雷靜 鄔霞 談小文 李愛芳 崔曉利 康磊 龐健健 任斐 吳守振 楊翰
結核分枝桿菌檢測陽性(包括細菌學和分子生物學)是結核病診斷的重要依據(jù)[1]。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展,用于結核病病原學檢測的分子生物學技術也日益增多,而新一代的GeneXpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)在結核病的診斷中表現(xiàn)出更高的敏感度,明顯優(yōu)于GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測[2-3]。但Xpert Ultra技術檢測手術標本(組織和膿液)的研究還鮮有報道。鑒于此,筆者應用Xpert Ultra檢測疑似結核病患者組織及膿液標本,并與其他常用方法檢測結果進行對比,同時分析其檢測同一病灶不同標本的病原學陽性檢出率,以評價Xpert Ultra檢測手術標本對結核病的診斷價值。
采用前瞻性研究的方法,采集2021年1—9月西安市胸科醫(yī)院297例疑似結核病患者同一病灶手術組織和(或)膿液標本,獲取組織標本227份,膿液標本106份,剔除不能滿足組織和膿液標本檢測量的標本后獲得合格的手術組織標本49份,膿液標本36份。其中,來自于肺組織及其病灶旁膿液標本34份和21份,淋巴組織及其病灶旁膿液標本15份和11份,余4份膿液標本為單一標本。研究對象中,男性28例,女性21例;對術前32例有臨床癥狀、體征等可疑結核病患者行規(guī)范抗結核藥物治療1個月,另17例疑似結核病患者視病情發(fā)展均在1周內(nèi)擇機手術。本研究已通過西安市胸科醫(yī)院倫理委員會審批(S2021-0013)。
分別對上述納入的組織標本和膿液標本行Xpert Ultra、Xpert、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)、DNA實時熒光定量核酸擴增檢測(FQ-PCR)、結核分枝桿菌RNA實時熒光恒溫擴增(SAT-RNA)、DNA實時熒光恒溫擴增(恒溫擴增法)。
1.儀器與試劑:全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)GeneXpert DxSystem、Xpert Ultra檢測試劑盒和Xpert檢測試劑盒(美國賽沛公司),ABI 7500熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司),MGIT 960液體培養(yǎng)試劑盒及全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)(美國BD公司),Deaou-308C恒溫熒光PCR快速檢測系統(tǒng)和結核分枝桿菌復合群恒溫擴增核酸檢測試劑盒(廣州迪澳生物科技有限公司),細胞超聲破碎儀FZP-1和RNA恒溫擴增-TB-SAT結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(上海仁度生物科技有限公司),PCR-熒光探針法-分枝桿菌核酸檢測試劑盒(北京博奧晶典生物科技有限公司)。
2.Xpert Ultra和Xpert檢測:組織標本使用玻璃珠進行勻漿處理,生理鹽水重懸。膿液標本加入生理鹽水重懸后,使用細胞超聲破碎儀40 Hz 15 min。分別靜置上述處理后標本5 min,吸取上清液1.5 ml加入試劑盒上機測試。儀器自動判讀陽性[高、中、低、極低、trace(Xpert Ultra)]和陰性結果。若出現(xiàn)檢測失敗則重新檢測。
3.FQ-PCR法:分別將制備好的組織勻漿標本、膿液標本與4% NaOH溶液以1∶1~1∶2 混合液化,取1 ml液化后標本加入1.5 ml離心管中,15 000×g離心6 min,棄上清,加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后,15 000×g離心6 min,棄上清,向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中,振蕩儀快速振蕩10 min,95 ℃金屬浴加熱5 min。15 000×g離心2 min,上清即為核酸標本。取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴增試劑微量反應管中,上機檢測。擴增程序:37 ℃ 300 s,1個循環(huán);94 ℃ 180 s,1個循環(huán);94 ℃ 15 s,40個循環(huán);60 ℃ 30 s,40個循環(huán);50 ℃ 10 s,1個循環(huán);熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。結果判讀:循環(huán)閾值(Ct值;樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(shù))<40為陽性,Ct值≥40或無數(shù)值為陰性,若出現(xiàn)檢測失敗則重新檢測。
4.SAT-RNA法:分別將制備好的組織勻漿標本、膿液標本與4% NaOH溶液以1∶1~1∶2混合液化,取1 ml經(jīng)液化后標本加入1.5 ml離心管中,15 000×g離心6 min,棄上清,加入1 ml生理鹽水渦旋振蕩后,15 000×g離心6 min,棄上清,加入50 μl稀釋液,旋渦振蕩混勻,置于超聲破碎儀中40 Hz 15 min,15 000×g離心2 min。吸取2 μl提取后RNA加入30 μl擴增試劑微量反應管中,放置于恒溫干浴器內(nèi),60 ℃ 10 min,42 ℃ 5 min,加入 SAT酶,上機檢測。擴增程序:42 ℃ 1 min,40個循環(huán),每分鐘采集1次熒光。結果判讀:根據(jù)分析后圖像調(diào)整基線和閾值線,Ct值<40為陽性,Ct值≥40或無數(shù)值為陰性,若檢測失敗需重新檢測。
5.MGIT 960培養(yǎng):分別吸取制備好的組織勻漿、膿液標本各2 ml與4% NaOH溶液以1∶1~1∶2 混合(混合后NaOH終濃度為3%~4%),加入50 ml無菌離心管中漩渦振蕩混勻,室溫靜置15 min,加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)至45 ml,3000×g離心20 min,棄上清,加入1 ml PBS溶液后混勻,室溫靜置10 min后,吸取0.5 ml至 MGIT 960培養(yǎng)管中,置于MGIT 960培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d。結果判讀:MGIT 960系統(tǒng)報陽后,抗酸染色及分枝桿菌菌種鑒定(基因芯片法)為結核分枝桿菌者為陽性,反之為陰性。
6.恒溫擴增法:分別將制備好的組織勻漿標本、膿液標本與4% NaOH溶液以1∶1~1∶2混合液化,用一次性吸管吸取200 μl液化后的標本加入到樣品管中,混勻。100 ℃恒溫處理10 min,取出樣品管,冷卻至室溫。取下吸附管管帽,將樣品管順時針旋入吸附管,充分混勻液化液和吸附劑,平放靜置1 min。擠壓吸附管將液滴擠入離心管中備用。將模板DNA加入到恒溫擴增核酸檢測試劑盒中對應反應管中,瞬時(5 s)離心混勻以上試劑,上機擴增。儀器自動判讀陽性或陰性結果。若檢測失敗則重新檢測。
7.樣本陽性結果判讀:每種方法均分別檢測1或 2種標本,將任一標本檢測陽性結果判定為陽性。
采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,并繪制ROC曲線。計數(shù)資料采用“例(率,%)”描述,兩組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法,檢驗水準為α=0.05。以臨床診斷為參考標準,分析6種技術檢測結核病的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值、受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積。本研究考慮組織標本較膿液標本普遍易得,且合格標本也較多,故僅對組織標本的檢測效能進行分析。其中,Kappa值在0.00~0.20為極低一致性、0.21~0.40為一般一致性、0.41~0.60為中等一致性、0.61~0.80為高度一致性、0.81~1.00為幾乎完全一致。同時評價不同方法檢測確診結核病患者同一病灶不同類型標本(組織及膿液樣本)陽性率的差異。
49例研究對象中,病原學診斷結核病32例,包括肺結核21例,淋巴結結核11例;其他疾病17例,包括肺惡性腫瘤12例,淋巴結增大2例,胸膜炎2例,胸腔積液1例。Xpert Ultra在疑似結核病組織標本檢測中總陽性率為49.0%(24/49),對確診結核病的組織標本檢測陽性率為75.0%(24/32),對確診結核病膿液標本檢測中陽性率為71.4%(20/28)。
考慮組織標本陽性率高于膿液標本,且組織標本普遍易得,合格標本也較多,故僅對組織標本的檢測效能進行分析。
以臨床診斷結果為參考標準,6種方法對組織標本的檢測效能見表1。Xpert Ultra檢測的敏感度(75.0%)明顯高于Xpert、FQ-PCR、SAT-RNA、恒溫擴增法及MGIT 960培養(yǎng),差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=32.919,P<0.001;χ2=21.866,P<0.001;χ2=5.418,P=0.020;χ2=15.228,P<0.001;χ2=11.574,P=0.001)。一致性分析顯示:Xpert Ultra與臨床確診高度一致,Xpert和FQ-PCR為中等一致,MGIT 960培養(yǎng)為一般一致,SAT-RNA和恒溫擴增法為極低一致。Xpert Ultra的ROC曲線下面積最大(0.875),診斷效能最高,其后依次為Xpert(0.828)、FQ-PCR(0.766)、MGIT 960培養(yǎng)(0.688)、SAT-RNA(0.625)、恒溫擴增法(0.531),見圖1。
表1 6種檢測方法以臨床確診結果為參照對結核病的的檢測效能
注 培養(yǎng)法:BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng),F(xiàn)Q-PCR:DNA實時熒光定量核酸擴增檢測,SAT-RNA:結核分枝桿菌RNA實時熒光恒溫擴增,恒溫擴增法:DNA實時熒光恒溫擴增圖1 6種檢測方法以臨床診斷結果為參照診斷結核病的ROC曲線
對28份確診結核病患者同一病灶的組織與膿液標本檢測結果進行比較,發(fā)現(xiàn)同一種檢測方法對同一病灶的組織與膿液標本檢測陽性率的差異均無統(tǒng)計學意義,見表2。
表2 6種檢測方法對28例結核病患者同一病灶膿液與組織標本檢測陽性率比較 [份(陽性率,%)]
隨著分子生物學檢測技術的飛速發(fā)展,Xpert、FQ-PCR、SAT-RNA等常用分子生物學檢測方法已被廣泛應用于臨床檢驗。Xpert檢測系統(tǒng)因其操作方便快捷、敏感度高、報告時間短而受到青睞[4];而FQ-PCR法采用結核分枝桿菌的保守序列設計探針,但因提取臨床標本中模板DNA的過程多為人工操作,受影響因素較多,可能降低了FQ-PCR對結核分枝桿菌核酸的檢測效率。SAT-RNA法是以結核分枝桿菌RNA為模板,受RNA易降解的特性使其敏感度極大降低。而Xpert Ultra是在原有Xpert系統(tǒng)上進行了優(yōu)化,檢測原理由半定量半巢式循環(huán)閾值的比較變?yōu)榘攵砍彩絇CR,并采用了高分辨率熔解曲線技術,彌補了Xpert對菌量較少樣本檢測敏感度較低的缺點,使該試劑盒的PCR擴增體系由原來的25 μl提升至50 μl,對結核分枝桿菌的檢出下限由原來的112.6 CFU/ml下降為15.6 CFU/ml,敏感度提高了7倍,并在檢測單個ropB目的基因的基礎上增加2個多拷貝序列,即IS6110和IS1081[3, 5-7]。目前,Xpert Ultra方法已經(jīng)在痰液、腦脊液、胃液等標本的檢測中表現(xiàn)出了較高的敏感度,但由于手術樣本取材困難,且無法重復獲得,Xpert Ultra方法檢測這些標本的研究還欠缺。
本研究顯示,以臨床診斷結果為標準,Xpert Ultra檢測的一致性最高,且敏感度明顯高于Xpert等其他5種檢測方法,與2020年Cresswell等[8]采用前瞻性隊列研究檢測51例結核性腦膜炎患者腦脊液標本的結果一致。另有研究發(fā)現(xiàn),Xpert Ultra檢測痰液、支氣管肺泡灌洗液、胃液等標本在診斷成人肺結核、兒童肺結核的敏感度也均高于Xpert[9-10],檢測兒童胃液與臨床診斷兒童肺結核有較高的一致性[11]。
本研究發(fā)現(xiàn),Xpert Ultra、Xpert和FQ-PCR檢測的敏感度均高于SAT-RNA和培養(yǎng)法,認為是前3種檢測手段的靶基因均為DNA,可以檢測到樣本中的死菌和活菌,增加了檢測敏感度;而SAT-RNA、培養(yǎng)法只能檢測到樣本中的活菌,并且,為降低因手術可能導致的感染播散風險,本研究納入的32例臨床診斷結核病患者均于術前進行了1個月的規(guī)范抗結核藥物治療,可能導致術后樣本活菌載量的減少,降低這兩種方法的檢測敏感度。同時,恒溫擴增法檢測的敏感度也較低,可能與其試劑盒雖適用于DNA檢測,但其配置的核酸提取裝置主要針對痰液標本設計,并不適用于組織和膿液樣本的檢測有關。
本研究進一步了解了各種方法對同一病灶的組織標本及膿液標本檢出陽性率的差異,結果發(fā)現(xiàn),同一檢測方法對組織及膿液兩種標本檢出陽性率的差異均無統(tǒng)計學意義,提示無需采用同一方法檢測同一病灶不同標本,但考慮膿液標本檢測的有效性,建議優(yōu)先選取組織標本。但這一結果與本研究團隊之前的研究結論“Xpert及培養(yǎng)法檢測組織標本陽性率優(yōu)于膿液標本”[12]不符,可能與本次研究對標本前處理的改進有關。本研究對組織標本的前處理使用了玻璃珠對預先處理好的小塊組織進行研磨,研磨效果好、成本低。而傳統(tǒng)研磨方法,如普通玻璃研磨器為一次性使用,雖避免了污染,但成本過高,重復使用又容易造成核酸污染;而高速研磨器,又因轉(zhuǎn)速過高而產(chǎn)生大量氣溶膠,易造成生物危害及環(huán)境污染。另外,本研究對膿液標本使用了細胞超聲破碎儀。該破碎儀可將黏稠的膿液標本分散完全,同時可將白細胞吞噬的結核分枝桿菌充分釋放,使得上清液中的核酸量大幅提高,最大程度地提高試劑的使用效率和檢測陽性率;而未經(jīng)超聲破碎的膿液標本,在進行Xpert Ultra和Xpert檢測吸取上清液時,由于大量游離的及白細胞吞噬的結核分枝桿菌沉積于底部,上清液檢測容易造成實驗的假陰性,底部沉淀的檢測又容易造成試劑盒堵塞,導致檢測失敗及成本增加。
綜上所述,Xpert Ultra在檢測術后組織及膿液標本的優(yōu)勢明顯,具有較高的結核病快速診斷價值,優(yōu)化樣本前處理方式可進一步提高其檢測陽性率,且無需采用同一方法檢測同一病灶不同標本類型;但考慮采樣的可及性和合格率,應優(yōu)先選擇組織標本。本研究也存在一定不足,因手術組織和膿液標本采集的特殊性,獲取的合格樣本有限,可能造成結果的偏倚。