彭松林 王尚 王振民 龍燦玲 唐菀澤 賀小琴 陳高揚

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的復(fù)雜、多因素全身性慢性骨骼疾病，發(fā)病人群集中在絕經(jīng)后女性［1］。隨著老齡化現(xiàn)象的加劇，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病人數(shù)逐年增加，給病人帶來了全身骨痛、骨折、身高變矮等痛苦和傷害，同時也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟和生活負擔(dān)［2-3］。因為骨質(zhì)疏松發(fā)生和發(fā)展的隱匿性，往往是病人發(fā)生骨質(zhì)疏松骨折后入院治療才得以發(fā)現(xiàn)。因此，骨質(zhì)疏松的早期篩查和診斷是預(yù)防和治療的關(guān)鍵。骨質(zhì)疏松癥的病理過程受諸如局部和全身激素、遺傳調(diào)節(jié)劑和生活條件等復(fù)雜因素的影響［4］。近幾年來，作為疾病分子標(biāo)記物和潛在藥物靶點的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的相關(guān)研究迅速發(fā)展，已有研究表明lncRNA與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治有密切關(guān)聯(lián)，在免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病和腫瘤等疾病中發(fā)揮重要作用［5-7］。此外，已有研究報道指出lncRNA參與了成骨細胞的分化［8-10］，說明lncRNA在骨質(zhì)疏松癥中扮演著重要角色。本研究擬從lncRNA層面分析骨質(zhì)疏松和骨量正常絕經(jīng)后婦女外周血中l(wèi)ncRNA 的差異表達并檢測其在人骨髓間充質(zhì)干細胞（h-BMSCs）成骨分化過程中的含量變化，探討其作為診斷骨質(zhì)疏松分子標(biāo)志物的可行性。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為55～70 歲；②絕經(jīng)后女性；③無影響骨代謝藥物史；④無其他炎性疾病及外傷。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤；②原發(fā)性或繼發(fā)性甲狀旁腺疾?。虎鄹文I功能異常；④嚴(yán)重心臟疾?。虎萏悄虿?；⑥嚴(yán)重胃腸道疾病，如結(jié)直腸癌、炎癥性腸病、腸易激綜合征、長期腹瀉、便秘；⑦嚴(yán)重自免疫型疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡；⑧正在服用皮質(zhì)類固醇類激素或近3 個月曾服用此類激素；⑨近一個月服用抗生素。

二、研究對象

收集2019年全年在本院體檢女性的臨床資料，根據(jù)雙能X射線骨密度掃描結(jié)果，選取30例骨密度T值≥-1 SD婦女納入骨量正常組（30例），30例T值≤-2.5 SD 的婦女為骨質(zhì)疏松組，建立臨床樣品庫。經(jīng)病人知情同意后抽取部分外周血，分離其外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）并通過高通量測序檢測PBMC中l(wèi)ncRNA的表達。

三、試劑和設(shè)備

BD-10mL EDTA 真空管采血管（沈陽寶康生物工程有限公司，中國）；人外周血淋巴細胞分離液（深圳市達科為生物技術(shù)股份有限公司，中國）；RNA提取試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，中國）；lncRNA 文庫構(gòu)建和測序（深圳市華大基因，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，中國）；成骨誘導(dǎo)液（賽業(yè)生物科技有限公司，中國）；h-BMSCs 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；核酸檢測儀nanodrop2000［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，美國］；高速離心機［賽默飛世爾科技（中國）有限公司，美國］；qPCR 儀［伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，美國］。

四、研究方法

（一）外周血中l(wèi)ncRNA相對表達水平的檢測

取骨質(zhì)疏松組和骨量正常組外周血PBMC，嚴(yán)格按照RNA 提取試劑盒的說明書提取總RNA，nanodrop2000檢測RNA 濃度，瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性以及基因組污染情況。利用Qubit2.0 RNA檢測試劑盒對Total RNA精確定量，以確定文庫構(gòu)建所加入Total RNA 的量。根據(jù)VAHTS TM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina?試劑盒構(gòu)建lncRNA 文庫并擴增，上機高通量測序分析差異lncRNA。

（二）PCR 檢測外周血PBMC 中差異表達lncRNA的相對表達水平

取PBMC 細胞，使用Trizol 提取細胞總RNA，檢測其濃度與純度，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃30 min。然后根據(jù)實時熒光定量PCR 進行檢測，結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt相對定量法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

（三）h-BMSCs的培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)

h-BMSCs 購自于ATCC 細胞庫，使用的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含10%胎牛血清與抗生素（青霉素100 U/mL 和鏈霉素100 μg/mL），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。h-BMSCs細胞以5×104個/皿接種于六孔板，待細胞鋪滿板底約60%時（記為成骨誘導(dǎo)第0天），換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)開始后每2 d換液，分批次共誘導(dǎo)培養(yǎng)3、7、14 d。換液時棄原成骨誘導(dǎo)液，然后配置新鮮的成骨誘導(dǎo)液，以每孔2.5 mL加入六孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（四）茜素紅染色檢測成骨效果

將h-BMSCs接種在24孔板中，分為對照組和成骨誘導(dǎo)組。對照組常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)組換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)14 d 后，4%多聚甲醛固定，按照茜素紅染液說明書進行染色操作，檢測細胞成骨效果。

（五）qPCR 檢測誘導(dǎo)過程中成骨相關(guān)基因的表達

將成骨誘導(dǎo)分化過程中的h-BMSCs 細胞（0、3、7、14 d）加入RNA 提取試劑-Trizol。RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄方法同研究方法（二），檢測成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）mRNA 的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

（六）qPCR檢測差異表達的lncRNA在成骨分化過程中的表達量

提取0、3、7、14 d 的h-BMSCs 細胞的RNA 并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后把其作為模板通過qPCR 檢測差異lncRNA 的表達水平，內(nèi)參基因為GAPDH，上海生工生物工程股份有限公司協(xié)助完成引物設(shè)計和合成，序列見表1。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0（IBM 公司，美國）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血中l(wèi)ncRNA的差異表達情況

熱圖顯示，與骨量正常組相比，骨質(zhì)疏松組外周血PBMC 細胞中存在15 個差異表達的lncRNA（P＜0.05）（圖1），其中NONHSAT005760.2表達量明顯上調(diào)（P＜0.01）。

圖1 外周血中l(wèi)ncRNA的差異表達情況

二、外周血PBMC 中NONHSAT00-5760.2 的相對表達水平

qPCR檢測結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組病人外周血中NONHSAT005760.2 的表達量明顯上升（P＜0.05）（圖2）。

圖2 NONHSAT005760.2在臨床病人外周血中的表達

三、茜素紅染色結(jié)果和成骨相關(guān)基因表達

在h-BMSCs 成骨誘導(dǎo)14 d 過程中，成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、OCN、OPN 的表達均明顯上調(diào)（圖3），同時誘導(dǎo)14 d后茜素紅染色結(jié)果顯示鈣沉積明顯，基因和形態(tài)學(xué)結(jié)果均表明成骨誘導(dǎo)成功（圖4）。

圖3 成骨相關(guān)基因的表達（與0 d比較，*P＜0.05）

圖4 成骨誘導(dǎo)14 d后茜素紅染色結(jié)果 a：對照組，×40；b：成骨誘導(dǎo)組，×40；c：對照組，×100；d：成骨誘導(dǎo)組，×100

四、NONHSAT005760.2在h-BMSCs成骨分化過程中的表達

qPCR檢測結(jié)果顯示NONHSAT005760.2的表達在h-BMSCs 成骨分化過程中隨著時間延長而降低（圖5），表明NONHSAT005760.2 的表達與成骨呈負相關(guān)。

圖5 成骨分化過程中l(wèi)ncRNA NONHSAT005760.2的相對表達情況（與0 d比較，*P＜0.05）

討 論

隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，原本被認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”的lncRNA 逐漸被證實在多種不同的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。lncRNA 是一類長度超過200 個核苷酸，但不能翻譯成蛋白質(zhì)的RNA分子，其主要作用為信號分子，具有作為生物標(biāo)記物的潛能，且能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。lncRNAs 作為復(fù)雜有機體分子生物學(xué)的前沿研究領(lǐng)域，有其獨特的生物學(xué)特性及待開發(fā)潛力。lncRNAs 通常比mRNAs 的表達水平低，其表達具有細胞和組織特異性，可用于特定疾病的預(yù)測和診斷。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs幾乎參與調(diào)控基因表達的每一個階段［11-13］。

目前研究表明骨質(zhì)疏松癥與遺傳、雌激素、營養(yǎng)和生活方式密切相關(guān)，主要發(fā)病機制是雌激素缺乏導(dǎo)致破骨細胞增殖分化，破骨細胞功能活躍，同時抑制破骨細胞凋亡，從而使骨吸收速度超過骨形成速度，造成骨質(zhì)有機物和無機物成比例地減少［14］。另外，雌激素受體、維生素D 受體、Ⅰ型膠原和轉(zhuǎn)化因子-β等基因多態(tài)性也與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切［15］。

目前臨床上骨質(zhì)疏松癥病人以絕經(jīng)后女性居多，其發(fā)病隱匿，經(jīng)常是病人在骨折發(fā)生后做手術(shù)時才知道患有骨質(zhì)疏松，因此本研究旨在通過收集絕經(jīng)后女性外周血樣本進行高通量測序，從而尋找骨質(zhì)疏松相關(guān)的早期標(biāo)志物，以期為臨床骨質(zhì)疏松的早期診斷提供參考。關(guān)于非編碼RNA 近些年來才展開對其功能的研究［16］，其中l(wèi)ncRNA作為其主要成員之一［7］，在多種疾病中均被發(fā)現(xiàn)異常表達，但是其具體是通過何種機制如何發(fā)揮功能的，目前還處于一個相對空白的階段。lncRNA的異常表達，增多或者減少，均提示癌癥進展的一些階段，甚至可以預(yù)測早期癌癥治療的療效［17］。然而，當(dāng)前骨質(zhì)疏松癥lncRNA的研究主要采用了芯片技術(shù)以及qPCR方法，低通量和小樣本量進行局部研究。隨著二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA測序技術(shù)在該領(lǐng)域研究中將有很大的應(yīng)用前景和技術(shù)優(yōu)勢。在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域，目前有報道發(fā)現(xiàn)lncRNA 在骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)NONHSAT005760.2 在骨質(zhì)疏松絕經(jīng)后婦女外周血中明顯高表達，同時在h-BMSCs成骨分化過程中低表達，表明其與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。可作為預(yù)測骨質(zhì)疏松的指標(biāo)。提示lncRNA NONHSAT005760.2有希望成為絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松診斷的分子標(biāo)志物，為骨質(zhì)疏松的防治提供了新的思路。但lncRNA NONHSAT005760.2 與骨質(zhì)疏松癥的具體作用通路和下游具體分子機制尚不明確，NONHSAT005760.2 的下游通路和對成骨的具體作用機制是我們下一步研究的重要方向，亟待我們進一步探究。