肖 霄， 方志剛， 紀燕玲， 婁來清， 常 明， 蔡慶生*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院， 江蘇 南京 210095； 2. 喀什大學生命與地理科學學院， 新疆 喀什 844000)

人類的頻繁活動如化肥和農(nóng)藥的不合理施用、制造業(yè)及采礦業(yè)迅速發(fā)展，導致水體及土壤環(huán)境中的重金屬鎘(Cd)污染加劇。利用與修復Cd污染的邊際土地是環(huán)境科學、植物學及生態(tài)學等領(lǐng)域關(guān)注的熱點。近年來，許多研究表明，在重金屬污染土壤中開展能源植物的生長調(diào)控研究，可實現(xiàn)生物質(zhì)原料生產(chǎn)與污染土壤治理及開發(fā)的雙贏[1-3]。柳枝稷(Panicumvirgatum)是多年生C4植物，生物產(chǎn)量最高可達74 t·hm-2，能源轉(zhuǎn)化率高，且不進入食物鏈，被譽為最有發(fā)展?jié)摿Φ哪茉床輀4-6]。前期的研究表明，柳枝稷對Cd具有較強的富集能力，適合于在Cd污染土地中種植，是修復重金屬污染土地的良好材料[7]。

Cd在土壤或水體中極易被植物吸收，當介質(zhì)中的Cd達到一定濃度時，會干擾植物對礦質(zhì)元素的吸收，誘發(fā)氧化脅迫，直接或間接影響細胞內(nèi)各種生理代謝及脫落酸(ABA)、乙烯(ETH)等植物激素的合成和轉(zhuǎn)運[8]。其中，ABA由葉黃素合成，是一種倍半萜烯化合物[9]，它可以促進植物的衰老和脫落，還能夠通過全面調(diào)節(jié)細胞的生理代謝來影響植物的生長和發(fā)育。作為一種逆境激素，ABA參與包括重金屬脅迫在內(nèi)的多種非生物脅迫。外源ABA調(diào)控植物Cd耐性已有諸多報道，例如在水培液中，添加0.5 μmol·L-1ABA可通過提高小麥(Triticumaestivum)根系活力和葉片抗氧化酶活性，增強小麥對Cd的耐受性[10]。水培液中添加5 μmol·L-1ABA可抑制甘藍型油菜(Brassicanapus)地上部和根系中Cd的吸收，減小Cd對甘藍型油菜的毒害作用[11]。然而，關(guān)于外源ABA在柳枝稷響應Cd脅迫中的作用研究相對較少。

本研究以能源植物柳枝稷為試驗材料，在Cd脅迫下，通過外源ABA預處理，從植株根系形態(tài)、水分代謝及Cd吸收等角度，分析外源ABA對Cd脅迫下柳枝稷幼苗生長、根系活力、膜脂過氧化產(chǎn)物、脯氨酸及Cd積累等指標的影響，探尋ABA緩解柳枝稷Cd毒害可能產(chǎn)生的生理機制，為外源ABA促進柳枝稷在Cd污染環(huán)境中的生長及Cd吸收機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

柳枝稷種子來源于美國ERNST SEEDS公司，選擇低地型品種‘Alamo’和高地型品種‘Cave in Rock’為試材。種子用50%的硫酸浸泡30 min以破除種子休眠，去離子水洗凈表面硫酸后，用10%次氯酸鈉浸泡消毒10 min，然后用去離子洗凈，播于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于暗處，5～7 d后，種子萌發(fā)，移至光下培養(yǎng)一周，選擇長勢均勻的幼苗移入盛有1 L四分之一霍格蘭營養(yǎng)液的塑料盆中，適應生長一周后換為二分之一霍格蘭營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。植物材料培養(yǎng)期間，營養(yǎng)液每3 d更換一次，用NaOH或HCl溶液調(diào)整營養(yǎng)液的pH值為5.8，并調(diào)換盆砵位置以降低邊緣效應。種子萌發(fā)及幼苗培養(yǎng)期間的溫度為28℃～30℃，濕度50%～70%；幼苗培養(yǎng)的光照強度為50 μmol·m-2·s-1，光照/黑暗時間各為12 h。

1.2 試驗處理

柳枝稷幼苗培養(yǎng)30 d左右，幼苗長至5葉期時開始處理，試驗設(shè)4個處理組，分別為CK(對照，單獨霍格蘭營養(yǎng)液處理)、ABA，Cd及ABA+Cd。其中，ABA處理方式為：霍格蘭營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加1 μmol·L-1ABA預處理2 d后，換為霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)。Cd處理方式為：霍格蘭營養(yǎng)液基礎(chǔ)上添加20 μmol·L-1Cd2+(以CdCl2·2.5H2O形式添加)。ABA + Cd的處理方式：1 μmol·L-1ABA預處理2 d后換為含20 μmol·L-1Cd2+的霍格蘭營養(yǎng)液進行培養(yǎng)。每個處理3次重復，根據(jù)前期預試驗結(jié)果，共處理9 d，收獲植物材料。

1.3 指標測定方法

1.3.1生物量及Cd含量的測定 收獲后的柳枝稷幼苗浸泡于20 mmol·L-1EDTA-Na2溶液中20 min，以去除附著在根系表面的Cd2+，再用去離子水沖洗干凈，將地上部與根部分離后，于70℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，記錄干重(DW)。烘干后的樣品剪碎后，每份稱取0.2 g，置于消煮管內(nèi)，分別加入5 mL HNO3，使用高效微波消解系統(tǒng)消解45 min，冷卻后定容至50 mL。使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定Cd含量[12]。

1.3.2根系形態(tài)參數(shù)的測定 取柳枝稷幼苗根系，平鋪于透明塑料盒中，加入適量去離子水使根系漂浮，當根系分散無重疊時，用EPSON掃描儀將根系掃描生成電子圖片。根系形態(tài)參數(shù)如總根長(Total root length，RL)、根表面積(Root surface area，RA)、根體積(Root volume，RV)、根尖數(shù)(Number of root tips，RT)等指標用根系分析軟件[WinRHIZO software (V5.0，Regent Instruments，Quebec，Canada Inc.)]進行分析。

1.3.3葉片相對含水量的測定 取新鮮的柳枝稷幼苗葉片，記錄其鮮重(FW)，置于蒸餾水中浸泡4 h后，吸干葉片表面水分記錄飽和鮮重(TW)，后放入70℃烘箱，烘干至恒重后，記錄葉片干重(DW)。按照以下公式[13]計算出葉片相對含水量：

1.3.4根系活力、脯氨酸含量、丙二醛含量的測定 參考蔡慶生的方法[14]，根系活力用TT苯基氯化C(2，3，5-三四氮唑)法測定，根系和葉片的丙二醛用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸含量用磺基水楊酸提取，用5600PC型紫外可見分光光度計測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進行方差分析，采用Duncan’s多重比較，檢驗不同處理間差異顯著性(P< 0.05)。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷幼苗生物量的影響

不同處理條件下，柳枝稷幼苗生物量變化如圖1所示。與CK相比，Cd處理顯著降低了柳枝稷幼苗的干重(P< 0.05)，‘Alamo’地上部與根部干重分別降低62.2%和60.8%，‘Cave in Rock’地上部與根部干重則分別降低49.6%和68.5%，‘Alamo’和‘Cave in Rock’整株干重分別降低61.7%和57.1%。與單獨Cd處理相比，外源1 μmol·L-1ABA預處理后，2個品種地上部與根部干重均顯著增加(P<0.05)(圖1A～1B)。其中，‘Alamo’的地上部和根部干重分別增加39.0%和35.4%；‘Cave in Rock’則分別增加25.0%和40.7%。單獨ABA處理沒有顯著影響柳枝稷根系和地上部干重。

圖1 ABA對Cd脅迫下柳枝稷地上部(A)，根部(B) 和整株(C)干重的影響Fig.1 Effects of ABA on dry weight of shoot (A) and root (B) under Cd stress注：不同小寫字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between different treatment at the 0.05 level,the same as below

2.2 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷根系形態(tài)的影響

與CK相比，20 μmol·L-1Cd處理顯著抑制了柳枝稷的總根長(RL)，根表面積(RS)，根體積(RV)及根尖數(shù)(RT)(P<0.05)。上述指標中，‘Alamo’分別降低53.9%，38.2%，51.1%和81.8%，‘Cave in Rock’則分別降低44.8%，32.4%，69.5%和88.0%。1 μmol·L-1外源ABA預處理后，總根長，根表面積，根體積及根尖數(shù)與單獨Cd處理相比均顯著增加(圖2A～2D)。其中，‘Cave in Rock’的總根長及根表面積恢復至CK水平(圖2A～2B)。與Cd處理相比，‘Alamo’的根體積增加84.2%，根尖數(shù)增加282%；‘Cave in Rock’的根體積和根尖數(shù)分別增加134.4%和412.1%(圖2C～2D)。

圖2 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷根系形態(tài)的影響Fig.2 Effects of ABA on root morphology of switchgrass under Cd stress注：A,B,C,D分別代表總根長，根表面積，根體積和根尖數(shù)Note:A,B,C and D indicate root length,root surface area,root volume and number of root tips,respectively

2.3 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷根系活力和葉片含水量的影響

與CK相比，20 μmol·L-1Cd處理使柳枝稷幼苗根系活力和葉片相對含水量顯著降低(P<0.05)。其中，‘Alamo’和‘Cave in Rock’的根系活力分別降低55.0%和52.9%，葉片相對含水量分別降低2.7%和4.8%。1 μmol·L-1ABA預處理后，2個品種的根系活力和葉片相對含水量相比Cd處理顯著升高(圖3A～3B)(P<0.05)，‘Alamo’和‘Cave in Rock’的根系活力分別升高了45.4%和35.4%(圖3A)，葉片相對含水量分別升高了1.3%和1.1%(圖3B)。

圖3 ABA對Cd脅迫下柳枝稷根系活力和相對含水量的影響Fig.3 Effects of ABA on root activity and RWC of switchgrass under Cd stresses

2.4 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷體內(nèi)脯氨酸含量的影響

不同處理條件下，‘Alamo’體內(nèi)脯氨酸含量均高于‘Cave in Rock’。與CK相比，20 μmol·L-1Cd處理使2個品種柳枝稷的地上部和根部的脯氨酸含量顯著增加(P< 0.05)。1 μmol·L-1外源ABA預處理后，2個柳枝稷地上部和根部的脯氨酸含量與Cd處理相比均顯著增加(P< 0.05)。其中，‘Alamo’地上部和根部分別增加19.1%和11.2%；‘Cave in Rock’分別增加24.0%和23.5%。

圖4 ABA對Cd脅迫下柳枝稷不同組織中脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of ABA on the Pro concentration in different tissues of switchgrass under Cd stress注：A,B分別代表地上部和根部Note:A,B indicates root and shoot,respectively

2.5 外源ABA預處理對Cd脅迫下柳枝稷丙二醛(MDA)含量的影響

20 μmol·L-1Cd處理下，柳枝稷葉片和根系中MDA含量與CK相比均顯著增加(P<0.05)，其中，‘Alamo’地上部與根部MDA含量分別增加35.1%和75.8%，‘Cave in Rock’地上部與根部MDA含量分別增加44.0%和127.1%(圖5A～5B)。與單獨Cd處理相比，1 μmol·L-1外源ABA預處理使柳枝稷地上部和根系中MDA含量顯著降低，其中，‘Alamo’地上部與根部MDA含量分別降低15.4%和14.7%，‘Cave in Rock’地上部與根部MDA含量分別降低15.4%和12.5%。

圖5 ABA對Cd脅迫下柳枝稷不同組織中丙二醛含量的影響Fig.5 Effects of ABA on the MDA content in different tissues of switchgrass under Cd stress注：A,B分別代表地上部和根部Note:A,B indicates root and shoot,respectively

2.6 外源ABA對柳枝稷體內(nèi)Cd濃度、Cd轉(zhuǎn)運系數(shù)和Cd積累的影響

由于CK與單獨外源ABA預處理中檢測的Cd的濃度低于儀器的檢測限，故圖中未展示上述結(jié)果。用1 μmol·L-1外源ABA預處理，‘Alamo’地上部和根部的Cd濃度分別比20 μmol·L-1Cd處理增加15.3%和31.6%(P<0.05)；而‘Cave in Rock’地上部Cd濃度則降低21.7%(P<0.05)，其根部Cd濃度無顯著變化(圖6A-6B)。經(jīng)1 μmol·L-1外源ABA預處理后，Cd在‘Alamo’降中的轉(zhuǎn)運低12%，‘Cave in Rock’則降低了21%(P<0.05)(圖6C)；就Cd積累量而言，‘Alamo’地上部和根中的Cd積累量分別比Cd處理增加60.5%和78.9%，‘Cave in Rock’根中的Cd積累量增加37.7%；Alamo’與‘Cave in Rock’整株Cd積累量分別增加77.7%和41.0%(圖6D～6F)。

圖6 ABA對Cd脅迫下2個柳枝稷品種Cd吸收、轉(zhuǎn)運和積累的影響Fig.6 Effects of ABA on Cd concentration,translocation factors (TF)，Cd accumulation in two cultivars of switchgrass

3 討論

3.1 2個柳枝稷品種的耐Cd性及Cd積累差異

環(huán)境中的Cd達到一定濃度時，會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。根系是植物吸收水分和礦質(zhì)元素的主要器官，Cd2+與根系直接接觸，根系首先受到Cd脅迫毒害，根系形態(tài)如根長、根表面積及根尖數(shù)的變化，可反應植物對Cd耐性的強弱[15]。本研究中，20 μmol·L-1Cd處理對‘Alamo’總根長和根表面積的抑制作用明顯高于‘Cave in Rock’，這表明20 μmol·L-1Cd處理條件下，‘Cave in Rock’的耐受性強于‘Alamo’。另有研究表明，作物耐Cd性還與環(huán)境中的Cd濃度、作物品種、基因型及作物對Cd的吸收有關(guān)[16-19]。胡冰鈺開展了14個柳枝稷品種耐Cd性的研究，發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1Cd脅迫下，Alamo與‘Cave in Rock’的耐Cd能力相當[20]，其結(jié)果與本研究結(jié)果不同，這可能與本試驗較高的Cd的濃度及‘Alamo’具有高Cd吸收和積累特性有關(guān)。本試驗結(jié)果表明，20 μmol·L-1Cd處理條件下，無論是否使用外源ABA預處理，‘Alamo’地上部和根部的Cd濃度及Cd積累量均顯著高于‘Cave in Rock’。因而，推薦Cd積累量高的柳枝稷品種‘Alamo’，種植在Cd污染土壤中，有利于提高土壤修復效率。

3.2 外源ABA預處理對柳枝稷生理特性與Cd吸收的影響

當環(huán)境中的Cd過量時，植物體內(nèi)ABA合成會迅速增加，通過改變生理代謝，影響植物對Cd的吸收，該過程與ABA濃度、植物富集Cd的能力及耐Cd性等因素有關(guān)。已有研究表明，100 μmol·L-1Cd2+脅迫下，外源施加5 μmol·L-1ABA可通過降低不結(jié)球白菜(Brassicachinensis)的蒸騰速率，顯著降低其地上部分Cd濃度，但根部Cd濃度卻顯著升高[21]；用1～40 μmol·L-1ABA處理2種生態(tài)型的少花龍葵(Solanumphoteinocarpum)，可顯著促進少花龍葵對Cd的吸收和積累[22]；此外，土壤中20 mg·kg-1Cd脅迫下，噴施5～25 mg·L-1ABA促進了繁縷(Stellariamedia)生長，提高了Cd在其根系及地上部中的積累；當用50 mg·L-1ABA噴施繁縷，則降低其根系及地上部分中Cd的積累[23]。也有研究指出，外源添加0.2 mg·L-1的ABA可促進東南景天(SedumalfrediiHance)根系對Cd的吸收，其原因主要涉及Cd轉(zhuǎn)運基因HsfA4、氧化應激基因的表達[24]。上述研究結(jié)果表明，外源ABA可調(diào)節(jié)植物對Cd的吸收，但所涉及的信號通路及激素代謝機制仍不明確。本研究結(jié)果顯示，柳枝稷幼苗根部用1 μmol·L-1外源ABA預處理后，顯著緩解20 μmol·L-1Cd處理對柳枝稷根系生長的抑制作用，同時顯著提高其根系活力及葉片相對含水量，說明低濃度的ABA處理可促進Cd脅迫下根系的發(fā)育，而發(fā)達根系有利于柳枝稷根系對水分和Cd的吸收。此外，1 μmol·L-1ABA預處理還使柳枝稷根部和葉片中MDA含量下降，且‘Alamo’根和葉片中的MDA含量顯著低于‘Cave in Rock’，說明‘Alamo’根系和葉片細胞質(zhì)膜損傷程度低于‘Cave in Rock’，這也有利于‘Alamo’根系吸收的Cd2+沉淀在其細胞壁或轉(zhuǎn)運至液泡中，從而減少Cd對根部細胞器的損傷。

3.3 外源ABA預處理緩解Cd對柳枝稷的毒害作用

Cd脅迫下，植物干物質(zhì)量通常被用來評估植物受毒害的程度。植物葉片利用太陽光能制造干物質(zhì)，而干物質(zhì)的積累與分配也是衡量植株生長狀況的指標。研究表明，外源ABA可通過增加Cd脅迫下小麥(Triticumaestivum)葉片中葉綠素含量，提高小麥光合速率，以便制造更多的同化物，從而促進小麥生長[24]。在本研究中，1 μmol·L-1ABA預處理，通過促進Cd脅迫下柳枝稷總根長，根表面積和根尖數(shù)，進而增大根系與營養(yǎng)液中離子接觸的機會，最終提高柳枝稷幼苗的干重，這與外源ABA促進Cd脅迫下繁縷生長的結(jié)果相似[23]。脯氨酸是細胞內(nèi)的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，用于提高細胞液的濃度，降低細胞水勢，促進細胞吸水，從而維持細胞的膨壓。本研究表明，用1 μmol·L-1ABA預處理能顯著促進20 μmol·L-1Cd處理下柳枝稷葉片中脯氨酸的積累，通過滲透調(diào)節(jié)使葉片葉肉細胞吸收水分，從而維持柳枝稷葉片水分平衡。另有研究發(fā)現(xiàn)，用1×10-5mg·L-1～1×10-3mg·L-1的ABA噴施水培液中Cd處理青萍(Lemnaminor)幼苗，能夠提高其葉片中脯氨酸的含量，同時顯著降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累[26]，說明微量的ABA處理能夠維持植物水分代謝，減少氧化脅迫，這與本研究部分結(jié)果類似。在本研究中，1 μmol·L-1ABA預處理減少了MDA的積累，有利于減輕Cd對柳枝稷根系細胞質(zhì)膜的氧化傷害，部分地緩解了Cd對柳枝稷的毒害作用。

4 結(jié)論

20 μmol·L-1Cd脅迫可顯著抑制兩個柳枝稷品種幼苗生長，‘Cave in Rock’的耐Cd性強于‘Alamo’。用1 μmol·L-1ABA預處理柳枝稷幼苗，可顯著促進20 μmol L-1Cd處理下植株根系形態(tài)發(fā)育，提高Cd脅迫下柳枝稷的根系活力，降低膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的含量，通過積累脯氨酸，維持植株的水分平衡，從而促進Cd脅迫下柳枝稷的生長，緩解Cd對柳枝稷的毒害作用。此外，1 μmol·L-1ABA預處理，顯著促進‘Alamo’對Cd的吸收，降低Cd向地上部的轉(zhuǎn)運。