癥、腦膜炎及單核細胞增生等多種疾病，死亡率高達20%～30%[8-10]。鑒于單增李斯特菌致病力較強[11-12]，GB 29921-2021《食品安全國家標準預(yù)包裝食品中致病菌限量》[13]中對熟肉制品和即食生肉制品中單增李斯特菌進行了明確的限量規(guī)定，并指定依據(jù) GB 4789.30-2016《食品安全國家標準食品中微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[14]（以下簡稱 GB 4789.30-2016）開展檢驗。

GB 4789.30-2016中使用李氏增菌肉湯（LB1、LB2）對食品中可能污染的單增李斯特菌進行兩步選擇性增菌，再劃線到 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基上對可疑菌落進行分離，并進行生化鑒定。其中 LB1、LB2增菌肉湯和選擇分離培養(yǎng)基是影響單增李斯特菌分離效果的重要因素。GB 4789.28-2013《食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[15]（以下簡稱 GB 4789.28-2013）選用了一株單增李斯特菌（ATCC19115）和2株非目標菌（大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌ATCC29212）采用了半定量的方法對 LB1、LB2增菌肉湯進行質(zhì)控。但單增李斯特菌作為一個種，其遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，僅符合GB 4789.28-2013的培養(yǎng)基是否能滿足常見單增李斯特菌的分離尚有待分析。

本研究使用30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌對市售4個品牌的李氏增菌肉湯、6個品牌的PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基質(zhì)量進行了對比分析，所獲數(shù)據(jù)以期為培養(yǎng)基的質(zhì)控、GB 4789.28-2013和GB 4789.30-2016修訂提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與菌株

李氏增菌肉湯（LB1、LB2）購自 A、B、C、D四個公司；李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自A、B、C、D、G、F六個公司；PALCAM瓊脂培養(yǎng)基購自A、B、C、D、E、F六個公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自美國BD公司。

本研究采用菌株包括實驗室保存的30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌（見表1）。30株單增李斯特菌包括標準菌株ATCC19115（源自美國菌種保藏中心）和29株本實驗室從食品中分離的單增李斯特菌。

表1 9株非單增李斯特菌信息Table 1 Information of 9 non-Listeria monocytogenes

1.2 主要儀器

PL2002電子天平，梅特勒-托利多公司；MLS-3780高壓滅菌器，日本三洋公司；Thermo 1389生物安全柜，美國THERMO公司；PR 205050 GCN生化培養(yǎng)箱，美國THERMO公司；全自動微生物螺旋加樣系統(tǒng)，西班牙IUL公司；Viteck compact 2全自動微生物分析系統(tǒng)，法國梅里埃公司；BrukerAutoflexⅡ型基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS），德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株確認

使用全自動微生物分析系統(tǒng)和MALDI-TOF MS對30株單增李斯特菌進行確認。

1.3.2 李氏增菌肉湯比對

取30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌的TSA平板二代新鮮培養(yǎng)物，加入無菌生理鹽水中，制備 2.6～2.8麥氏濁度的菌懸液，用無菌生理鹽水梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用E50模式螺旋涂布至TSA平板上，平行涂布兩個平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進行計數(shù)。將LB1增菌肉湯1 mL分裝于24孔板中，取合適濃度的菌液10 μL分別加入不同廠家的LB1增菌肉湯中（接種水平為300～500 CFU/孔），30 ℃培養(yǎng)24 h。取培養(yǎng)后的LB1增菌肉湯梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用E50模式螺旋涂布至TSA平板上，平行涂布兩個平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進行計數(shù)。取10 μL LB1增菌肉湯接入1 mL LB2增菌肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h。取LB2增菌肉湯梯度稀釋到合適倍數(shù)，采用 E50模式螺旋涂布至 TSA平板上，平行涂布兩個平板，36 ℃培養(yǎng)24 h，進行計數(shù)。

1.3.3 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基比對

取30株單增李斯特菌和9株非單增李斯特菌的TSA平板二代新鮮培養(yǎng)物，加入無菌生理鹽水中，制備 2.6～2.8麥氏濁度的菌懸液，用無菌生理鹽水稀釋到合適稀釋度，采用E50模式螺旋涂布至PALCAM、單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基和參比TSA平板，平行涂布兩個平板，36 ℃培養(yǎng)48 h后進行計數(shù)，接種水平為20～200 CFU/板。

1.3.4 選擇性分離固體培養(yǎng)基的生長率計算

取出待測培養(yǎng)基及TSA參比培養(yǎng)基，選擇菌落數(shù)在20～200 CFU的平板按照以下公式計算生長率（PR值）：

式中：

PR——生長率；

NS——待測培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)；

N0——參比培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)。

1.3.5 李氏增菌肉湯及選擇性分離固體培養(yǎng)基的統(tǒng)計學分析

按照GB 4789.28-2013要求推算，LB1、LB2肉湯增菌后的濃度須大于104CFU/mL，使用增菌后濃度相較標準濃度（104CFU/mL）倍數(shù)的對數(shù)（以下簡稱濃度倍數(shù)對數(shù)）進行分析，即增菌后的計數(shù)結(jié)果除以104再取對數(shù)。對30株單核細胞增生李斯特菌在4個品牌的培養(yǎng)基得到的濃度倍數(shù)對數(shù)，使用雙因素方差分析（two-way ANOVA）分析培養(yǎng)基間差異，并使用配對t檢驗比較LB1與LB2兩種增菌肉湯中平均生長濃度的差異。

對30株單增李斯特菌在6個品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基上的生長率，使用雙因素方差分析（two-way ANOVA）分析培養(yǎng)基間差異，并使用配對t檢驗比較PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基上生長率的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 李氏增菌肉湯的增菌效果比較

表2 30株單增李斯特菌在4個品牌李氏增菌肉湯LB1和LB2中增菌后濃度分布情況Table 2 Concentration distribution of 30 strains of Listeria monocytogenes in four brands of Listeria enriched broth LB1 and LB2

表3 單增李斯特菌在4個品牌李氏增菌肉湯LB1和LB2增菌后濃度比較（CFU/mL）Table 3 Comparison of concentration of Listeria monocytogenes after enrichment of LB1 and LB2in four brands of Listeria enriched brot(CFU/mL)

表4 非單增李斯特菌在李氏增菌肉湯LB1和LB2中24h增菌效果比較（CFU/mL）Table 4 Comparison of 24 h increasing effect of non-monocytosteria in Listeria increasing broth LB1 and LB2 (CFU/mL)

單增李斯特菌ATCC19115在4個品牌LB1肉湯中的生長濃度均可達到1×107CFU/mL以上，而在LB2肉湯中的生長濃度均低于2×105CFU/mL。30株單增李斯特菌在4個品牌的LB1中的平均生長濃度極顯著性高于LB2中的平均生長濃度（tdf=119=10.03，p＜0.01）。LB1增菌肉湯和LB2增菌肉湯中加入了不同濃度的萘啶酮酸和吖啶黃作為抑菌劑，LB1增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度為 22.20 μg/mL，吖啶黃的濃度為 13.30 μg/mL；LB2增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度為20 μg/mL，吖啶黃的濃度為25 μg/mL[14]?？梢奓B2增菌肉湯中萘啶酮酸的濃度幾乎為 LB1增菌肉湯中的二倍，因此LB2抑菌性較LB1強，LB1增菌效果優(yōu)于LB2。

30株單增李斯特菌在4個品牌LB1（F3,87=2.92，p＜0.05）和LB2（F29,87=18.12，p＜0.01）肉湯中的平均生長濃度可見顯著性差異，其中B品牌的LB1增菌后濃度顯著高于其余3個品牌（p＜0.05）。LB1和LB2液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分一致，為胰胨、多價胨、酵母膏、磷酸鹽、氯化鈉、和七葉苷。其中磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等化學物質(zhì)較為穩(wěn)定，一般差異性不大，造成不同品牌LB1和LB2培養(yǎng)基質(zhì)量差異的原因，多為胰胨、多價胨、酵母膏等營養(yǎng)成分的質(zhì)量和配比差異。

6株單增李斯特菌在部分品牌的LB1和LB2肉湯的生長濃度低于 1×105CFU/mL，其中單增李斯特菌FC4278和FC11106在不同品牌肉湯中的生長狀況最差（表3），其余24株單增李斯特菌在4個品牌的LB1和LB2肉湯的生長濃度超過1×105CFU/mL。FC4278和FC11106單增李斯特菌在4個品牌的李氏增菌肉湯中增菌效果不佳，上述結(jié)果提示，李氏增菌肉湯中的營養(yǎng)成分不能滿足這2株單增李斯特菌的需求，且李氏增菌肉湯中的抑菌成分對這2株單增李斯特菌有一定的抑制作用。朱海華等[16]的研究中發(fā)現(xiàn)對單增李斯特菌的增菌效果更佳的增菌肉湯LB3。

大腸埃希氏ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212、金黃色葡萄菌 ATCC25923和表皮葡萄球菌CMCC26609在4個品牌的LB1和LB2肉湯中均未見顯著生長；糞腸球菌 MS2515、大腸埃希氏CICC29001、枯草芽孢桿菌CMCC63501和陰溝腸桿菌MS2323在部分品牌LB1或LB2肉湯中呈顯著生長；肺炎克雷伯菌ATCC700603在所有品牌LB1和LB2肉湯中均呈顯著生長（表4）。

2.2 不同品牌PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基比對結(jié)果

30株單增李斯特菌在6個品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率存在極顯著性差異（F5,145=13.16，p＜0.01）。包括ATCC19115在內(nèi)的13株單增李斯特菌在D品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上生長率低于0.5，其中1株菌在E品牌、4株菌在F品牌培養(yǎng)基上生長率低于0.5（表5），其余17株單增李斯特菌在所有品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率均超過0.5。30株單增李斯特菌在A、B和C品牌的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上的生長率均高于0.5。

30株單增李斯特菌在6個品牌顯色培養(yǎng)基上的生長率有著性差異（F5,145=2.32，p＜0.05）。30株單增李斯特菌在A、B、C、D、G品牌顯色培養(yǎng)基上的生長率均高于0.5，3株單增李斯特菌在F品牌培養(yǎng)基上的生長率低于0.5（表5）。

30株單增李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的生長率極顯著性高于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基上的生長率（使用A、B、C、D、F五品牌數(shù)據(jù)，tdf=149=3.74，p＜0.01）。本研究結(jié)果提示，顯色培養(yǎng)基對單增李斯特菌的檢測效果優(yōu)于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基。劉成文等、炊慧霞等[17,18]等也在研究中提到單增李斯特菌在顯色培養(yǎng)基上的檢出效率優(yōu)于 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基。李斯特菌在PALCAM瓊脂培養(yǎng)基上被區(qū)分出來是基于β-D-葡萄糖苷酶的活性。這種酶裂解培養(yǎng)基中的七葉甙產(chǎn)生灰綠色菌落，然后通過降解產(chǎn)物七葉苷與檸檬酸鐵銨中的鐵離子反應(yīng)，菌落周圍產(chǎn)生棕黑色暈圈（6,7-二羥基香豆素）。培養(yǎng)基中的氯化鋰和其它的抗生素能抑制革蘭氏陰性菌和大多數(shù)革蘭氏陽性菌生長。PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基不能將單增李斯特氏菌與其他李斯特氏菌區(qū)分開，因此需要進一步的鑒定分析來確定。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基中的色素與李斯特氏菌具有的酶發(fā)生特異性反應(yīng)，水解底物，釋放出顯色基團。在平板上，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)出藍色菌落，菌落周圍有一圈白色暈環(huán),抑制劑可抑制雜菌的生長。李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基能區(qū)分單增李斯特氏菌與絕大部分其他李斯特氏菌，但不能區(qū)分綿羊李斯特氏菌。然而綿羊李斯特氏菌在食品檢測中非常少見。

表5 單增李斯特菌在6個品牌PALCAM和顯色培養(yǎng)基上生長率比較結(jié)果Table 5 Comparison of growth rate of Listeria monocytogenes on 6 brands of PALCAM and chromogenic medium

表6 非單增李斯特菌在PALCAM和顯色培養(yǎng)基上的生長率Table 6 Growth rate of non-monoproliferative Listeria on PALCAM and chromogenic medium

9株非李斯特菌在品牌F的PALCAM瓊脂培養(yǎng)基和品牌 G的顯色培養(yǎng)基上均未見生長。大腸埃希菌ATCC25922和糞腸球菌MS2515在五個品牌的顯色培養(yǎng)基和 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基上均未見生長。金黃色葡萄菌 ATCC25923在 A、B、C、D四個品牌的PALCAM培養(yǎng)基上呈現(xiàn)不同程度的生長，但該菌在五個品牌顯色培養(yǎng)基上均未見生長。表皮葡萄球菌CMCC26609在三個品牌PALCAM培養(yǎng)基和四個品牌顯色培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)良好生長?？莶菅挎邨U菌CMCC63501和肺炎克雷伯菌ATCC700603僅在兩個品牌的顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)良好生長，而陰溝腸桿菌MS2323僅在品牌 C的顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)良好生長（表6）。

3 結(jié)論

3.1 GB 4789.28-2013中選擇了1株單增李斯特菌和2株非單增李斯特菌作為LB1、LB2增菌肉湯、PALCAM培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株。本研究選擇了 30株不同來源的單增李斯特菌作為目標菌和9株非目標菌。目標菌的來源更廣，更全面，非目標菌涵蓋了食品中常見的致病菌，更具代表性。此外，GB 4789.28-2013中對LB1、LB2增菌肉湯采用的是半定量計數(shù)法，PALCAM培養(yǎng)基和單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基采用的是定量計數(shù)法進行質(zhì)控。本研究采用了螺旋涂布計數(shù)法對市售的 4個品牌的李氏增菌肉湯、6個品牌的顯色培養(yǎng)基和 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基進行對比，此方法為定量計數(shù)法，較GB 4789.28-2013中半定量計數(shù)法更為準確。

3.2 本研究發(fā)現(xiàn)2株單增李斯特菌在4個品牌的李氏增菌肉湯中增菌效果均不佳，且LB1增菌肉湯中的平均生長濃度極顯著性高于LB2增菌肉湯。上述結(jié)果表明GB 4789.30-2016方法中使用LB1配合LB2肉湯進行增菌存在漏檢風險，且LB1增菌效果優(yōu)于LB2。建議修訂GB 4789.30-2016時，考慮使用LB1配合另一種對單增李斯特菌增菌效果更佳的肉湯，以提高單增李斯特氏菌的檢出率。

3.3 市售的4個品牌的李氏增菌肉湯的增菌效果、6個品牌的 PALCAM 瓊脂培養(yǎng)基和李斯特菌顯色培養(yǎng)基的檢測效果存在顯著差異，不同品牌培養(yǎng)基質(zhì)量差異大。鑒于以上研究分析，建議有關(guān)機構(gòu)研制參比培養(yǎng)基，為培養(yǎng)基的生產(chǎn)和使用提供更規(guī)范的質(zhì)量控制。本研究所獲實驗數(shù)據(jù)對培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家的質(zhì)量控制和產(chǎn)品質(zhì)量提升具有一定參考價值，并為 GB 4789.28-2013標準的制修訂提供了參考數(shù)據(jù)。