楊明珠，陳曉春，宋佳誠，侯亞欣，李俊平

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

在集約化養(yǎng)殖模式下，免疫是動物疫病防控的有效手段。疫苗作為免疫防控的最主要物質，安全、有效、質量可控是其應具備的最重要的特性。經濟動物使用的疫苗還要考慮其生產工藝、成本、使用的方便性等，最好是多聯(lián)多價，以減少免疫次數(shù)、節(jié)約人力成本等?；钜呙缇哂谐杀镜?、免疫效果好的優(yōu)點，但有的微生物不易致弱，或致弱后易引起毒力返強，存在安全風險，不宜制備活疫苗。滅活疫苗雖無毒力返強的風險，但制備成本較高、免疫效果相對較差，有的微生物制備成滅活疫苗甚至無免疫保護作用。同時大多數(shù)傳染性病原體是通過黏膜進入宿主體內，因此除了傳統(tǒng)誘導系統(tǒng)免疫的注射疫苗外,還應該開發(fā)能誘導黏膜免疫的疫苗,從而在黏膜侵入點建立第一道防線,阻止病原體侵入機體[1]。重組活載體疫苗是利用重組DNA技術將外源性目的基因插入到載體基因組中并獲得高效表達，同時又不影響原毒株的復制，且能誘導機體的體液免疫與細胞免疫，甚至是黏膜免疫[2]，有效規(guī)避了傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗的一些缺點，達到一針多防的效果。目前用來構建活載體的動物病毒主要有痘病毒[3-5]、腺病毒[6-7]、皰疹病毒[8]、不分節(jié)段的單股RNA病毒[9]等，其中，皰疹病毒因基因組大、宿主范圍廣泛、含有多個復制非必需區(qū)及相關基因操作技術成熟而成為大多數(shù)研究者選擇的載體病毒。用作病毒載體的動物皰疹病毒主要有火雞皰疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、鴨瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)等。皰疹病毒基因組中的有些基因與病毒的毒力有關而不參與病毒的復制，通過缺失或失活相關毒力基因會在不同程度上降低病毒的毒力，由此可構建出弱毒疫苗對載體相關病毒引起的疾病進行有效防控，同時插入外源基因的重組病毒所表達的蛋白可正常進行翻譯、加工與修飾，保證了重組活載體疫苗良好的免疫原性[10]。筆者從重組皰疹病毒的構建方法、外源基因的表達方式及插入位點的篩選、重組皰疹病毒活載體疫苗的研究、重組活載體疫苗的應用及展望等幾方面進行綜述，以期為相關領域的研究提供理論和實踐指導。

1 重組皰疹病毒的構建方法

1.1 傳統(tǒng)同源重組法

基于同源重組的原理來構建基因缺失病毒或重組病毒的技術路線分為轉移質粒的構建與重組病毒的篩選這2個步驟。通常是先利用PCR技術以病毒基因組為模板擴增用作重組同源臂的2個基因片段，而后將外源基因表達盒插入同源臂之間，構建含有外源基因表達盒及左右同源臂的轉移載體，利用轉移載體與親本株在真核易感細胞內同時培養(yǎng)發(fā)生同源重組而達到基因的缺失或替換。其中一種重組方法是在親本病毒株感染真核細胞后再進行轉移載體的轉染，這種重組效率低，且不易對重組毒株和親本毒株進行分離，篩選純化的時間長[11]。目前常采用轉移載體與親本毒基因組共轉染的方法，利用轉移載體上攜帶的報告基因進行重組病毒的蝕斑篩選，一般經3～5代篩選即可獲得具有感染活性的重組病毒[12]。時慶賀等[13]通過DNA體外重組技術構建出含有豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)YY株ORF2基因和細胞因子佐劑IL-2基因的轉移質粒，將其與rPRV-gE-/TK-/EGFP+的基因組共轉染293T細胞，獲得重組病毒rPRV-gE-/TK-/ORF2+/IL-2+。Andoh等[14]通過體外克隆技術將含有傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2基因的表達盒插入到含有不同同源臂的重組轉移質粒中，并將其與HVT共轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，基于同源重組將IBDV的VP2基因成功插入到HVT基因組中UL3-4、UL22-23、UL45-46和US10-SORF3這4個位點，成功構建出4株重組病毒。

同源重組技術不僅在早期病毒構建過程中發(fā)揮著重要作用，更是與時俱進地與新興技術相結合形成更高效的重組病毒構建方法，如CRISPR/Cas9介導的同源重組技術[15]、Red/ET重組技術[16]等。

1.2 基于病毒細菌人工染色體(BAC)平臺的構建方法

隨著對大型基因組序列分析的需求越來越多，對高裝載量載體的開發(fā)技術逐漸發(fā)展，目前已開發(fā)出多種類型的人工染色體載體，其中包括基于大腸桿菌性因子F質粒構建的BAC系列，其裝載量為50～300 kb，目前已被廣泛用于大基因組病毒的克隆。人工構建的BAC載體質?？截悢?shù)低，但穩(wěn)定性好，同時在真核細胞中基于BAC表達的基因能接近生理性表達[17]。

構建病毒BAC是對病毒基因組進行修飾、獲得重組病毒的前提。在含有病毒BAC的大腸桿菌中對病毒基因組進行快速缺失、突變及插入特定序列等基因修飾非常方便，可利用Red/ET重組技術來改造大腸桿菌中的BAC[16]。一般可分為兩步進行，第一步是構建帶有標記基因及兩端含有同源臂序列的表達盒，將其電轉化含有病毒BAC的感受態(tài)細胞，經抗性篩選及PCR鑒定等獲得正確的重組子；第二步是構建帶有外源基因及兩端含有同源臂序列的表達盒，利用電轉化方式將其導入含有重組子的感受態(tài)細胞，經反向抗性篩選獲得刪除了標記基因的重組子。除了利用抗藥性篩選法，還可利用營養(yǎng)缺陷型篩選法，將半乳糖激酶(Galk)基因作為篩選基因，在重組過程中通過觀察細菌能否在只含有半乳糖的培養(yǎng)基中生長來判斷是否重組成功。

基于RecA系統(tǒng)或利用Red/ET重組技術同樣能進行病毒BAC的修飾，兩者的修飾技術相似，都是在體外構建含有標記基因或外源基因的DNA分子，將其與大腸桿菌內的病毒BAC進行重組，但在RecA系統(tǒng)中為了誘發(fā)重組酶的表達，同源臂長度是Red/ET系統(tǒng)的十余倍。陳柳等[18]在DEV疫苗株細菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎上，將5個重組表達框分別通過Red/ET兩步重組技術克隆至pDEV-EF1突變體的US7和US8基因之間，構建了攜帶不同啟動子調控的Es突變體克隆pDEV-pro-Es。

Cre/loxP重組酶系統(tǒng)也被廣泛用于基因修飾。Cre/loxp重組酶系統(tǒng)包括Cre重組酶和重組酶的識別位點loxP，Cre重組酶不需要其他輔助因子就能完成活體內和體外細胞中的DNA重組，且重組效率高達80%，遠高于其他重組酶，通過特異性識別基因組上的2個34 bp長度的loxP位點，從而對位點之間的基因序列進行修飾。此外，由于Cre重組酶對loxP位點的序列突變具有一定的包容性，大大增加了該系統(tǒng)的應用范圍。但就本質而言Cre/loxP并非真正意義上的位點特異性重組系統(tǒng)，因為作為重組事件所必需的順式元件loxP位點需人工導入，而導入過程仍需借助同源重組程序。同時由Cre重組酶介導的整合和刪除反應是可逆的，敲除的靶基因有可能重新返回原來的位點，整合的基因也同樣可能從整合位點掉下來。朱佳[19]以IBDV XD2010超強毒株為模板，通過RT-PCR擴增其VP2基因,利用HVT FC126疫苗株基因組US2同源序列、CMV啟動子和綠色熒光蛋白(EGFP)基因,構建含有VP2基因的轉移載體質粒pCMV-EGFP-VP2，經轉染、純化得到帶EGFP基因的重組病毒rHVT-EGFP-VP2，并利用Cre重組酶去除rHVT-EGFP-VP2基因組中的EGFP基因,重新轉染CEF細胞，經篩選、純化得到不含EGFP基因的重組病毒rHVT-VP2。

目前已成功構建出PRV BAC[20]、HVT BAC[21]等，基于病毒BAC平臺對病毒基因組進行遺傳修飾，簡化了重組病毒的構建，有效且可靠。

1.3 基于Fosmid文庫的構建方法

利用傳統(tǒng)同源重組方法獲得重組病毒的效率低，將皰疹病毒全基因組與BAC質粒進行連接，在電轉化過程中往往會出現(xiàn)片段缺失，也會影響重組病毒的獲得效率。通過構建病毒基因組Fosmid文庫，在細菌中對龐大的皰疹病毒基因組進行基因的缺失、插入或突變，能極大提升獲得病毒突變體的效率。

構建皰疹病毒Fosmid文庫首先需將病毒龐大的基因組隨機剪切成各個片段，而后將各片段末端補平修飾后與平末端的Fosmid載體連接，經體外噬菌體包裝蛋白包裝后侵染大腸桿菌，經抗性篩選后挑取單克隆進行測序鑒定及質粒提取，構建出涵蓋皰疹病毒全基因組的Fosmid文庫。選取包含病毒全長基因組的質粒組合共轉染病毒易感的真核細胞，待產生細胞病變后收毒。外源基因一般通過基因工程技術導入到含有皰疹病毒基因片段的Fosmid質粒中，通過各片段之間的重組從而將外源基因導入到病毒基因組中。

李奇蒙等[22]利用Gateway LR克隆技術將含有IBDVVP2基因的重組轉移質粒pENTR-VP2與構建的重組黏粒f5354ccdBK+共同參與基因片段互換反應，構建重組黏粒f5354-VP2，將該重組黏粒與其他4個相互重疊覆蓋HVT全基因組的黏粒經酶切線性化后共同轉染CEF細胞,成功拯救出重組病毒rHVT-VP2。吳紅霞[23]成功構建了中國PRV經典毒株SC株的Fosmid文庫，并利用PRV SC株的Fosmid文庫成功拯救出重組病毒，同時結合Red/ET所介導的同源重組技術，構建了在PRV SC的UL36基因N-端插入EGFP報告基因的重組病毒rPRVSC-UL6-EGFP。Abid等[24]利用實驗室已建立的PRV Fosmid文庫平臺，構建了gE/gI/TK基因缺失且共表達豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因和PCV2 Cap蛋白的重組PRV。

基于病毒基因組Fosmid文庫插入的外源基因片段較小，但Fosmid文庫具有穩(wěn)定性好、沒有偏向性、構建周期短及操作簡便等優(yōu)點，為快速構建突變病毒提供了良好的平臺。

1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術是基于核酸內切酶Cas9蛋白識別導向性RNA(gRNA)從而對基因組的特定位點進行精確切割，誘發(fā)DNA損傷修復機制，細胞隨之利用非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)方式對切割位點進行修復，實現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯。與之前的ZFNs和TALENs基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需sgRNA便可對特定位點進行修飾，可極大地降低成本、縮短時間[25]，同時也可與其他基因敲除技術結合使用，如λ-Red同源重組技術[26]等。在實際操作中，首先需針對特定位點設計出sgRNA，將其退火成雙鏈后與含有Cas9蛋白基因的載體通過酶切連接構成CRISPR/Cas9復合體，將其與含有外源基因的轉移質粒及病毒基因組共轉染真核細胞，Cas9蛋白通過識別與sgRNA互補結合的DNA鏈進行切割形成DNA雙鏈斷裂，細胞隨之對斷裂處進行修復，從而進行特定位點的缺失或替換。

經試驗證實，切割部位依照同源重組的方式進行修復的概率不足10%，因此，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與同源重組結合起來，使用轉移質粒將同源序列轉入到細胞中，在提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)精確修復率的同時又能改善同源重組技術效率低等問題。張華偉等[15]采用CRISPR/Cas9介導的同源重組技術對分離到的PRV HB2017株進行基因編輯，并利用蝕斑純化等方法成功獲取基因缺失株。白銀榮[27]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立了HVT的載體平臺，并拯救獲得在US2或US10基因內表達外源基因的重組HVT。 Chang等[28]首先針對HVT的UL45-46基因間區(qū)域合成了sgRNA，將其克隆到質粒pX459-v2中，并利用基因特異性引物擴增H7N9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) HA或EGFP的完整編碼區(qū)，分別將其克隆到供體質粒pHVT-UL45-46中，將pX459-v2與供體質粒共轉染CEF細胞，在感染后72 h收集轉染產物并進行噬斑純化，最終成功構建出表達H7N9亞型AIV HA蛋白的重組毒株HVT-H7N9 HA。

以上常用來構建重組皰疹病毒的各個方法的優(yōu)缺點見表1。

表1 重組皰疹病毒構建方法的優(yōu)缺點

2 外源基因的表達方式及插入位點的篩選

在對重組病毒活載體疫苗進行效能評價時，外源基因的表達效果是重要的評價指標。外源基因的起始轉錄是基因表達的關鍵步驟，轉錄起始的速率是基因表達的限速步驟，選擇可調控的啟動子和相關調控序列是構建一個良好表達系統(tǒng)的前提。外源基因的表達調控結構包含啟動子、增強子、Kozac序列和終止密碼子等。同其他DNA病毒一樣,皰疹病毒表達量的高低主要取決于上游啟動子的強弱，一般選用強啟動子[29]。同時外源基因的高效表達還與細胞內基因的拷貝數(shù)密切相關，隨著拷貝數(shù)的增加，蛋白的表達量也會逐步升高[1]。改變宿主細胞的特性如延長細胞周期、提高細胞內蛋白糖基化水平等也可促進外源蛋白的表達。

構建重組PRV所選用的主要是gG和gE啟動子，其結構獨特且活性較強，還有gD和CMV等啟動子，一般是啟動子序列距外源基因起始密碼子越近表達效果越好[30]。不同啟動子對外源基因表達的影響不同，陳柳等[18]為了探討不同啟動子對鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)E基因C-端截短形式E451-dk(Es)在DEV載體中表達的影響，選取pCAG、pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)這5種啟動子通過常規(guī)基因克隆的方法替換pCMV啟動子，經生物學特性分析得出啟動子pRSV活性最強，Es在pRSV的調控下表達量最高。

為驗證外源基因是否成功表達，需將體外試驗與體內試驗相結合。Abid等[24]首先利用Fosmid文庫平臺構建了共表達CSFV E2蛋白和PCV2 Cap蛋白的gE/gI/TK三基因缺失重組PRV，其遺傳穩(wěn)定及生長特性與親本株無差別，通過家兔和豬的免疫評價結果表明，該重組株對家兔和豬是安全的，且從免疫后家兔和豬的血清中均能檢測出抗PRV的抗體，但未能檢測到抗CSFV和PCV2的抗體，推測是由于插入外源基因的位置不合適，或E2和Cap蛋白的表達量太低不足以誘導抗體產生。

一直以來，研究者們在選擇外源基因的插入位點時，首先考慮病毒的復制非必需區(qū)域，雖然皰疹病毒的基因組序列含有大量的復制非必需區(qū)，但這些區(qū)域與病毒的毒力、病毒的免疫逃避機制或是宿主范圍關系等基礎理論還有待進一步研究，同時外源基因在載體上的表達既受到表達載體啟動子的影響，又受到外源基因在插入過程中所引起的插入位點效應的影響。皰疹病毒載體的常用插入位點及相關重組信息見表2。

表2 皰疹病毒載體的常用插入位點及相關重組信息

續(xù)表

3 重組皰疹病毒活載體疫苗研究進展

3.1 以HVT為載體構建的重組病毒活疫苗

3.2 以PRV為載體構建的重組病毒活疫苗

近年來，隨著對PRV分子生物學研究的深入，其作為重組病毒表達載體的類型越來越豐富，單毒力基因缺失及多毒力基因共缺失株的構建為疫苗株的安全性提供了保障，并通過多種成熟的重組技術，實現(xiàn)了將多種豬的重大疫病病毒抗原基因作為外源基因成功插入到PRV的非必需區(qū)。Feng等[56]利用同源重組技術將非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的CD2V基因插入到TK、gE、gI基因缺失的PRV基因組中，獲得重組毒株PRV-ΔgE/ΔgI/ΔTK-(CD2V)。經試驗證明了其遺傳穩(wěn)定性、毒力、免疫原性和保護能力，為非洲豬瘟疫苗的有效研發(fā)奠定了基礎；毛汐語等[38]利用同源重組技術構建共表達豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白和豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV)VP7蛋白的偽狂犬三聯(lián)基因工程疫苗株，結果顯示該重組株外源基因穩(wěn)定存在，毒力基因穩(wěn)定缺失，增殖特性差異不大，為PRV、PEDV和PoRV基因工程三聯(lián)苗研究奠定了基礎。

目前，PCV2的Cap蛋白基因作為外源基因插入到PRV基因組的PK-gG基因之間[37]、UL22-UL24基因之間[31]、US3-US6基因之間[39]等，經PCR鑒定及間接免疫熒光試驗(IFA)等驗證了重組病毒的成功構建，但重組病毒的免疫原性卻參差不齊，這可能與表達盒的啟動子及插入位點有關；同樣成功插入到PRV基因組中的還有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HPPRRSV)GP5基因[40]、CSFVE2基因[41]、豬細小病毒(Procine parvovirus，PPV)VP2基因[57]等，構建出的重組病毒經一系列生物學特性分析證明了其穩(wěn)定性、有效性與安全性，為相應基因工程疫苗的研發(fā)奠定了堅實的基礎。

3.3 以DEV為載體構建的重組病毒活疫苗

隨著對DEV基因結構與功能認識的不斷深入，大量的毒力基因、保護性抗原基因和復制非必需基因已得到分析鑒定,常被用作水生家禽疫苗研制中的病毒載體。

Niu等[58]通過構建DEV C-KCE疫苗株的Fosmid文庫，在病毒感染性克隆的基礎上，將鴨甲型1型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV-1)的VP0基因插入疫苗株DEV C-KCE基因組的UL41區(qū)，構建了重組病毒rDEV-UL41VP0。分析得知VP0基因在被感染的細胞中穩(wěn)定表達，且不影響DEV C-KCE在細胞中的復制。重組病毒對DEV致死株CSC的攻毒保護率達100%，對DHAV-1 161/79提供70%的保護；王波等[43]同樣通過構建DEV的Fosmid文庫，將H5亞型AIV 2.3.2.1d分支代表病毒CK/LN/SD007株的HA基因插入DEV基因組中，構建了重組病毒rDEV H5-12，經試驗證明了其良好的穩(wěn)定性、生長特性及免疫原性；陳柳等[44]在DEV疫苗株細菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎上，利用Red/ET兩步重組法將密碼子優(yōu)化的小鵝瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)的VP2基因框插入到DEV的US7和US8基因之間，獲得了重組病毒rDEV-VP2和刪除Bac質粒序列的rDEV-VP2-Cre。對重組病毒進行體內外一系列生物學特性分析得出重組毒株生長特性與親本株基本一致，且能誘導鴨產生GPV VP2的特異性抗體；Ding等[45]構建了2株分別表達NDV F蛋白(rDEV-F)和HN蛋白(rDEV-HN)的重組DEV，經評估得出這2株重組DEV在SPF雞中的保護功效不同，經rDEV-F免疫后的雞能對致死性NDV產生100%的抵抗力，而rDEV-HN沒有誘導有效的保護。

3.4 以ILTV為載體構建的重組病毒活疫苗

ILTV與其他皰疹病毒相比，在基因組結構、宿主范圍及侵入途徑等方面存在特異性，目前對于ILTV的研究熱點著重于毒株的分離與鑒定，以及將ILTV的有效免疫蛋白VP2基因作為外源基因插入到合適的病毒載體中，如雞痘病毒、桿狀病毒、腺病毒及NDV等。

以ILTV為載體構建重組病毒時，可根據(jù)基因同源關系的差異，選擇與ILTV差異大且抗原性強的病毒基因。Shao等[51]經同源重組技術將NDV F蛋白基因插入到US9基因缺失的ILTV基因組中，得到重組毒ILTV-ΔUS9-F。并經試驗證明ILTV-ΔUS9-F的生長特性與親本病毒相似，且F基因能穩(wěn)定存在于ILTV-ΔUS9-F的基因組中并穩(wěn)定表達。動物感染試驗結果顯示，ILTV-ΔUS9-F對SPF雞無致病性，且單次免疫后即可對ILTV強毒株和中國流行的基因Ⅶ型及經典基因Ⅸ型NDV強毒株的攻擊提供有效的保護，且與現(xiàn)在廣泛應用的NDV商品化活疫苗相比，ILTV-ΔUS9-F能更好地抑制基因Ⅶ型NDV感染后的復制和排毒。

4 重組活載體疫苗的應用

隨著基因工程技術的愈發(fā)成熟，重組病毒構建研究越來越多，大量重組病毒構建工作經驗逐漸累積，相關生物制品成功研制并且應用。筆者統(tǒng)計了部分已注冊的重組皰疹病毒活載體疫苗的相關生物制品(表3)，包括HVT、DEV、PRV、ILTV的相關活疫苗、滅活疫苗等，以及部分具有專利權保護的重組皰疹病毒(表4)，包括以HVT、DEV、PRV、ILTV為載體構建的相關重組病毒等。

表3 部分已注冊的重組皰疹病毒活載體疫苗的相關生物制品

表4 具有專利權保護的部分重組皰疹病毒

續(xù)表

5 小結和展望

基因工程活載體疫苗作為一類新型疫苗，有效地規(guī)避了傳統(tǒng)疫苗的缺陷，簡化了養(yǎng)殖產業(yè)中的免疫程序，提高了疫病防控工作效率。隨著研究的深入，研究者們在廣泛應用同源重組技術的同時，BAC技術、Fosmid文庫和CRISPR/Cas9技術等也被應用于重組病毒的構建，大大提高了重組病毒活載體疫苗的研發(fā)效率。除了皰疹病毒，同樣經常被用作重組病毒活載體的病毒還有痘病毒、腺病毒及NDV等,這更加凸顯了重組病毒活載體疫苗在研制效率及免疫效果方面的強大優(yōu)勢。

但隨著重組活載體疫苗的大量研發(fā)，某些問題也逐漸被重視，免疫原基因的選擇及如何保證重組病毒的遺傳穩(wěn)定性和安全性也需著重研究。在進行免疫原基因的選擇時，不能單一地只考慮其免疫原性，其表達效率及對動物的安全性同樣應作為選擇依據(jù)。目前，重組病毒的遺傳穩(wěn)定性一般是通過細胞傳代試驗結合實驗室鑒定及基因組測序分析得到，這種傳統(tǒng)方法準確率高但耗時長，因此，亟需一種新的方法來快速衡量重組病毒的穩(wěn)定性。而重組病毒安全性一般是經臨床動物試驗進行測定，通過實時記錄靶動物接種合適劑量的病毒之后的各項生命體征指標來間接反映重組病毒的安全性，雖然在當前重組動物皰疹病毒活載體疫苗的研發(fā)過程中，作為病毒載體的皰疹病毒往往缺失了主要毒力基因，對動物體的致病力大大減弱，但其安全性還需進行長期且全面深入的分析。

皰疹病毒龐大的基因組中廣泛存在的復制非必需區(qū)為重組位點的優(yōu)化研究提供了基礎，選擇更優(yōu)的外源基因插入位點，更安全高效的表達元件，特別是高效啟動子是重組活載體疫苗推廣應用的基礎。重組皰疹病毒活載體疫苗優(yōu)勢得到充分的研究與利用后，將會在未來的動物疫病防控中發(fā)揮重要作用。