雷靜 鄔霞 談小文 李愛(ài)芳 崔曉利 康磊 龐健健 任斐 吳守振 楊翰

結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽(yáng)性(包括細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué))是結(jié)核病診斷的重要依據(jù)[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，用于結(jié)核病病原學(xué)檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)也日益增多，而新一代的GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡(jiǎn)稱“Xpert Ultra”)在結(jié)核病的診斷中表現(xiàn)出更高的敏感度，明顯優(yōu)于GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“Xpert”)檢測(cè)[2-3]。但Xpert Ultra技術(shù)檢測(cè)手術(shù)標(biāo)本(組織和膿液)的研究還鮮有報(bào)道。鑒于此，筆者應(yīng)用Xpert Ultra檢測(cè)疑似結(jié)核病患者組織及膿液標(biāo)本，并與其他常用方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)分析其檢測(cè)同一病灶不同標(biāo)本的病原學(xué)陽(yáng)性檢出率，以評(píng)價(jià)Xpert Ultra檢測(cè)手術(shù)標(biāo)本對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。

材料和方法

一、研究材料

采用前瞻性研究的方法，采集2021年1—9月西安市胸科醫(yī)院297例疑似結(jié)核病患者同一病灶手術(shù)組織和(或)膿液標(biāo)本，獲取組織標(biāo)本227份，膿液標(biāo)本106份，剔除不能滿足組織和膿液標(biāo)本檢測(cè)量的標(biāo)本后獲得合格的手術(shù)組織標(biāo)本49份，膿液標(biāo)本36份。其中，來(lái)自于肺組織及其病灶旁膿液標(biāo)本34份和21份，淋巴組織及其病灶旁膿液標(biāo)本15份和11份，余4份膿液標(biāo)本為單一標(biāo)本。研究對(duì)象中，男性28例，女性21例；對(duì)術(shù)前32例有臨床癥狀、體征等可疑結(jié)核病患者行規(guī)范抗結(jié)核藥物治療1個(gè)月，另17例疑似結(jié)核病患者視病情發(fā)展均在1周內(nèi)擇機(jī)手術(shù)。本研究已通過(guò)西安市胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(S2021-0013)。

二、研究方法

分別對(duì)上述納入的組織標(biāo)本和膿液標(biāo)本行Xpert Ultra、Xpert、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)”)、DNA實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)(FQ-PCR)、結(jié)核分枝桿菌RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增(SAT-RNA)、DNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增(恒溫?cái)U(kuò)增法)。

1.儀器與試劑：全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)GeneXpert DxSystem、Xpert Ultra檢測(cè)試劑盒和Xpert檢測(cè)試劑盒(美國(guó)賽沛公司)，ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，MGIT 960液體培養(yǎng)試劑盒及全自動(dòng)分枝桿菌檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，Deaou-308C恒溫?zé)晒釶CR快速檢測(cè)系統(tǒng)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群恒溫?cái)U(kuò)增核酸檢測(cè)試劑盒(廣州迪澳生物科技有限公司)，細(xì)胞超聲破碎儀FZP-1和RNA恒溫?cái)U(kuò)增-TB-SAT結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(上海仁度生物科技有限公司)，PCR-熒光探針?lè)?分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(北京博奧晶典生物科技有限公司)。

2.Xpert Ultra和Xpert檢測(cè)：組織標(biāo)本使用玻璃珠進(jìn)行勻漿處理，生理鹽水重懸。膿液標(biāo)本加入生理鹽水重懸后，使用細(xì)胞超聲破碎儀40 Hz 15 min。分別靜置上述處理后標(biāo)本5 min，吸取上清液1.5 ml加入試劑盒上機(jī)測(cè)試。儀器自動(dòng)判讀陽(yáng)性[高、中、低、極低、trace(Xpert Ultra)]和陰性結(jié)果。若出現(xiàn)檢測(cè)失敗則重新檢測(cè)。

3.FQ-PCR法：分別將制備好的組織勻漿標(biāo)本、膿液標(biāo)本與4% NaOH溶液以1∶1～1∶2 混合液化，取1 ml液化后標(biāo)本加入1.5 ml離心管中，15 000×g離心6 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后，15 000×g離心6 min，棄上清，向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，振蕩儀快速振蕩10 min，95 ℃金屬浴加熱5 min。15 000×g離心2 min，上清即為核酸標(biāo)本。取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴(kuò)增試劑微量反應(yīng)管中，上機(jī)檢測(cè)。擴(kuò)增程序：37 ℃ 300 s，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 180 s，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；50 ℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)；熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃ 30 s。結(jié)果判讀：循環(huán)閾值(Ct值；樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù))<40為陽(yáng)性，Ct值≥40或無(wú)數(shù)值為陰性，若出現(xiàn)檢測(cè)失敗則重新檢測(cè)。

4.SAT-RNA法：分別將制備好的組織勻漿標(biāo)本、膿液標(biāo)本與4% NaOH溶液以1∶1～1∶2混合液化，取1 ml經(jīng)液化后標(biāo)本加入1.5 ml離心管中，15 000×g離心6 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后，15 000×g離心6 min，棄上清，加入50 μl稀釋液，旋渦振蕩混勻，置于超聲破碎儀中40 Hz 15 min，15 000×g離心2 min。吸取2 μl提取后RNA加入30 μl擴(kuò)增試劑微量反應(yīng)管中，放置于恒溫干浴器內(nèi)，60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，加入 SAT酶，上機(jī)檢測(cè)。擴(kuò)增程序：42 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每分鐘采集1次熒光。結(jié)果判讀：根據(jù)分析后圖像調(diào)整基線和閾值線，Ct值<40為陽(yáng)性，Ct值≥40或無(wú)數(shù)值為陰性，若檢測(cè)失敗需重新檢測(cè)。

5.MGIT 960培養(yǎng)：分別吸取制備好的組織勻漿、膿液標(biāo)本各2 ml與4% NaOH溶液以1∶1～1∶2 混合(混合后NaOH終濃度為3%～4%)，加入50 ml無(wú)菌離心管中漩渦振蕩混勻，室溫靜置15 min，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)至45 ml，3000×g離心20 min，棄上清，加入1 ml PBS溶液后混勻，室溫靜置10 min后，吸取0.5 ml至 MGIT 960培養(yǎng)管中，置于MGIT 960培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d。結(jié)果判讀：MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽(yáng)后，抗酸染色及分枝桿菌菌種鑒定(基因芯片法)為結(jié)核分枝桿菌者為陽(yáng)性，反之為陰性。

6.恒溫?cái)U(kuò)增法：分別將制備好的組織勻漿標(biāo)本、膿液標(biāo)本與4% NaOH溶液以1∶1～1∶2混合液化，用一次性吸管吸取200 μl液化后的標(biāo)本加入到樣品管中，混勻。100 ℃恒溫處理10 min，取出樣品管，冷卻至室溫。取下吸附管管帽，將樣品管順時(shí)針旋入吸附管，充分混勻液化液和吸附劑，平放靜置1 min。擠壓吸附管將液滴擠入離心管中備用。將模板DNA加入到恒溫?cái)U(kuò)增核酸檢測(cè)試劑盒中對(duì)應(yīng)反應(yīng)管中，瞬時(shí)(5 s)離心混勻以上試劑，上機(jī)擴(kuò)增。儀器自動(dòng)判讀陽(yáng)性或陰性結(jié)果。若檢測(cè)失敗則重新檢測(cè)。

7.樣本陽(yáng)性結(jié)果判讀：每種方法均分別檢測(cè)1或 2種標(biāo)本，將任一標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果判定為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并繪制ROC曲線。計(jì)數(shù)資料采用“例(率，%)”描述，兩組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。以臨床診斷為參考標(biāo)準(zhǔn)，分析6種技術(shù)檢測(cè)結(jié)核病的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率、Kappa值、受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積。本研究考慮組織標(biāo)本較膿液標(biāo)本普遍易得，且合格標(biāo)本也較多，故僅對(duì)組織標(biāo)本的檢測(cè)效能進(jìn)行分析。其中，Kappa值在0.00～0.20為極低一致性、0.21～0.40為一般一致性、0.41～0.60為中等一致性、0.61～0.80為高度一致性、0.81～1.00為幾乎完全一致。同時(shí)評(píng)價(jià)不同方法檢測(cè)確診結(jié)核病患者同一病灶不同類型標(biāo)本(組織及膿液樣本)陽(yáng)性率的差異。

結(jié) 果

一、臨床診斷及檢測(cè)陽(yáng)性率

49例研究對(duì)象中，病原學(xué)診斷結(jié)核病32例，包括肺結(jié)核21例，淋巴結(jié)結(jié)核11例；其他疾病17例，包括肺惡性腫瘤12例，淋巴結(jié)增大2例，胸膜炎2例，胸腔積液1例。Xpert Ultra在疑似結(jié)核病組織標(biāo)本檢測(cè)中總陽(yáng)性率為49.0%(24/49)，對(duì)確診結(jié)核病的組織標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率為75.0%(24/32)，對(duì)確診結(jié)核病膿液標(biāo)本檢測(cè)中陽(yáng)性率為71.4%(20/28)。

二、不同方法對(duì)組織標(biāo)本的檢測(cè)效能

考慮組織標(biāo)本陽(yáng)性率高于膿液標(biāo)本，且組織標(biāo)本普遍易得，合格標(biāo)本也較多，故僅對(duì)組織標(biāo)本的檢測(cè)效能進(jìn)行分析。

以臨床診斷結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，6種方法對(duì)組織標(biāo)本的檢測(cè)效能見(jiàn)表1。Xpert Ultra檢測(cè)的敏感度(75.0%)明顯高于Xpert、FQ-PCR、SAT-RNA、恒溫?cái)U(kuò)增法及MGIT 960培養(yǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.919，P<0.001；χ2=21.866，P<0.001；χ2=5.418，P=0.020；χ2=15.228，P<0.001；χ2=11.574，P=0.001)。一致性分析顯示：Xpert Ultra與臨床確診高度一致，Xpert和FQ-PCR為中等一致，MGIT 960培養(yǎng)為一般一致，SAT-RNA和恒溫?cái)U(kuò)增法為極低一致。Xpert Ultra的ROC曲線下面積最大(0.875)，診斷效能最高，其后依次為Xpert(0.828)、FQ-PCR(0.766)、MGIT 960培養(yǎng)(0.688)、SAT-RNA(0.625)、恒溫?cái)U(kuò)增法(0.531)，見(jiàn)圖1。

表1 6種檢測(cè)方法以臨床確診結(jié)果為參照對(duì)結(jié)核病的的檢測(cè)效能

注 培養(yǎng)法：BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)，F(xiàn)Q-PCR：DNA實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)，SAT-RNA：結(jié)核分枝桿菌RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增，恒溫?cái)U(kuò)增法：DNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增圖1 6種檢測(cè)方法以臨床診斷結(jié)果為參照診斷結(jié)核病的ROC曲線

三、不同方法對(duì)結(jié)核病患者組織和膿液標(biāo)本的檢測(cè)情況

對(duì)28份確診結(jié)核病患者同一病灶的組織與膿液標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)同一種檢測(cè)方法對(duì)同一病灶的組織與膿液標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 6種檢測(cè)方法對(duì)28例結(jié)核病患者同一病灶膿液與組織標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率比較 [份(陽(yáng)性率，%)]

討 論

隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，Xpert、FQ-PCR、SAT-RNA等常用分子生物學(xué)檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。Xpert檢測(cè)系統(tǒng)因其操作方便快捷、敏感度高、報(bào)告時(shí)間短而受到青睞[4]；而FQ-PCR法采用結(jié)核分枝桿菌的保守序列設(shè)計(jì)探針，但因提取臨床標(biāo)本中模板DNA的過(guò)程多為人工操作，受影響因素較多，可能降低了FQ-PCR對(duì)結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測(cè)效率。SAT-RNA法是以結(jié)核分枝桿菌RNA為模板，受RNA易降解的特性使其敏感度極大降低。而Xpert Ultra是在原有Xpert系統(tǒng)上進(jìn)行了優(yōu)化，檢測(cè)原理由半定量半巢式循環(huán)閾值的比較變?yōu)榘攵砍彩絇CR，并采用了高分辨率熔解曲線技術(shù)，彌補(bǔ)了Xpert對(duì)菌量較少樣本檢測(cè)敏感度較低的缺點(diǎn)，使該試劑盒的PCR擴(kuò)增體系由原來(lái)的25 μl提升至50 μl，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢出下限由原來(lái)的112.6 CFU/ml下降為15.6 CFU/ml，敏感度提高了7倍，并在檢測(cè)單個(gè)ropB目的基因的基礎(chǔ)上增加2個(gè)多拷貝序列，即IS6110和IS1081[3, 5-7]。目前，Xpert Ultra方法已經(jīng)在痰液、腦脊液、胃液等標(biāo)本的檢測(cè)中表現(xiàn)出了較高的敏感度，但由于手術(shù)樣本取材困難，且無(wú)法重復(fù)獲得，Xpert Ultra方法檢測(cè)這些標(biāo)本的研究還欠缺。

本研究顯示，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Ultra檢測(cè)的一致性最高，且敏感度明顯高于Xpert等其他5種檢測(cè)方法，與2020年Cresswell等[8]采用前瞻性隊(duì)列研究檢測(cè)51例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液標(biāo)本的結(jié)果一致。另有研究發(fā)現(xiàn)，Xpert Ultra檢測(cè)痰液、支氣管肺泡灌洗液、胃液等標(biāo)本在診斷成人肺結(jié)核、兒童肺結(jié)核的敏感度也均高于Xpert[9-10]，檢測(cè)兒童胃液與臨床診斷兒童肺結(jié)核有較高的一致性[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Xpert Ultra、Xpert和FQ-PCR檢測(cè)的敏感度均高于SAT-RNA和培養(yǎng)法，認(rèn)為是前3種檢測(cè)手段的靶基因均為DNA，可以檢測(cè)到樣本中的死菌和活菌，增加了檢測(cè)敏感度；而SAT-RNA、培養(yǎng)法只能檢測(cè)到樣本中的活菌，并且，為降低因手術(shù)可能導(dǎo)致的感染播散風(fēng)險(xiǎn)，本研究納入的32例臨床診斷結(jié)核病患者均于術(shù)前進(jìn)行了1個(gè)月的規(guī)范抗結(jié)核藥物治療，可能導(dǎo)致術(shù)后樣本活菌載量的減少，降低這兩種方法的檢測(cè)敏感度。同時(shí)，恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)的敏感度也較低，可能與其試劑盒雖適用于DNA檢測(cè)，但其配置的核酸提取裝置主要針對(duì)痰液標(biāo)本設(shè)計(jì)，并不適用于組織和膿液樣本的檢測(cè)有關(guān)。

本研究進(jìn)一步了解了各種方法對(duì)同一病灶的組織標(biāo)本及膿液標(biāo)本檢出陽(yáng)性率的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一檢測(cè)方法對(duì)組織及膿液兩種標(biāo)本檢出陽(yáng)性率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示無(wú)需采用同一方法檢測(cè)同一病灶不同標(biāo)本，但考慮膿液標(biāo)本檢測(cè)的有效性，建議優(yōu)先選取組織標(biāo)本。但這一結(jié)果與本研究團(tuán)隊(duì)之前的研究結(jié)論“Xpert及培養(yǎng)法檢測(cè)組織標(biāo)本陽(yáng)性率優(yōu)于膿液標(biāo)本”[12]不符，可能與本次研究對(duì)標(biāo)本前處理的改進(jìn)有關(guān)。本研究對(duì)組織標(biāo)本的前處理使用了玻璃珠對(duì)預(yù)先處理好的小塊組織進(jìn)行研磨，研磨效果好、成本低。而傳統(tǒng)研磨方法，如普通玻璃研磨器為一次性使用，雖避免了污染，但成本過(guò)高，重復(fù)使用又容易造成核酸污染；而高速研磨器，又因轉(zhuǎn)速過(guò)高而產(chǎn)生大量氣溶膠，易造成生物危害及環(huán)境污染。另外，本研究對(duì)膿液標(biāo)本使用了細(xì)胞超聲破碎儀。該破碎儀可將黏稠的膿液標(biāo)本分散完全，同時(shí)可將白細(xì)胞吞噬的結(jié)核分枝桿菌充分釋放，使得上清液中的核酸量大幅提高，最大程度地提高試劑的使用效率和檢測(cè)陽(yáng)性率；而未經(jīng)超聲破碎的膿液標(biāo)本，在進(jìn)行Xpert Ultra和Xpert檢測(cè)吸取上清液時(shí)，由于大量游離的及白細(xì)胞吞噬的結(jié)核分枝桿菌沉積于底部，上清液檢測(cè)容易造成實(shí)驗(yàn)的假陰性，底部沉淀的檢測(cè)又容易造成試劑盒堵塞，導(dǎo)致檢測(cè)失敗及成本增加。

綜上所述，Xpert Ultra在檢測(cè)術(shù)后組織及膿液標(biāo)本的優(yōu)勢(shì)明顯，具有較高的結(jié)核病快速診斷價(jià)值，優(yōu)化樣本前處理方式可進(jìn)一步提高其檢測(cè)陽(yáng)性率，且無(wú)需采用同一方法檢測(cè)同一病灶不同標(biāo)本類型；但考慮采樣的可及性和合格率，應(yīng)優(yōu)先選擇組織標(biāo)本。本研究也存在一定不足，因手術(shù)組織和膿液標(biāo)本采集的特殊性，獲取的合格樣本有限，可能造成結(jié)果的偏倚。