張靖雪， 盛 偉， 李欣勇， 羅麗娟*

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院， 海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 儋州 571737)

落粒性是植物在長期的演化過程中，為繁衍后代，抵御外界惡劣環(huán)境所形成的一種適應(yīng)性機(jī)制，這一現(xiàn)象在豆科和禾本科植物中廣泛存在[1-2]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于牧草種子成熟時(shí)在母體上的持留性較差，會(huì)脫離母體而掉落，這一特性使種子產(chǎn)量損失嚴(yán)重，不利于品種的推廣種植同時(shí)也增加了種子采收難度。研究顯示，由于種子成熟的不一致性和差異性，種子實(shí)際產(chǎn)量為潛在產(chǎn)量的10%～20%[3]。落粒性的喪失是作物馴化過程中的關(guān)鍵一步[4]，低落粒種質(zhì)的篩選應(yīng)作為牧草選育尤其是落粒嚴(yán)重品種育種的重要目標(biāo)之一。

柱花草(Stylosanthesguianensis)原產(chǎn)于美洲，具有莖葉產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗旱能力強(qiáng)、耐貧瘠、適口性好等特點(diǎn)，主要用于天然草地改良、綠肥覆蓋、水土保持及飼料作物等[5-8]。目前，柱花草已經(jīng)在我國的廣東、廣西、海南、云南、四川攀枝花等干熱河谷地區(qū)推廣種植[9-12]，已成為我國南方熱帶草業(yè)的當(dāng)家草種，初步形成了“北有苜蓿草(Medicagosativa),南有柱花草”的草業(yè)發(fā)展新格局[13-14]。然而柱花草種子普遍存在落粒率高，種子成熟后若不及時(shí)收獲，落粒率可達(dá)60% 以上，這給后期管理、打草收種、機(jī)械操作帶來諸多困難，造成種子產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。長期以來，柱花草的育種目標(biāo)都集中在產(chǎn)量[15-16]、品質(zhì)[17]、抗性[18]等方面，對于柱花草種子落粒性的研究未見報(bào)道。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)保存有26個(gè)種共498份柱花草種質(zhì)[19-20]，豐富的柱花草資源為種質(zhì)創(chuàng)新、新品種選育提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究選取來自不同地區(qū)的68份柱花草種質(zhì)為材料，對花后不同時(shí)期的農(nóng)藝性狀及落粒率進(jìn)行田間觀測，并對其進(jìn)行綜合評價(jià)，從而加速柱花草抗落粒品種的選育和推廣。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草研究室試驗(yàn)基地(19°30′N，109°30′E)，海拔149 m，屬熱帶季風(fēng)氣候，年降水量1 437.0～3 022.7 mm，其中雨季(5—10月份)降水量最為豐富，全年無霜，年均溫度為24.7℃,土壤為花崗巖發(fā)育的磚紅土壤[21]。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的68份柱花草種質(zhì)均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供(表1)。2019年2月份將試驗(yàn)材料放置于光照培養(yǎng)箱發(fā)芽，幼苗長出3片葉時(shí)移栽到田間試驗(yàn)地，進(jìn)行常規(guī)田間管理。

表1 供試68份柱花草種質(zhì)Table 1 68 Stylosanthes germplasms used in this study

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及指標(biāo)測定

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份種質(zhì)種植3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積3 m2(1 m×3 m)，株距為0.5 m，行距為0.5 m，重復(fù)3次。2020年在柱花草種子成熟時(shí)，每個(gè)小區(qū)取10株單株，測其葉柄長、小葉長、小葉寬、莖粗、株高、主枝條數(shù)、側(cè)枝條數(shù)、千粒重和落粒率共9項(xiàng)農(nóng)藝性狀。葉柄長為葉片基部與主莖連接處之間的距離；小葉長為葉片基部至葉片尖端的距離；小葉寬為葉片最大直徑；莖粗即為植株主莖距地面5 cm處的最大直徑；株高即地面至植株頂端的距離，以上性狀均需使用游標(biāo)卡尺測定。主枝條數(shù)為植株中心主干上分生出的大枝條數(shù)，側(cè)枝條數(shù)則為主枝條上分生出的小枝數(shù)。各性狀測定時(shí)每株隨機(jī)選取5個(gè)分枝進(jìn)行測量，測量后取平均值。千粒重測定采用百粒法，即純凈種子中隨機(jī)取100粒種子，重復(fù)8次，由此計(jì)算千粒種子重量。落粒率的測定采用套袋法，待68份柱花草種質(zhì)授粉后，每份種質(zhì)隨機(jī)選取5個(gè)單株，每個(gè)單株隨機(jī)選取5個(gè)生殖枝進(jìn)行套袋，從授粉后開始每隔7 d測定一次掉落袋中的種子數(shù)，直至完熟期。測定結(jié)束后，總落粒數(shù)與測定花序上剩余粒數(shù)之和為所測花序子粒總數(shù)，總落粒數(shù)與總子粒數(shù)的百分比值即為落粒率。落粒率計(jì)算公式如下：

落粒率(%)=(種子落粒數(shù)/花序子?？倲?shù))×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

對觀測得到的各平均值采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理，然后使用SPSS 20.0分析軟件對各觀測數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分、相關(guān)性和聚類分析，從而更直觀的展現(xiàn)柱花草的落粒動(dòng)態(tài)及其農(nóng)藝性狀。根據(jù)特征值大于1的標(biāo)準(zhǔn)，對柱花草進(jìn)行主成分分析，柱花草農(nóng)藝性狀的大部分信息可以由主成分概括[22]。最后利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行農(nóng)藝性狀綜合評價(jià)，各指標(biāo)隸屬函數(shù)值大小可以反映各性狀品質(zhì)優(yōu)劣，根據(jù)各指標(biāo)隸屬函數(shù)平均值大小對供試材料的性狀優(yōu)劣進(jìn)行綜合評價(jià)，為篩選柱花草優(yōu)質(zhì)育種材料提供科學(xué)依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草重要農(nóng)藝性狀變異分析

由圖1可知，68份種質(zhì)落粒率變化范圍為27%～99%，落粒率在50%以下的種質(zhì)僅有7份。由表2可知，9個(gè)農(nóng)藝性狀中，主枝條數(shù)的變異系數(shù)最高，為67.2%，其次為莖粗和株高，分別為48.6%，40.1%，說明柱花草的主枝條數(shù)、莖粗、株高存在較大的遺傳變異。葉柄長、小葉長、小葉寬、側(cè)枝條數(shù)、千粒重和落粒率的變異系數(shù)均達(dá)到20.0%以上，表明這幾種農(nóng)藝性狀也存在較為豐富的遺傳變異，同時(shí)也說明落?，F(xiàn)象在柱花草各種質(zhì)間普遍存在。

圖1 68份供試柱花草種質(zhì)落粒率Fig.1 The average seed shattering rate of 68 Stylosanthes

表2 柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀的變異分析Table 2 The variation analysis of 9 morphological traits of Stylosanthes

2.2 柱花草重要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析

對柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明(表3)，小葉長與葉柄長呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.550；小葉寬與葉柄長、小葉長呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.539，0.516；株高與葉柄長、小葉長、小葉寬呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.424，0.519，0.422；莖粗與小葉長呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為-0.337；千粒重與莖粗呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.255；千粒重與落粒率呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為-0.260；落粒率與小葉長呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.401；落粒率與莖粗呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為-0.654，這表明柱花草低落粒種質(zhì)通常表現(xiàn)為莖粗較粗，小葉較短的特征，并且具有較大的千粒重，因此，可以為低落粒柱花草種質(zhì)的田間篩選提供參考。

表3 柱花草農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis on the agronomic traits of Stylosanthes

2.3 柱花草農(nóng)藝性狀的聚類分析

對供試柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行聚類分析(圖2)，結(jié)果表明68份材料被聚為5大類群。第Ⅰ類包括44份材料，這類材料主枝條數(shù)較少，株高較高，葉柄和小葉較長，莖粗表現(xiàn)為中間水平。第Ⅱ類材料包含4份材料，這類材料株高較高，主枝條數(shù)少，葉部性狀表現(xiàn)中間水平。第Ⅲ類包含9份材料，這類材料各類性狀總體表現(xiàn)為中間水平。第Ⅳ類包括8份材料，這類材料主要表現(xiàn)為株高較矮，莖粗較小，葉片較小，落粒率較高。第Ⅴ類包含3份材料，這類材料株高最矮，主枝條數(shù)最多，小葉較長且落粒率很高。

圖2 基于柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀的聚類圖Fig.2 The cluster of Stylosanthes based on 9 agronomic traits

以落粒率為變量對柱花草種質(zhì)進(jìn)行聚類分析(圖3)，68份種質(zhì)被分為2大類，4亞類。第Ⅰ亞類包含39份材料，這些材料的落粒率在85%～99%之間，落粒率最高；第Ⅱ亞類包括17份材料，落粒率在65%～85%之間；第Ⅲ亞類包括TF0027，TF0074，TF0110三份材料，落粒率在27%～37%之間，這類材料落粒率最低；第Ⅳ亞類包含9份材料，落粒率均在43%～57%之間。

圖3 以柱花草落粒率為變量的聚類圖Fig.3 The cluster of Stylosanthes based on seed shattering rate

2.4 柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀的主成分分析

對供試柱花草的9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析(表4、表5)，結(jié)果表明，影響柱花草農(nóng)藝性狀的前3個(gè)主成分的累加貢獻(xiàn)率達(dá)65.178%，特征值總和為5.866，表明這3個(gè)主成分完全可以表現(xiàn)出柱花草9項(xiàng)指標(biāo)所代表的大部分信息。第1主成分的特征值是2.619，貢獻(xiàn)率為29.101%。第1主成分主要受小葉長(0.889)的影響，其次是葉柄長(0.733)、小葉寬(0.710)，說明第1主成分主要反映柱花草的葉片性狀特征。第2主成分的特征值是1.937，貢獻(xiàn)率為21.521%，第2主成分主要受莖粗(0.750)的影響，表明第2主成分主要反映柱花草莖部特征。第3主成分的特征值是1.310，貢獻(xiàn)率為14.556%，第3主成分受主枝條數(shù)(0.805)的影響最大，側(cè)枝條數(shù)(負(fù)值)次之，說明第3主成分主要反映柱花草莖部分蘗特征。

表4 供試材料9個(gè)農(nóng)藝性狀的主成分分析Table 4 Principal component analysis at 9 agronomic traits of Stylosanthes

表5 關(guān)于9個(gè)性狀的前3個(gè)主成分對應(yīng)的特征向量Table 5 Eigen vector of the first three Principal Component of 9 agronomic traits

2.5 柱花草農(nóng)藝性狀綜合評價(jià)

對柱花草的9個(gè)農(nóng)藝性狀求其隸屬函數(shù)值(表6)，隸屬函數(shù)值的大小能夠反映種質(zhì)性狀的優(yōu)劣，隸屬函數(shù)值越接近于1，則說明該性狀表現(xiàn)越優(yōu)異；反之，隸屬函數(shù)值越接近于0，則該性狀表現(xiàn)越差。然后求各材料性狀隸屬函數(shù)值的平均值，平均值大小越接近1的，則表示該材料綜合性狀表現(xiàn)越優(yōu)異；平均值越接近0的，那么該材料綜合性狀的表現(xiàn)越差。通過計(jì)算柱花草9個(gè)農(nóng)藝性狀的隸屬函數(shù)值可知，供試柱花草種質(zhì)的隸屬函數(shù)均值在0.234～0.627之間，其中均值大于等于0.550的有TF0115，TF0177，TF0207，TF0275四份材料，主要表現(xiàn)為葉柄長和小葉寬大，植株高大。其次為TF0041，TF0042，TF0209，TF0228，TF0244，TF260，TF0285和TF0321綜合性狀表現(xiàn)較好，隸屬函數(shù)平均值分別為0.541，0.547，0.549，0.539，0.527，0.535，0.506和0.504；隸屬函數(shù)值小于0.255的有3份。分別為TF0035，TF0074和TF0191，主要表現(xiàn)為葉柄短，小葉較小，植株矮小。

表6 供試68份柱花草各農(nóng)藝性狀隸屬函數(shù)分析Table 6 The subordinate function analysis of agronomic traits of 68 Stylosanthes

續(xù)表6

3 討論

3.1 柱花草落粒性

柱花草是熱帶地區(qū)的重要豆科牧草，種子成熟期一般為12月至翌年1月，但柱花草種子成熟期不一致并且邊成熟邊脫落，給種子生產(chǎn)和收獲造成了嚴(yán)重影響[23]。本研究對68份柱花草材料田間落粒率測定，結(jié)果表明柱花草種子落粒性強(qiáng)這一特性普遍存在于柱花草各種質(zhì)間，落粒率高于50%的種質(zhì)占供試種質(zhì)總數(shù)的85%以上，種質(zhì)TF0255落粒率最高；TF0027，TF0074及TF0110三份材料的落粒率較低，表明其抗落粒性較強(qiáng)。對68份供試柱花草落粒率進(jìn)行聚類分析后發(fā)現(xiàn)，第Ⅲ亞類材料表現(xiàn)出低的落粒率。低落粒的種質(zhì)是研究抗落粒柱花草新品種的基礎(chǔ)，落粒性不同的種質(zhì)可以為今后開展柱花草遺傳變異和分子機(jī)制的研究提供重要的試驗(yàn)材料。同時(shí)，也可以選用低落粒品種作為親本，選配雜交組合材料來改良現(xiàn)有的品種。

3.2 柱花草農(nóng)藝性狀相關(guān)性

各農(nóng)藝性狀所代表的信息有一定程度的重復(fù)性，單個(gè)性狀指標(biāo)的作用不完全相同，因此，主成分分析通過降維的方式將各指標(biāo)之間復(fù)雜的相關(guān)關(guān)系轉(zhuǎn)換成少數(shù)的幾個(gè)相互獨(dú)立的主成分進(jìn)行分析，每個(gè)主成分都能最大限度地反映原始變量的信息[24-26]，并進(jìn)行科學(xué)合理的評價(jià)。主成分分析中提取出的3個(gè)主成分因子客觀的反映了柱花草資源的特征。對9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行變異分析發(fā)現(xiàn)，主枝條數(shù)變異系數(shù)最大，表明其多樣性最豐富，其次為莖粗和株高多樣性較豐富。各農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析表明，柱花草落粒率與小葉長呈極顯著正相關(guān)，與莖粗呈極顯著負(fù)相關(guān)，與千粒重呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為小葉較短，莖粗較大的種質(zhì)，其落粒率較低，千粒重也較大，從而種子產(chǎn)量也會(huì)相應(yīng)增加。這與前人[27]的研究結(jié)果相似。通過對68份材料的9個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行聚類分析，種質(zhì)被分為3大類，5個(gè)亞類，發(fā)現(xiàn)性狀表現(xiàn)相似的大部分被聚為同一類群，但其中也有少部分性狀表現(xiàn)差異較大的也被分在同一類群，這可能是因田間試驗(yàn)過程中氣候環(huán)境條件以及人為因素的影響而使農(nóng)藝性狀聚類分析的結(jié)果不穩(wěn)定[28-29]。聚類分析是根據(jù)遺傳距離來進(jìn)行分類，而遺傳距離的計(jì)算又是根據(jù)各性狀的表現(xiàn)型，表現(xiàn)型又受到基因型和環(huán)境的共同影響[30-31]。因此，合理的設(shè)計(jì)試驗(yàn)，嚴(yán)格統(tǒng)一的環(huán)境控制及田間操作管理可以保證聚類分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，也可以通過農(nóng)藝性狀分析與分子標(biāo)記方法分類結(jié)果相結(jié)合，從而能夠更有效地對柱花草種質(zhì)資源進(jìn)行科學(xué)全面的篩選評價(jià)[32]。

4 結(jié)論

本研究明確了柱花草種子落粒性、主要農(nóng)藝性狀的遺傳多樣性及各農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性，篩選出了TF0115，TF0177，TF0207，TF0275綜合性狀表現(xiàn)優(yōu)良的柱花草種質(zhì)。本研究結(jié)果為柱花草低落粒種質(zhì)的篩選、遺傳改良以及品種選育提供了重要的參考。