錢文武， 黃志超， 朱慧森， 夏方山， 秦曉芳， 董寬虎

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

草地早熟禾是世界上應(yīng)用最廣泛的冷季型草坪草之一，在我國主要分布在西北、華北、華中和西南等大部分地區(qū)，具有整齊均一、色澤優(yōu)美、綠期長、耐踐踏、再生力強(qiáng)等特點(diǎn)，常運(yùn)用于商品化生產(chǎn)草皮，有極高的觀賞價(jià)值和實(shí)用價(jià)值[16]。而草地早熟禾種子在其老化的過程中會出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化作用，該作用下產(chǎn)生的自由基會破壞細(xì)胞膜系統(tǒng)，從而導(dǎo)致種子活力下降，影響幼苗生長[17]，而引發(fā)處理能夠通過滲透調(diào)節(jié)提高種子萌發(fā)的速度和整齊度，提高苗的抗性和素質(zhì)、改善營養(yǎng)狀況。因此，需要探索合理的引發(fā)處理來解決種子老化問題。本試驗(yàn)選用KNO3和抗壞血酸作為引發(fā)劑，設(shè)置不同濃度和引發(fā)時(shí)間對自然老化的草地早熟禾種子進(jìn)行處理，以期為緩解草地早熟禾老化種子篩選最優(yōu)引發(fā)劑和引發(fā)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草地早熟禾‘午夜’種子于2015年從北京正道公司購進(jìn)，在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院種質(zhì)資源庫中保存，種子相對含水量為5.64%。試驗(yàn)于2020年進(jìn)行，‘午夜’種子引發(fā)回干8 h后含水量為25.26%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用KNO3、抗壞血酸和蒸餾水作為引發(fā)劑。KNO3濃度設(shè)為0%，1.0%，2.0%和4.0%，抗壞血酸濃度設(shè)為0，0.5，1.0和1.5 mmol·L-1；采用二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，以不進(jìn)行引發(fā)處理的干種子為對照。對種子進(jìn)行除雜篩選后，稱取2 g種子放入50 mL小燒杯中，分別添加6 mL的引發(fā)劑，封口后放在培養(yǎng)箱內(nèi)引發(fā)1 d和2 d。引發(fā)結(jié)束后用紗布將種子濾出，蒸餾水沖洗，置于雙層濾紙的無蓋培養(yǎng)皿中回干1 d。將預(yù)先數(shù)好的100粒種子放置在鋪好濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)箱條件設(shè)為：光照時(shí)間14 h·d-1、溫度25℃，黑暗時(shí)間10 h·d-1、溫度15℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，相對濕度70%。

1.3 測定指標(biāo)及方法

根據(jù)草種子檢驗(yàn)規(guī)程—發(fā)芽試驗(yàn)[18]，每天記錄發(fā)芽情況，直到第15 d試驗(yàn)結(jié)束。在第15 d時(shí)取10株幼苗，用游標(biāo)卡尺(精度為0.01 cm)測量根長和芽長，電子天平(精度為0.000 1 g)稱量苗鮮重。

計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率=N15/M×100%

活力指數(shù)=∑Gt/Dt×(∑l1/10+∑l2/10)

平均發(fā)芽天數(shù)=∑Gt×Dt/∑Gt

芽長=∑l1/10

芽鮮重=m1/10

根長=∑l2/10

苗鮮重=m2/10

式中，N15為處理發(fā)芽前15 d的正常幼苗總數(shù)，M為種子總數(shù)(100)；Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)(以胚根長為種子的1/2為標(biāo)準(zhǔn)判定發(fā)芽)，Dt為種子發(fā)芽t天；m1為總芽重，m2為總根重，l1為總芽長，l2為總根長。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，Graphpad prism作圖。應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值法，對各處理后種子萌發(fā)和幼苗生長的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。公式如下：

指標(biāo)性狀與引發(fā)處理效果正相關(guān)，公式為U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

指標(biāo)性狀與引發(fā)處理效果負(fù)相關(guān)，公式為U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，U(Xi)是隸屬函數(shù)值；Xi是某處理水平某指標(biāo)測定值；Xmax和Xmin為所有參試水平系中某指標(biāo)中最大值和最小值。最后將每個(gè)處理各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加，求出平均值后進(jìn)行排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)和活力指數(shù)的影響

由表1可知，除1.0% KNO3引發(fā)1 d，2.0% KNO3引發(fā)1 d和H2O引發(fā)2 d處理后的發(fā)芽率與對照(引發(fā)0 d)差異不顯著外，其他各處理的發(fā)芽率均顯著高于對照(P<0.05)，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d處理后的發(fā)芽率在各處理中最高，比對照顯著提高37.36%(P<0.05)。KNO3和抗壞血酸引發(fā)處理可有效縮短‘午夜’老化種子的平均發(fā)芽天數(shù)，且在引發(fā)2 d時(shí)的平均發(fā)芽天數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)?；盍χ笖?shù)在各處理下，除H2O引發(fā)2 d略低于對照以外，其他均顯著高于對照(P<0.05)。隨著KNO3濃度的提高，種子的發(fā)芽率在引發(fā)1 d時(shí)呈先降后升趨勢，而在引發(fā)2 d時(shí)呈先升后降趨勢且在濃度為2.0%時(shí)達(dá)到各KNO3處理中的最大值，比對照提高32.30%，種子的平均發(fā)芽天數(shù)在引發(fā)2 d時(shí)呈先升后降的趨勢且均低于各梯度抗壞血酸處理后的平均發(fā)芽天數(shù)，其中4.0% KNO3處理后的平均發(fā)芽天數(shù)在各處理中最低，比對照顯著縮短2.01 d(P<0.05)；隨著抗壞血酸濃度的提高，發(fā)芽率隨著時(shí)間的延長呈升高趨勢，但在1.5 mmol·L-1時(shí)呈先升后降趨勢，而種子的平均發(fā)芽天數(shù)在引發(fā)1 d時(shí)呈先升后降趨勢，在引發(fā)2 d時(shí)呈升高趨勢，其中0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d處理后的種子平均發(fā)芽天數(shù)比對照顯著降低15.09%(P<0.05)。引發(fā)1 d時(shí)，各引發(fā)處理后的活力指數(shù)差異均不顯著，引發(fā)2 d時(shí)，1.0%～4.0% KNO3處理后的活力指數(shù)比其在引發(fā)1 d時(shí)均有所提高且高于0.5～1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理活力指數(shù)，但各處理間差異不顯著，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d處理后的活力指數(shù)比對照提高65.43%，在各處理中達(dá)到最高。

表1 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)和活力指數(shù)的影響Table 1 Influence of different priming treatments on germination percentage,mean germination time,and vigor index of aged seeds of ‘Midnight’

雙因素方差分析表明(表2)，不同引發(fā)時(shí)間處理下的發(fā)芽率差異相關(guān)(P<0.05)，平均發(fā)芽天數(shù)和活力指數(shù)差異均極顯著相關(guān)(P<0.01)；不同引發(fā)劑處理下的平均發(fā)芽天數(shù)差異極顯著相關(guān)(P<0.01)，發(fā)芽率和活力指數(shù)差異均不顯著。二者交互作用下的發(fā)芽率差異顯著相關(guān)(P<0.05)，平均發(fā)芽天數(shù)差異極顯著相關(guān)(P<0.01)，活力指數(shù)差異不顯著。

表2 時(shí)間和引發(fā)劑對發(fā)芽率、平均發(fā)芽天數(shù)和活力指數(shù)影響的雙因素方差分析Table 2 Variance analysis of time and initiator on germination percentage,mean germination time,and vigor index

2.2 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子芽長和根長的影響

由圖1和圖2可知，除0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d和1.0 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d處理的芽長顯著低于對照(引發(fā)0 d)外(P<0.05)，其他處理相較于對照差異均不顯著，而根長在各引發(fā)處理中，除1.0 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d與對照差異不顯著外，其他處理相較于對照均顯著提高(P<0.05)。隨著KNO3濃度的增加，芽長在引發(fā)1 d時(shí)呈現(xiàn)先升后降的趨勢，引發(fā)2 d時(shí)呈現(xiàn)先降后升的趨勢，根長整體呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢；隨著抗壞血酸濃度的增加，芽長和根長均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。其中，1.0% KNO3引發(fā)1 d處理的種子芽長在所有處理中均最低，而根長比對照顯著增加61.16%。

圖1 不同引發(fā)處理對‘午夜’草地早熟禾老化種子芽長的影響Fig.1 Influence of different priming treatments on shoot length of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass注：不同小寫字母表示同一時(shí)間在不同引發(fā)處理下對應(yīng)各指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同種引發(fā)處理下不同時(shí)間對應(yīng)各指標(biāo)差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Different lowercase letters indicate the same time of different initiators are significantly different at the 0.05 level. Different capital letters mean the different time of the same initiators are significant different at the 0.05 level,the same as below

圖2 不同引發(fā)處理對‘午夜’草地早熟禾老化種子根長的影響Fig.2 Influence of different priming treatments on root length of aged seeds of ‘Midnight’

雙因素方差分析表明(表3)，不同引發(fā)時(shí)間處理下的芽長相關(guān)性不顯著，根長極顯著相關(guān)(P<0.01)；不同引發(fā)劑處理下的芽長和根長均顯著相關(guān)(P<0.05)。二者交互作用下的芽長相關(guān)性不顯著，根長顯著相關(guān)(P<0.05)。

表3 時(shí)間和引發(fā)劑對芽長和根長影響的雙因素方差分析Table 3 Variance analysis of time and initiator on shoot length and root length

2.3 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子芽鮮重和根鮮重的影響

由圖3和圖4可知，除H2O引發(fā)2 d處理后的芽鮮重顯著高于對照(引發(fā)0 d)外，其他各處理的芽鮮重較對照差異均不顯著，而在各引發(fā)處理中，除1.0% KNO3引發(fā)1 d，1.0% KNO3引發(fā)2 d和4.0% KNO3引發(fā)2 d處理的根鮮重較對照差異不顯著外，其他均顯著高于對照(P<0.05)。隨著KNO3濃度的提高，芽鮮重在引發(fā)1 d時(shí)呈現(xiàn)先降后升的趨勢，引發(fā)2 d時(shí)呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢；0.5 ～1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理后的芽鮮重隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先降后升的趨勢。1.0%～4.0% KNO3處理后的根鮮重隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢；0.5 mmol·L-1抗壞血酸和1.5 mmol·L-1抗壞血酸處理后的根鮮重隨時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，而在1 mmol·L-1時(shí)呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中，0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d處理的根鮮重在所有處理中達(dá)到最大值，比對照顯著增加178%(P<0.05)。

圖3 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子芽鮮重的影響Fig.3 Influence of different priming treatments on shoot fresh weight of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass

圖4 不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子根鮮重的影響Fig.4 Influence of different priming treatments on root fresh weight of aged seeds of ‘Midnight’ Kentucky bluegrass

雙因素方差分析表明(表4)，不同引發(fā)時(shí)間和不同引發(fā)劑處理下的芽鮮重相關(guān)性不顯著，根鮮重均極顯著相關(guān)(P<0.01)。二者交互作用下的芽鮮重相關(guān)性不顯著，根鮮重極顯著相關(guān)(P<0.01)。

表4 時(shí)間和引發(fā)劑對芽鮮重和根鮮重影響的雙因素方差分析Table 4 Variance analysis of time and initiator on shoot fresh weight and root fresh weight

2.4 隸屬函數(shù)分析

采用模糊隸屬函數(shù)對所測的7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，綜合評價(jià)不同引發(fā)處理對‘午夜’老化種子萌發(fā)和幼苗生長的緩解能力，其中最優(yōu)的3個(gè)組合依次是：0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d，4.0% KNO3引發(fā)1 d，2.0% KNO3引發(fā)2 d(表5)。

表5 隸屬函數(shù)值及綜合評價(jià)Table 5 Subordinate function value and comprehensive evaluation

3 討論

種子老化會導(dǎo)致種子抗氧化酶活性下降，活性氧累積增多，脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，細(xì)胞膜透性增大，膜完整性降低，最終導(dǎo)致活力下降[19]。前人研究表明，引發(fā)處理能夠緩解種子老化，促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗的生長，這是由于引發(fā)劑中含有參與種子細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)換與合成的無機(jī)鹽離子和小分子物質(zhì)，這些無機(jī)鹽離子和小分子物質(zhì)作為植物生長調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)物質(zhì)，在引發(fā)的過程中影響了種子萌發(fā)和幼苗生長的養(yǎng)分分配[20]。因此，通過引發(fā)劑處理可以達(dá)到修復(fù)種子的老化損傷，并達(dá)到顯著提高種子活力水平的效果[21]。

一定濃度的KNO3處理有利于緩解草地早熟禾種子老化，還有促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長的作用，這是因?yàn)殁浛梢约せ罘N子脫氫酶活性和增加呼吸度，調(diào)節(jié)細(xì)胞溶液水勢延緩種子吸水過程，使種子在萌發(fā)前有足夠的時(shí)間進(jìn)行膜系統(tǒng)修復(fù)和重要酶系的活化，改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和代謝狀態(tài)[22]，劉菲[23]對尾葉香茶菜(Rabdosiaexcisa)和藍(lán)萼香茶菜(Rabdosiajaponica)老化種子的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，尾葉香茶菜老化種子在0.5% KNO3引發(fā)0.5 d處理后，發(fā)芽率能達(dá)到40%以上，且藍(lán)萼香茶菜老化種子經(jīng)1.5% KNO3引發(fā)1 d處理后，發(fā)芽率也能達(dá)到53%以上，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，‘午夜’老化種子在各梯度的KNO3處理后的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長和根鮮重較對照均有提高，且芽長和根鮮重受到抑制作用較小，說明1.0%，2.0%和4.0%的KNO3引發(fā)處理對‘午夜’種子的自然老化問題可以起到一定緩解作用。各梯度KNO3處理在引發(fā)2 d時(shí)種子的各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)均高于引發(fā)1 d的，這可能是隨著引發(fā)時(shí)間的延長，KNO3進(jìn)一步促進(jìn)誘導(dǎo)植物體內(nèi)生長促進(jìn)激素(如生長素和赤霉素等)的合成[24]，從而使草地早熟禾種子活力提高。

抗壞血酸作為一種小分子量的抗氧化物質(zhì)，對防止細(xì)胞衰老具有重要作用[25]，前人通過對大豆(Glycinemax)[26]、甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)[27]和茄子(Solanummelongena)[10]等植物種子老化研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸有提高種子內(nèi)相關(guān)抗氧化酶的活性的作用，能夠有效清除活性氧代謝相關(guān)的物質(zhì)?？箟难岢司哂星宄杂苫墓δ芤酝?，它還能促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，加快植物激素的合成，因此抗壞血酸在植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長過程中發(fā)揮重要作用[28]。已有研究表明，抗壞血酸能顯著增加小麥幼苗和根的生長[29]。本試驗(yàn)中，‘午夜’老化種子在各梯度抗壞血酸引發(fā)處理后，發(fā)芽率和活力指數(shù)明顯增加，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d處理后的發(fā)芽率比對照提高37.36%，這與孫銘等[30]試驗(yàn)結(jié)果相似。不僅如此，各梯度抗壞血酸處理后的根長均顯著高于對照(P<0.05)，但芽長比對照低，且1 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d處理后的芽長顯著低于對照，這可能與植物不同器官正常生長所能夠耐受的滲透勢有關(guān)，植物的根部比芽能耐受更低的滲透勢[31]。

不同的引發(fā)時(shí)間對草地早熟禾老化種子的緩解效果也不同[32]，種子引發(fā)處理雖能提高水分脅迫下種子活力，但種子激發(fā)自身對外界萌發(fā)環(huán)境的協(xié)調(diào)能力有限，選擇有效的引發(fā)劑、引發(fā)方式和引發(fā)時(shí)間對種子的引發(fā)效果極其重要[33]。已有研究表明，不同的引發(fā)時(shí)間顯著影響紫花苜蓿(Medicagosativa)種子的活力指數(shù)，但對其最終萌發(fā)率影響不顯著，引發(fā)時(shí)間過長或過短都不利于水稻種子的萌發(fā)[34]。黃志超等[35]對草地早熟禾種子研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)處理能顯著提高種子的發(fā)芽率，在引發(fā)2 d處理后能達(dá)到64.93%，與對照差異顯著，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，‘午夜’老化種子在不同引發(fā)時(shí)間處理下，發(fā)芽率和活力指數(shù)明顯增加，其中1.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)1 d處理后的活力指數(shù)比對照提高65.43%。因此，在引發(fā)的過程中要根據(jù)實(shí)際情況充分考慮引發(fā)劑和引發(fā)時(shí)間的選擇，從而實(shí)現(xiàn)通過引發(fā)處理緩解種子老化和提高種子活力的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過綜合分析各引發(fā)處理對種子發(fā)芽率、活力指數(shù)、平均發(fā)芽天數(shù)、芽長、芽鮮重、根長和根鮮重等指標(biāo)的影響發(fā)現(xiàn)，KNO3和抗壞血酸對草地早熟禾‘午夜’老化種子均有一定的緩解作用，其中2.0%～4.0% KNO3引發(fā)2 d對‘午夜’老化種子萌發(fā)和根生長產(chǎn)生顯著促進(jìn)作用，但各引發(fā)處理對幼苗芽的生長提升效果均不明顯；通過模糊隸屬函數(shù)對所測定的7個(gè)指標(biāo)分析得出：0.5 mmol·L-1抗壞血酸引發(fā)2 d對‘午夜’老化種子萌發(fā)和幼苗生長的緩解效果最佳，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。